造血因子对骨髓增生异常综合征患者c-kit受体的调控作用
作者：张泓 邵宗鸿 陈桂彬 李克 张益枝 刘鸿 李莉 孙娟 贾海蓉
单位：300020 天津，中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院
关键词：
中华血液学杂志000714 c-kit原癌基因是干细胞生长因子(SCF)的受体基因，c-kit受体(CD117)与其配体结合对造血干/祖细胞起支持作用，并发挥调节造血的作用[1]。国外报道，正常骨髓单个核细胞c-kit受体表达率为(4.0±1.8)%[2]。我们曾报道正常骨髓单个核细胞CD117表达率为(3.04±1.49)%，并发现骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓单个核细胞c-kit受体表达异常[3]，这一异常是否与造血因子调控有关目前尚无报道。我们研究了SCF、白细胞介素3(IL-3)及红细胞生成素(Epo)对MDS患者骨髓单个核细胞c-kit受体表达的调节作用，结果报道如下。
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病例和方法
1 病例 MDS患者10例，男性7例，女性3例，中位年龄41岁(27～63岁)。按FAB诊断及分型标准，RA 2例，RAEB 3例，RAEB-t 3例，MDS转变成急性白血病患者2例，均来自1997年3月～1999年3月我院新收治病例，常规法取髂骨骨髓7～10ml。正常对照5名，骨髓取自胸外科肋骨标本。
2 试剂及细胞系 单克隆抗体CD117及阴性对照均购自Pharmacia公司，细胞培养相关试剂均购自Sigma公司， SCF、重组IL-3(rIL-3)、重组Epo(rEpo)均由日本麒麟公司提供，细胞总RNA提取试剂盒和逆转录酶购自Gibco公司，引物及相关试剂均在上海生物试剂公司合成和购买。HEL细胞系由本所重点实验室提供。
3 液体培养 培养体系含体积分数为30%的小牛血清(FCS)，100g/L牛血清白蛋白(BSA)，伊思考夫改良杜尔贝可培养基(IMDM)，SCF 100ng/ml，IL-3 4U/ml，Epo 4U/ml，细胞浓度为2×106/ml，于37℃、体积分数为5%的CO2、95%湿度条件下培养。在培养前及培养后第1，2，4，8，12，24h取1×106细胞3份，分别用于提取RNA和标记CD117。根据CD117表达率、mRNA半定量结果选取作用明显时间。
, 百拇医药
4 免疫荧光测定CD117 用淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞，取2×106细胞，分别加入CD117单克隆抗体10μl，PE标记IgG作阴性对照，室温放置20min，用PBS洗涤2次，流式细胞仪测定骨髓单个核细胞的CD117表达率。
5 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定c-kit mRNA的表达 按试剂盒说明操作提取1×106细胞总RNA，然后逆转录成cDNA并进行PCR扩增。c-kit上游引物为5′-GGGATTTTCTCTGCGTTCTGCT-3′，下游引物为5′-GTAGGCGCGT-TTCACACTTTTG-3′，扩增产物的长度为495bp。扩增条件：94℃ 30s，62℃ 1min，72℃ 1min，扩增35个循环。内对照GAPDH的扩增条件为：94℃ 30s，62℃ 1min，72℃ 1min，扩增30个循环。取12μl 扩增产物于15g/L的琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色，于300nm紫外光下摄影，并用光密度扫描仪定量分析。
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6 统计学处理 数据以均值±标准差(
±s)表示，组间比较采用t检验。
结果
1 造血因子对HEL细胞CD117的作用明显时间 结果显示造血因子(SCF+IL-3+Epo及IL-3+Epo)作用前CD117表达率为21.5%，作用1h后开始下降，至12h达最低(2.0%)，而后开始上升，24h CD117表达率已是加造血因子前的3倍(63.9%)。
2 造血因子对HEL细胞c-kit基因的调节作用 造血因子作用1h后c-kit mRNA表达量并无明显变化，12h后c-kit mRNA表达量开始升高，24h后c-kit mRNA表达量是加造血因子前的3倍。
, 百拇医药 3 造血因子对MDS患者骨髓造血细胞c-kit受体的调节作用 MDS患者及正常对照骨髓细胞CD117表达率，在加造血因子前后差异均有显著性(P<0.05)，加入造血因子两组之间CD117表达率差异无显著性(P>0.05)；正常骨髓与MDS患者骨髓细胞对造血因子的反应程度之间差异有显著性(P<0.05)(表1)。
表1 造血因子作用MDS患者骨髓细胞c-kit受体的
表达率(%，±s) 组别
例数
空白组
造血因子
IL-3+Epo
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IL-3+Epo+SCF
MDS组
10
5.86±3.15
17.83±5.79
19.24±6.97
正常对照
5
2.85±2.16
17.09±8.54
19.18±9.95
2 造血因子对MDS患者骨髓造血细胞c-kit mRNA的调节作用 加入造血因子前后MDS患者及正常骨髓细胞c-kit mRNA表达量均差异有显著性(P值均<0.05)，加入造血因子两组之间c-kit mRNA表达量差异无显著性(P>0.05)；正常骨髓与MDS患者骨髓细胞对造血因子的反应程度之间差异显著(P<0.05)(表2)。表2 造血因子作用下MDS患者骨髓造血细胞
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c-kit mRNA的表达(±s) 组 别
例数
空白组
造血因子
IL-3+Epo
IL-3+Epo+SCF
MDS组
10
1.203±0.117
2.403±1.115
2.591±1.341
, 百拇医药
正常对照组
5
0.380±0.193
1.397±0.939
1.521±1.218
讨论 造血多能干细胞的c-kit受体受多种方式调节。SCF与其受体结合后形成SCF-c-kit复合物发生内吞，同时在蛋白酶作用下降解[4，5]。用氯喹处理细胞可以部分阻止c-kit受体降解，表明溶酶体蛋白水解酶参与了这一过程。转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-4可以通过转录及转录后机制下调细胞表面c-kit受体的分布。另外，蛋白激酶C的激活物可以将c-kit从跨膜区裂解开，并使其从细胞表面脱落[6]。为了明确造血因子对c-kit基因是否有调节作用，我们将正常骨髓及MDS患者骨髓单个核细胞置于含造血因子的培养基中培养，观察造血因子对其作用。实验结果表明，SCF+IL-3+Epo或IL-3+Epo对正常骨髓细胞的c-kit基因有明显的上调作用，对MDS患者骨髓细胞c-kit基因上调作用明显弱于正常骨髓，这进一步表明MDS患者c-kit受体基因有异常，MDS是一种造血干/祖细胞异常的疾病。
, 百拇医药
基金项目：卫生部临床重点学科基金资助项目(0007)
参 考 文 献
1，Virginia CB. Stem cell factor and hematopoiesis. Blood, 1997, 15:1345-1364.
2，Ashman LK, Cambareri AC, To LB. Expression of the YB5.B8 antigen (c-kit proto-oncogene product) in normal human bone marrow. Blood, 1991, 78: 30-37.
3，张泓,邵宗鸿,陈桂彬，等. 骨髓增生异常综合征骨髓单个核细胞c-kit受体表达及功能的研究.中华血液学杂志，2000，21：176-178.
, 百拇医药
4，Miyazawa K,Toyama K, Gotoh A, et al. Ligand-dependent polyubiquetination of c-kit gene product: a possible mechanism of receptor down modulation in M07e cells. Blood, 1994, 83:137-145.
5，Yee NS, Hsiau CWM, Serve H, et al. Mechanism of down-regulation of c-kit receptor. J Biol Chem, 1994, 269:31991-31998.
6，Dubois CM, Ruscetti FW, Stankova J, et al. Transforming growth factor-β regulates c-kit message stability and cell surface protein expression in hematopoietic progenitors. Blood, 1994,83: 3138-3145.
(收稿日期：1999-11-02), 百拇医药
单位：300020 天津，中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院
关键词：
中华血液学杂志000714 c-kit原癌基因是干细胞生长因子(SCF)的受体基因，c-kit受体(CD117)与其配体结合对造血干/祖细胞起支持作用，并发挥调节造血的作用[1]。国外报道，正常骨髓单个核细胞c-kit受体表达率为(4.0±1.8)%[2]。我们曾报道正常骨髓单个核细胞CD117表达率为(3.04±1.49)%，并发现骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓单个核细胞c-kit受体表达异常[3]，这一异常是否与造血因子调控有关目前尚无报道。我们研究了SCF、白细胞介素3(IL-3)及红细胞生成素(Epo)对MDS患者骨髓单个核细胞c-kit受体表达的调节作用，结果报道如下。
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病例和方法
1 病例 MDS患者10例，男性7例，女性3例，中位年龄41岁(27～63岁)。按FAB诊断及分型标准，RA 2例，RAEB 3例，RAEB-t 3例，MDS转变成急性白血病患者2例，均来自1997年3月～1999年3月我院新收治病例，常规法取髂骨骨髓7～10ml。正常对照5名，骨髓取自胸外科肋骨标本。
2 试剂及细胞系 单克隆抗体CD117及阴性对照均购自Pharmacia公司，细胞培养相关试剂均购自Sigma公司， SCF、重组IL-3(rIL-3)、重组Epo(rEpo)均由日本麒麟公司提供，细胞总RNA提取试剂盒和逆转录酶购自Gibco公司，引物及相关试剂均在上海生物试剂公司合成和购买。HEL细胞系由本所重点实验室提供。
3 液体培养 培养体系含体积分数为30%的小牛血清(FCS)，100g/L牛血清白蛋白(BSA)，伊思考夫改良杜尔贝可培养基(IMDM)，SCF 100ng/ml，IL-3 4U/ml，Epo 4U/ml，细胞浓度为2×106/ml，于37℃、体积分数为5%的CO2、95%湿度条件下培养。在培养前及培养后第1，2，4，8，12，24h取1×106细胞3份，分别用于提取RNA和标记CD117。根据CD117表达率、mRNA半定量结果选取作用明显时间。
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4 免疫荧光测定CD117 用淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞，取2×106细胞，分别加入CD117单克隆抗体10μl，PE标记IgG作阴性对照，室温放置20min，用PBS洗涤2次，流式细胞仪测定骨髓单个核细胞的CD117表达率。
5 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定c-kit mRNA的表达 按试剂盒说明操作提取1×106细胞总RNA，然后逆转录成cDNA并进行PCR扩增。c-kit上游引物为5′-GGGATTTTCTCTGCGTTCTGCT-3′，下游引物为5′-GTAGGCGCGT-TTCACACTTTTG-3′，扩增产物的长度为495bp。扩增条件：94℃ 30s，62℃ 1min，72℃ 1min，扩增35个循环。内对照GAPDH的扩增条件为：94℃ 30s，62℃ 1min，72℃ 1min，扩增30个循环。取12μl 扩增产物于15g/L的琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色，于300nm紫外光下摄影，并用光密度扫描仪定量分析。
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6 统计学处理 数据以均值±标准差(
±s)表示，组间比较采用t检验。结果
1 造血因子对HEL细胞CD117的作用明显时间 结果显示造血因子(SCF+IL-3+Epo及IL-3+Epo)作用前CD117表达率为21.5%，作用1h后开始下降，至12h达最低(2.0%)，而后开始上升，24h CD117表达率已是加造血因子前的3倍(63.9%)。
2 造血因子对HEL细胞c-kit基因的调节作用 造血因子作用1h后c-kit mRNA表达量并无明显变化，12h后c-kit mRNA表达量开始升高，24h后c-kit mRNA表达量是加造血因子前的3倍。
, 百拇医药 3 造血因子对MDS患者骨髓造血细胞c-kit受体的调节作用 MDS患者及正常对照骨髓细胞CD117表达率，在加造血因子前后差异均有显著性(P<0.05)，加入造血因子两组之间CD117表达率差异无显著性(P>0.05)；正常骨髓与MDS患者骨髓细胞对造血因子的反应程度之间差异有显著性(P<0.05)(表1)。
表1 造血因子作用MDS患者骨髓细胞c-kit受体的
表达率(%，
±s) 组别例数
空白组
造血因子
IL-3+Epo
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IL-3+Epo+SCF
MDS组
10
5.86±3.15
17.83±5.79
19.24±6.97
正常对照
5
2.85±2.16
17.09±8.54
19.18±9.95
2 造血因子对MDS患者骨髓造血细胞c-kit mRNA的调节作用 加入造血因子前后MDS患者及正常骨髓细胞c-kit mRNA表达量均差异有显著性(P值均<0.05)，加入造血因子两组之间c-kit mRNA表达量差异无显著性(P>0.05)；正常骨髓与MDS患者骨髓细胞对造血因子的反应程度之间差异显著(P<0.05)(表2)。表2 造血因子作用下MDS患者骨髓造血细胞
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c-kit mRNA的表达(
±s) 组 别例数
空白组
造血因子
IL-3+Epo
IL-3+Epo+SCF
MDS组
10
1.203±0.117
2.403±1.115
2.591±1.341
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正常对照组
5
0.380±0.193
1.397±0.939
1.521±1.218
讨论 造血多能干细胞的c-kit受体受多种方式调节。SCF与其受体结合后形成SCF-c-kit复合物发生内吞，同时在蛋白酶作用下降解[4，5]。用氯喹处理细胞可以部分阻止c-kit受体降解，表明溶酶体蛋白水解酶参与了这一过程。转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-4可以通过转录及转录后机制下调细胞表面c-kit受体的分布。另外，蛋白激酶C的激活物可以将c-kit从跨膜区裂解开，并使其从细胞表面脱落[6]。为了明确造血因子对c-kit基因是否有调节作用，我们将正常骨髓及MDS患者骨髓单个核细胞置于含造血因子的培养基中培养，观察造血因子对其作用。实验结果表明，SCF+IL-3+Epo或IL-3+Epo对正常骨髓细胞的c-kit基因有明显的上调作用，对MDS患者骨髓细胞c-kit基因上调作用明显弱于正常骨髓，这进一步表明MDS患者c-kit受体基因有异常，MDS是一种造血干/祖细胞异常的疾病。
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基金项目：卫生部临床重点学科基金资助项目(0007)
参 考 文 献
1，Virginia CB. Stem cell factor and hematopoiesis. Blood, 1997, 15:1345-1364.
2，Ashman LK, Cambareri AC, To LB. Expression of the YB5.B8 antigen (c-kit proto-oncogene product) in normal human bone marrow. Blood, 1991, 78: 30-37.
3，张泓,邵宗鸿,陈桂彬，等. 骨髓增生异常综合征骨髓单个核细胞c-kit受体表达及功能的研究.中华血液学杂志，2000，21：176-178.
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4，Miyazawa K,Toyama K, Gotoh A, et al. Ligand-dependent polyubiquetination of c-kit gene product: a possible mechanism of receptor down modulation in M07e cells. Blood, 1994, 83:137-145.
5，Yee NS, Hsiau CWM, Serve H, et al. Mechanism of down-regulation of c-kit receptor. J Biol Chem, 1994, 269:31991-31998.
6，Dubois CM, Ruscetti FW, Stankova J, et al. Transforming growth factor-β regulates c-kit message stability and cell surface protein expression in hematopoietic progenitors. Blood, 1994,83: 3138-3145.
(收稿日期：1999-11-02), 百拇医药