急性髓系白血病免疫球蛋白重链基因和T细胞受体γ基因重排的临床意义
作者：傅卫军 侯健 丁思奇 王东星 陈玉宝 陈秋生
单位：200003 上海，第二军医大学附属长征医院血液科
关键词：
中华血液学杂志000711 免疫球蛋白重链基因(IgH)和T细胞受体(TCR)基因重排通常被认为是B和T淋巴细胞的克隆性标记。但近年来的研究表明，急性髓系白血病(AML)细胞亦可出现IgH和(或)TCR基因的克隆性重排，即序列失真现象。为此我们用聚合酶链反应(PCR)的方法研究了67例AML初治患者IgH和TCRγ基因重排，并初步探讨其临床意义。
对象和方法
1 研究对象 1990～1996年我科初治AML 67例，男42例，女25例，年龄16～70岁。所有病例均按FAB标准诊断，其中M2 4例，M3 11例，M4 24例，M5 26例，M6 2例。初治时均以DA(H)方案化疗。
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2 DNA提取 用无菌手术刀片刮取骨髓涂片上的标本，置0.5ml Eppendorf管中，加0.5ml DNAZOL(Gibco公司)，内含蛋白酶K 20mg/ml。于37℃过夜后，混匀，其余步骤按DNAZOL产品说明书操作，DNA溶于30μl无菌双蒸水中。
3 PCR IgH引物：VH 5′-GACACGGCCGTGTATTACTGTG-3′，JH 5′-TGAGGAGACGGTGACC-3′。TCRγ引物：V1-8 5′-TCTTCCAACTTGGAAGGGAGA-3′；Jγ1/2 5′-CCCTCTATTACCTTGGAAA-TG-3′。均由上海生物化学研究所合成。50μl PCR反应体系含10×PCR缓冲液5μl，2mmol/L dNTP 5μl, 引物各25pmol, Taq酶1U,DNA模板10μl，加灭菌水至50μl。于PCR扩增仪上按以下条件扩增：94℃变性2min，93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，最后一个循环72℃延伸10min，扩增30个循环。
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4 PCR产物鉴定 取10μl扩增产物于20g/L琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后紫外灯下观察。IgH及TCRγ基因重排带分别为110bp、400bp左右。
5 统计学分析 组间比较采用卡方检验。
结果
1 在67例AML初治患者中，有IgH基因克隆重排者11例(16.42%)，TCRγ基因重排者5例(7.46%)。所有病例初治时总体完全缓解(CR)率为77.61%，2年存活率为58.21%。11例IgH基因克隆重排者初治CR率为45.45%，2年存活率为27.27%，初治获CR的5例患者中，2年内复发的2例患
者，在CR期及复发期均检测到IgH基因的克隆重排，3例持续缓解者有1例IgH基因重排阳性；IgH基因重排阴性者初治CR率及2年存活率分别为83.93%(56例中47例)、64.29%(56例中36例)。5例TCRγ基因克隆重排者，初治时2例获CR，其中1例于8个月时复发，1例持续CR已4年，此2例TCRγ基因克隆重排持续存在。
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2 11例IgH基因克隆重排者中M2 1例，M3 3例，M4 4例，M5 3例；5例TCRγ基因克隆重排者，M3 1例，M4 2例，M5 2例。
3 67例患者中，14例曾进行免疫表型分析，其中IgH重排者2例，未见有B细胞相关抗原表达；1例TCRγ基因克隆重排者，其白血病细胞除表达髓系抗原外尚表达CD7(82%)。
讨论
我们的研究结果表明，AML确实存在IgH及TCRγ基因克隆重排。IgH基因重排率与国外资料(8.6%～40%)[1，2]相仿。TCRγ基因重排率低于国外同类报道(最高达41.18%)[3]，这可能与TCRγ扩增片段较长，标本存放时间过长，DNA部分降解有关。
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本组患者，初治时采用相同的化疗方案(DA或DAH)，发生IgH基因重排组的初治CR率及2年存活率均显著低于IgH基因重排阴性者(P<0.01)，说明IgH基因克隆重排可能是AML的不良预后因素之一。这与Kyoda等[2]的结果一致。TCRγ基因克隆重排在AML中的意义报道不多，我们的资料显示5例TCRγ基因重排者，初治时2例获CR，1例于8个月时复发，1例在初治、缓解期均出现长短一致的TCRγ基因克隆重排带，持续CR亦已超过4年，TCRγ基因重排与预后的关系尚需进一步积累资料，加强观察。已有报道认为AML患者外周血有克隆性T淋巴细胞存在[4]。
有资料显示IgH及TCR基因克隆重排在M4型或M5型AML中很少发生[5]，但亦有报道表明IgH及TCR基因克隆重排与FAB分型无关，我们倾向于后一种观点。另有认为在AML中，IgH、TCR基因重排分别与TdT酶、CD19、CD34及T细胞相关抗原表达之间有显著的相关性[6]，因病例数少，我们尚无法得出结论。
, 百拇医药
产生IgH及TCR基因重排的序列失真现象的机制可能与多能干细胞有关，认为交叉重排的细胞起源于多能干细胞，它可同时表达几种序列的标志，随着细胞的定向分化，这种重排仍然存在。
参 考 文 献
1，Leone R,lo Coco F,de Rossi G,et al. Immunoglobulin heavy chain gene and TCR beta chain rearrangements in acute nonlymphoid leukemia. Haematologica,1990,75:125-128.
2，Kyoda K,Nakamura S,Matamo S,et al. Prognostic significance of immunoglobulin heavy chain gene rearrangement in patients with acute myelogenous leukemia. Leukemia, 1997, 11: 803-806.
, 百拇医药
3，Boehm TL,Werle A,Drahovsky D. Immunoglobulin heavy chain gene and TCR gamma and beta rearrangements in acute myeloid leukemia.Mol Biol Med,1987,4:51-62.
4，李扬秋，汪明春，Siegrt W,et al.利用基因扫描分析TCR Vβ亚家族CDR3长度方法检测AML的T细胞克隆性.肿瘤，1997，17：435-438.
5，Ackland SP, Westbrook CA, Diaz MO,et al. Evidence favoring lineage fidelity in acute nonlymphocytic leukemia: absence of immunoglobulin gene rearrangements in FAB types M4 and M5.Blood,1987,69:87-91.
6，Schmidt CA,Przybylski G,Seeger K,et al. TCR delta gene rearrangement in acute myeloid leukemia with T-lymphoid antigen expression.Leuk Lymphoma,1995,20:45-49.
(收稿日期：1999-04-05), 百拇医药
单位：200003 上海，第二军医大学附属长征医院血液科
关键词：
中华血液学杂志000711 免疫球蛋白重链基因(IgH)和T细胞受体(TCR)基因重排通常被认为是B和T淋巴细胞的克隆性标记。但近年来的研究表明，急性髓系白血病(AML)细胞亦可出现IgH和(或)TCR基因的克隆性重排，即序列失真现象。为此我们用聚合酶链反应(PCR)的方法研究了67例AML初治患者IgH和TCRγ基因重排，并初步探讨其临床意义。
对象和方法
1 研究对象 1990～1996年我科初治AML 67例，男42例，女25例，年龄16～70岁。所有病例均按FAB标准诊断，其中M2 4例，M3 11例，M4 24例，M5 26例，M6 2例。初治时均以DA(H)方案化疗。
, http://www.100md.com
2 DNA提取 用无菌手术刀片刮取骨髓涂片上的标本，置0.5ml Eppendorf管中，加0.5ml DNAZOL(Gibco公司)，内含蛋白酶K 20mg/ml。于37℃过夜后，混匀，其余步骤按DNAZOL产品说明书操作，DNA溶于30μl无菌双蒸水中。
3 PCR IgH引物：VH 5′-GACACGGCCGTGTATTACTGTG-3′，JH 5′-TGAGGAGACGGTGACC-3′。TCRγ引物：V1-8 5′-TCTTCCAACTTGGAAGGGAGA-3′；Jγ1/2 5′-CCCTCTATTACCTTGGAAA-TG-3′。均由上海生物化学研究所合成。50μl PCR反应体系含10×PCR缓冲液5μl，2mmol/L dNTP 5μl, 引物各25pmol, Taq酶1U,DNA模板10μl，加灭菌水至50μl。于PCR扩增仪上按以下条件扩增：94℃变性2min，93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，最后一个循环72℃延伸10min，扩增30个循环。
, 百拇医药
4 PCR产物鉴定 取10μl扩增产物于20g/L琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后紫外灯下观察。IgH及TCRγ基因重排带分别为110bp、400bp左右。
5 统计学分析 组间比较采用卡方检验。
结果
1 在67例AML初治患者中，有IgH基因克隆重排者11例(16.42%)，TCRγ基因重排者5例(7.46%)。所有病例初治时总体完全缓解(CR)率为77.61%，2年存活率为58.21%。11例IgH基因克隆重排者初治CR率为45.45%，2年存活率为27.27%，初治获CR的5例患者中，2年内复发的2例患
者，在CR期及复发期均检测到IgH基因的克隆重排，3例持续缓解者有1例IgH基因重排阳性；IgH基因重排阴性者初治CR率及2年存活率分别为83.93%(56例中47例)、64.29%(56例中36例)。5例TCRγ基因克隆重排者，初治时2例获CR，其中1例于8个月时复发，1例持续CR已4年，此2例TCRγ基因克隆重排持续存在。
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2 11例IgH基因克隆重排者中M2 1例，M3 3例，M4 4例，M5 3例；5例TCRγ基因克隆重排者，M3 1例，M4 2例，M5 2例。
3 67例患者中，14例曾进行免疫表型分析，其中IgH重排者2例，未见有B细胞相关抗原表达；1例TCRγ基因克隆重排者，其白血病细胞除表达髓系抗原外尚表达CD7(82%)。
讨论
我们的研究结果表明，AML确实存在IgH及TCRγ基因克隆重排。IgH基因重排率与国外资料(8.6%～40%)[1，2]相仿。TCRγ基因重排率低于国外同类报道(最高达41.18%)[3]，这可能与TCRγ扩增片段较长，标本存放时间过长，DNA部分降解有关。
, 百拇医药
本组患者，初治时采用相同的化疗方案(DA或DAH)，发生IgH基因重排组的初治CR率及2年存活率均显著低于IgH基因重排阴性者(P<0.01)，说明IgH基因克隆重排可能是AML的不良预后因素之一。这与Kyoda等[2]的结果一致。TCRγ基因克隆重排在AML中的意义报道不多，我们的资料显示5例TCRγ基因重排者，初治时2例获CR，1例于8个月时复发，1例在初治、缓解期均出现长短一致的TCRγ基因克隆重排带，持续CR亦已超过4年，TCRγ基因重排与预后的关系尚需进一步积累资料，加强观察。已有报道认为AML患者外周血有克隆性T淋巴细胞存在[4]。
有资料显示IgH及TCR基因克隆重排在M4型或M5型AML中很少发生[5]，但亦有报道表明IgH及TCR基因克隆重排与FAB分型无关，我们倾向于后一种观点。另有认为在AML中，IgH、TCR基因重排分别与TdT酶、CD19、CD34及T细胞相关抗原表达之间有显著的相关性[6]，因病例数少，我们尚无法得出结论。
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产生IgH及TCR基因重排的序列失真现象的机制可能与多能干细胞有关，认为交叉重排的细胞起源于多能干细胞，它可同时表达几种序列的标志，随着细胞的定向分化，这种重排仍然存在。
参 考 文 献
1，Leone R,lo Coco F,de Rossi G,et al. Immunoglobulin heavy chain gene and TCR beta chain rearrangements in acute nonlymphoid leukemia. Haematologica,1990,75:125-128.
2，Kyoda K,Nakamura S,Matamo S,et al. Prognostic significance of immunoglobulin heavy chain gene rearrangement in patients with acute myelogenous leukemia. Leukemia, 1997, 11: 803-806.
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3，Boehm TL,Werle A,Drahovsky D. Immunoglobulin heavy chain gene and TCR gamma and beta rearrangements in acute myeloid leukemia.Mol Biol Med,1987,4:51-62.
4，李扬秋，汪明春，Siegrt W,et al.利用基因扫描分析TCR Vβ亚家族CDR3长度方法检测AML的T细胞克隆性.肿瘤，1997，17：435-438.
5，Ackland SP, Westbrook CA, Diaz MO,et al. Evidence favoring lineage fidelity in acute nonlymphocytic leukemia: absence of immunoglobulin gene rearrangements in FAB types M4 and M5.Blood,1987,69:87-91.
6，Schmidt CA,Przybylski G,Seeger K,et al. TCR delta gene rearrangement in acute myeloid leukemia with T-lymphoid antigen expression.Leuk Lymphoma,1995,20:45-49.
(收稿日期：1999-04-05), 百拇医药