化疗药物体外诱导急性髓系白血病细胞凋亡的临床意义
作者：许小平 史剑慧 程文英 王健民 丁训杰
单位：许小平(200433 上海，第二军医大学长海医院血液科)；史剑慧(上海医科大学放射医学研究所)；程文英(上海医科大学放射医学研究所)；王健民(200433 上海，第二军医大学长海医院血液科)；丁训杰(上海医科大学华山医院血液学研究室)
关键词：
中华血液学杂志000710 我们采用TdT介导的脱氧核苷酸切口和缺口末端标记法(TUNEL)及超微结构观察等方法，对18例初治急性髓系白血病(AML)患者骨髓白血病细胞进行体外化疗药物诱导凋亡与临床疗效关系的初步研究，以探讨体外化疗药物诱导白血病细胞凋亡在临床化疗疗效预测中的实际应用价值。
病例和方法
1 病例和标本 18例初治AML患者来自第二军医大学长海医院血液科和上海医科大学华山医院血液科。其中男8例，女10例；中位年龄46 岁(14～70岁)； M1 1例，M2 9例，M31例，M4 4例，M5 2例，M7 1例。所有患者均经形态学、细胞化学(M7经电镜及单抗)检测确诊。化疗采用HA(高三尖杉酯碱2～4mg/m2、阿糖胞苷100～150mg/m2)、DA(柔红霉素40mg/m2、阿糖胞苷100～150mg/m2)方案。完全缓解(CR)与未缓解(NR)判别按国内现行标准。化疗前抽取新鲜骨髓, 抗凝,用分离液分离单个核细胞备用。
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2 化疗药物体外诱导白血病细胞凋亡 单个核细胞浓度为1×106/ml, 分别孵育于①高三尖杉酯碱(HHT)2mg/L,②柔红霉素(DNR)1.0μmol/L，③阿糖胞苷(Ara-C) 1.0μmol/L，④HHT(2mg/L)+Ara-C (1.0μmol/L)，⑤DNR (1.0μmol/L)+Ara-C (1.0μmol/L)，作用18h。以上药物终浓度的选择参考万景华等[1]的方法及我们的实验结果。
3 白血病细胞bcl-2表达检测 所用单抗bcl-2(124)购自上海华美公司(丹麦DAKO公司产品)。HRP-DAB药盒购自美国Labvision公司。细胞涂片(细胞浓度为2×106/ml)后丙酮固定，过氧化氢作用后微波抗原修复。加bcl-2单抗，37℃湿盒作用30min，加生物素化二抗,室温作用10min，加辣根酶标记链霉亲和素工作液(Streptavidin/HRP)室温作用10min，最后以3,3′-二氨基联苯胺(DAB)染色。计数1000个细胞中的阳性细胞，并计算其阳性率。参照10例良性血液病患者的结果，bcl-2表达>15%为阳性。
, 百拇医药
4 凋亡检测
4.1 Wright-Giemsa染色: 细胞离心涂片染色,光镜下计数具有明显凋亡特征的细胞(细胞缩小, 核染色质凝聚,核碎裂等)。
4.2 TUNEL法检测片段化DNA: 主要步骤为用体积分数为1%的甲醛固定细胞,以Triton X-100穿透细胞,洗涤后滴片, 晾干。用dUTP-荧光素标记试剂盒(购自德国保灵曼公司上海分公司)进行温育反应(每份标本均设立阴性对照, 即不加关键的TdT酶)。然后加抗荧光素-AP, 再加底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(BCIP)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)，将基于荧光素的TUNEL检测转化为显色法。阳性细胞被染成蓝黑色。计数1000个细胞中阳性细胞数，并以骨髓分离后白血病细胞比例作校正。
4.3 透射电镜标本制备: 细胞用PBS洗涤后,用戊二醛和锇酸固定后进行漂洗、脱水、包埋、超薄切片，染色并晾干后以透射电镜观察细胞内超微结构。
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5 统计学分析 实验数据分析采用两样本均数比较的t检验及t′检验。
结果
1 化疗药物体外诱导白血病细胞凋亡 结果见表1。
表1 AML患者化疗前体外化疗药诱导白血病细胞凋亡率(%,
±s) 组别
例数
HHT
DNR
Ara-C
HHT+Ara-C
DNR+Ara-C
, 百拇医药
CR组
11
Wright-Giemsa染色
28.1±2.5*
35.8±6.4*
33.9±4.2*
36.1±5.5*
42.1±7.9*
TUNEL法
39.3±9.7*
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45.0±9.4*
40.7±5.7*
40.7±9.3*
53.3±7.5*
NR组
7
Wright-Giemsa染色
21.0±2.3
17.9±5.0
22.7±4.7
21.1±2.3
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22.6±3.0
TUNEL法
24.6±2.7
23.3±4.2
26.4±7.4
26.7±4.0
27.3±3.9
注:与NR组比较，*P<0.05 表1结果表明, CR患者化疗前白血病细胞体外对化疗药物的敏感性均高于NR患者(P值均<0.05)。在所有的实验组中，TUNEL标记法的敏感性普遍高于Wright-Giemsa染色法。
2 白血病细胞bcl-2表达与体外化疗药物诱导凋亡及临床疗效的关系 结果见表2。
, 百拇医药
表2 白血病细胞bcl-2表达与体外化疗药物诱导
凋亡及临床疗效的关系 例号
性别
年龄
(岁)
诊断
bcl-2
表达
凋亡*
(%)
化疗
方案
, 百拇医药
疗效
1
男
22
M4
-
40
DA
CR
2
男
70
M2
, 百拇医药
+
47
HA
CR
3
男
44
M2
-
53
HA
CR
4
, 百拇医药 女
46
M4
-
54
DA
CR
5
男
48
M7
-
55
, http://www.100md.com
DA
CR
6
男
38
M3
-
61
HA
CR
7
男
39
, 百拇医药 M5
+
58
HA
CR
8
男
54
M2
-
65
DA
CR
, 百拇医药
9
女
40
M1
+
51
HA
CR
10
女
54
M2
-
, 百拇医药
61
DA
CR
11
女
47
M4
+
54
DA
CR
12
男
, 百拇医药 41
M5
+
29
HA
NR
13
女
55
M2
+
25
HA
, 百拇医药
NR
14
女
63
M2
+
25
DA
NR
15
女
14
M2
, 百拇医药
+
21
DA
NR
16
女
58
M2
-
30
HA
NR
17
, 百拇医药 女
16
M4
+
31
DA
NR
18
女
44
M2
+
30
, 百拇医药
DA
NR
注:*根据化疗方案取DNR+Ara-C或HHT+Ara-C诱导细胞凋亡值(TUNEL法检测结果)
表2显示11例获CR者化疗药物诱导凋亡细胞的百分率为40%～65%，7例bcl-2表达阴性；7例NR者，化疗药物诱导凋亡细胞的百分率为21%～31%，6例bcl-2表达阳性。
3 化疗药物浓度和作用时间与诱导白血病细胞凋亡的关系 结果见表3。
表3 不同浓度化疗药物作用不同时间白血病细胞
凋亡率的比较 组别
不同时间凋亡细胞(%)
, 百拇医药 6h
12h
18h
对照组
1.5
3.5
5.0
HHT组
2ml/L
8.5
18.0
30.5
20ml/L
, http://www.100md.com
24.0
35.6
36.5
200ml/L
26.5
38.5
42.4
DNR组
0.1μmol/L
12.2
23.5
32.8
1.0μmol/L
, 百拇医药
17.5
30.0
44.5
10.0μmol/L
25.0
35.5
52.2
Ara-C组
0.1μmol/L
6.0
11.5
18.5
1.0μmol/L
, 百拇医药
2.4
26.4
43.6
10.0μmol/L
17.8
41.0
68.5
表3示例9患者白血病细胞不同浓度化疗药物作用不同时间的细胞凋亡率。从表中可以看出，该患者白血病细胞对三种化疗药物诱导凋亡均呈现浓度和时间依赖关系。
4 形态学变化 经化疗药物作用的白血病细胞在光镜下出现典型的凋亡形态特征，即细胞体积缩小、核固缩、染色质凝集，并有凋亡小体形成。电镜下观察，胞质空泡化，各种细胞器均出现不同程度的萎缩，胞膜尚完整，核固缩、碎裂，凋亡小体易见。
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讨论
临床上对初治患者合理地选用诱导凋亡敏感的药物是患者获得长期持续缓解的重要因素。国外学者近年来在这方面已作了一些探索。Csoka等[2]采用化疗初6h外周血幼稚淋巴细胞凋亡指数评估急性淋巴细胞白血病(ALL)对糖皮质激素的敏感性，结果显示凋亡率与临床疗效有很好的相关性。Smith等[3]研究39例初发AML患者体外诱导凋亡与临床疗效的关系，发现化疗获CR者，白血病细胞体外无血清培养24h后自发凋亡率平均为19.5%(3.6%～64.0%);相反，未能CR者凋亡细胞平均仅为4.2%(1.8%～7.0%)。提示体外化疗药物诱导凋亡的敏感性对于预测化疗预后有一定的指导意义。
我们对18例AML患者体外化疗药物诱导凋亡的研究显示，11例患者的骨髓白血病细胞对DNR+Ara-C或HHT+Ara-C，TUNEL法检测凋亡细胞比例高达40%～65%，临床化疗均获得CR。相反，其余7例在同样条件下对上述药物诱导凋亡不敏感者，临床采用DA或HA方案化疗均未能达到缓解，表明化疗药物诱导AML初治患者白血病细胞凋亡的作用体内与体外基本一致。由此我们认为，对于初发AML患者，体外化疗药物诱导白血病细胞凋亡敏感性的检测可作为一项化疗疗效预测的有用指标。至于初发的ALL及难治与复发的急性白血病患者，体外化疗药物诱导凋亡敏感性的临床意义如何，尚在研究之中。关于影响化疗药物诱导白血病细胞凋亡的因素较为复杂，不少作者认为与凋亡拮抗基因bcl-2关系密切，但也有持不同看法者[4，5]。Palucka等[6]对10例AML患者的体外研究表明，白血病细胞对DNR诱导凋亡的敏感性与bcl-2表达无关，而只取决于细胞对药物摄取的累积量大小。我们的观察结果则显示，AML初治患者骨髓细胞bcl-2高表达者CR率低，反之，则预后较好。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，万景华,殷建林,卞寿庚,等.急性非淋巴细胞白血病综合药敏试验的研究.中华血液学杂志,1989,10:247-249.
2，Csoka M, Bocsi J,Falus A, et al. Glucocorticoid-induced apoptosis and treatment sensitivity in acute lymphoblastic leukemia of children. Pediatr Hematol Oncol, 1997,14:433-442.
3，Smith BD, Bambach BJ,Vala MS,et al. Inhibited apoptosis and drug resistance in acute myeloid leukemia.Br J Haematol, 1998,102:1042-1049.
, 百拇医药
4，Campos L,Rouault JP, Sabido O, et al. High expression of bcl-2 protein in acute myeloid leukemia cells is associated with poor response to chemotherapy. Blood, 1993,81:3091-3097.
5，Banker DE, Groudine M, Norwood T, et al. Measurement of spontaneous and therapeutic agent-induced apoptosis with BCL-2 protein expression in acute myeloid leukemia. Blood, 1997,89:243-255.
6，Palucka KA, Knaust E, Xu D, et al. Intraclonal heterogeneity in the in vitro daunorubicin-induced apoptosis in acute myeloid leukemia. Leuk Lymphoma, 1999,32:309-316.
(收稿日期：1999-08-12), 百拇医药
单位：许小平(200433 上海，第二军医大学长海医院血液科)；史剑慧(上海医科大学放射医学研究所)；程文英(上海医科大学放射医学研究所)；王健民(200433 上海，第二军医大学长海医院血液科)；丁训杰(上海医科大学华山医院血液学研究室)
关键词：
中华血液学杂志000710 我们采用TdT介导的脱氧核苷酸切口和缺口末端标记法(TUNEL)及超微结构观察等方法，对18例初治急性髓系白血病(AML)患者骨髓白血病细胞进行体外化疗药物诱导凋亡与临床疗效关系的初步研究，以探讨体外化疗药物诱导白血病细胞凋亡在临床化疗疗效预测中的实际应用价值。
病例和方法
1 病例和标本 18例初治AML患者来自第二军医大学长海医院血液科和上海医科大学华山医院血液科。其中男8例，女10例；中位年龄46 岁(14～70岁)； M1 1例，M2 9例，M31例，M4 4例，M5 2例，M7 1例。所有患者均经形态学、细胞化学(M7经电镜及单抗)检测确诊。化疗采用HA(高三尖杉酯碱2～4mg/m2、阿糖胞苷100～150mg/m2)、DA(柔红霉素40mg/m2、阿糖胞苷100～150mg/m2)方案。完全缓解(CR)与未缓解(NR)判别按国内现行标准。化疗前抽取新鲜骨髓, 抗凝,用分离液分离单个核细胞备用。
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2 化疗药物体外诱导白血病细胞凋亡 单个核细胞浓度为1×106/ml, 分别孵育于①高三尖杉酯碱(HHT)2mg/L,②柔红霉素(DNR)1.0μmol/L，③阿糖胞苷(Ara-C) 1.0μmol/L，④HHT(2mg/L)+Ara-C (1.0μmol/L)，⑤DNR (1.0μmol/L)+Ara-C (1.0μmol/L)，作用18h。以上药物终浓度的选择参考万景华等[1]的方法及我们的实验结果。
3 白血病细胞bcl-2表达检测 所用单抗bcl-2(124)购自上海华美公司(丹麦DAKO公司产品)。HRP-DAB药盒购自美国Labvision公司。细胞涂片(细胞浓度为2×106/ml)后丙酮固定，过氧化氢作用后微波抗原修复。加bcl-2单抗，37℃湿盒作用30min，加生物素化二抗,室温作用10min，加辣根酶标记链霉亲和素工作液(Streptavidin/HRP)室温作用10min，最后以3,3′-二氨基联苯胺(DAB)染色。计数1000个细胞中的阳性细胞，并计算其阳性率。参照10例良性血液病患者的结果，bcl-2表达>15%为阳性。
, 百拇医药
4 凋亡检测
4.1 Wright-Giemsa染色: 细胞离心涂片染色,光镜下计数具有明显凋亡特征的细胞(细胞缩小, 核染色质凝聚,核碎裂等)。
4.2 TUNEL法检测片段化DNA: 主要步骤为用体积分数为1%的甲醛固定细胞,以Triton X-100穿透细胞,洗涤后滴片, 晾干。用dUTP-荧光素标记试剂盒(购自德国保灵曼公司上海分公司)进行温育反应(每份标本均设立阴性对照, 即不加关键的TdT酶)。然后加抗荧光素-AP, 再加底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(BCIP)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)，将基于荧光素的TUNEL检测转化为显色法。阳性细胞被染成蓝黑色。计数1000个细胞中阳性细胞数，并以骨髓分离后白血病细胞比例作校正。
4.3 透射电镜标本制备: 细胞用PBS洗涤后,用戊二醛和锇酸固定后进行漂洗、脱水、包埋、超薄切片，染色并晾干后以透射电镜观察细胞内超微结构。
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5 统计学分析 实验数据分析采用两样本均数比较的t检验及t′检验。
结果
1 化疗药物体外诱导白血病细胞凋亡 结果见表1。
表1 AML患者化疗前体外化疗药诱导白血病细胞凋亡率(%,
±s) 组别例数
HHT
DNR
Ara-C
HHT+Ara-C
DNR+Ara-C
, 百拇医药
CR组
11
Wright-Giemsa染色
28.1±2.5*
35.8±6.4*
33.9±4.2*
36.1±5.5*
42.1±7.9*
TUNEL法
39.3±9.7*
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45.0±9.4*
40.7±5.7*
40.7±9.3*
53.3±7.5*
NR组
7
Wright-Giemsa染色
21.0±2.3
17.9±5.0
22.7±4.7
21.1±2.3
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22.6±3.0
TUNEL法
24.6±2.7
23.3±4.2
26.4±7.4
26.7±4.0
27.3±3.9
注:与NR组比较，*P<0.05 表1结果表明, CR患者化疗前白血病细胞体外对化疗药物的敏感性均高于NR患者(P值均<0.05)。在所有的实验组中，TUNEL标记法的敏感性普遍高于Wright-Giemsa染色法。
2 白血病细胞bcl-2表达与体外化疗药物诱导凋亡及临床疗效的关系 结果见表2。
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表2 白血病细胞bcl-2表达与体外化疗药物诱导
凋亡及临床疗效的关系 例号
性别
年龄
(岁)
诊断
bcl-2
表达
凋亡*
(%)
化疗
方案
, 百拇医药
疗效
1
男
22
M4
-
40
DA
CR
2
男
70
M2
, 百拇医药
+
47
HA
CR
3
男
44
M2
-
53
HA
CR
4
, 百拇医药 女
46
M4
-
54
DA
CR
5
男
48
M7
-
55
, http://www.100md.com
DA
CR
6
男
38
M3
-
61
HA
CR
7
男
39
, 百拇医药 M5
+
58
HA
CR
8
男
54
M2
-
65
DA
CR
, 百拇医药
9
女
40
M1
+
51
HA
CR
10
女
54
M2
-
, 百拇医药
61
DA
CR
11
女
47
M4
+
54
DA
CR
12
男
, 百拇医药 41
M5
+
29
HA
NR
13
女
55
M2
+
25
HA
, 百拇医药
NR
14
女
63
M2
+
25
DA
NR
15
女
14
M2
, 百拇医药
+
21
DA
NR
16
女
58
M2
-
30
HA
NR
17
, 百拇医药 女
16
M4
+
31
DA
NR
18
女
44
M2
+
30
, 百拇医药
DA
NR
注:*根据化疗方案取DNR+Ara-C或HHT+Ara-C诱导细胞凋亡值(TUNEL法检测结果)
表2显示11例获CR者化疗药物诱导凋亡细胞的百分率为40%～65%，7例bcl-2表达阴性；7例NR者，化疗药物诱导凋亡细胞的百分率为21%～31%，6例bcl-2表达阳性。
3 化疗药物浓度和作用时间与诱导白血病细胞凋亡的关系 结果见表3。
表3 不同浓度化疗药物作用不同时间白血病细胞
凋亡率的比较 组别
不同时间凋亡细胞(%)
, 百拇医药 6h
12h
18h
对照组
1.5
3.5
5.0
HHT组
2ml/L
8.5
18.0
30.5
20ml/L
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24.0
35.6
36.5
200ml/L
26.5
38.5
42.4
DNR组
0.1μmol/L
12.2
23.5
32.8
1.0μmol/L
, 百拇医药
17.5
30.0
44.5
10.0μmol/L
25.0
35.5
52.2
Ara-C组
0.1μmol/L
6.0
11.5
18.5
1.0μmol/L
, 百拇医药
2.4
26.4
43.6
10.0μmol/L
17.8
41.0
68.5
表3示例9患者白血病细胞不同浓度化疗药物作用不同时间的细胞凋亡率。从表中可以看出，该患者白血病细胞对三种化疗药物诱导凋亡均呈现浓度和时间依赖关系。
4 形态学变化 经化疗药物作用的白血病细胞在光镜下出现典型的凋亡形态特征，即细胞体积缩小、核固缩、染色质凝集，并有凋亡小体形成。电镜下观察，胞质空泡化，各种细胞器均出现不同程度的萎缩，胞膜尚完整，核固缩、碎裂，凋亡小体易见。
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讨论
临床上对初治患者合理地选用诱导凋亡敏感的药物是患者获得长期持续缓解的重要因素。国外学者近年来在这方面已作了一些探索。Csoka等[2]采用化疗初6h外周血幼稚淋巴细胞凋亡指数评估急性淋巴细胞白血病(ALL)对糖皮质激素的敏感性，结果显示凋亡率与临床疗效有很好的相关性。Smith等[3]研究39例初发AML患者体外诱导凋亡与临床疗效的关系，发现化疗获CR者，白血病细胞体外无血清培养24h后自发凋亡率平均为19.5%(3.6%～64.0%);相反，未能CR者凋亡细胞平均仅为4.2%(1.8%～7.0%)。提示体外化疗药物诱导凋亡的敏感性对于预测化疗预后有一定的指导意义。
我们对18例AML患者体外化疗药物诱导凋亡的研究显示，11例患者的骨髓白血病细胞对DNR+Ara-C或HHT+Ara-C，TUNEL法检测凋亡细胞比例高达40%～65%，临床化疗均获得CR。相反，其余7例在同样条件下对上述药物诱导凋亡不敏感者，临床采用DA或HA方案化疗均未能达到缓解，表明化疗药物诱导AML初治患者白血病细胞凋亡的作用体内与体外基本一致。由此我们认为，对于初发AML患者，体外化疗药物诱导白血病细胞凋亡敏感性的检测可作为一项化疗疗效预测的有用指标。至于初发的ALL及难治与复发的急性白血病患者，体外化疗药物诱导凋亡敏感性的临床意义如何，尚在研究之中。关于影响化疗药物诱导白血病细胞凋亡的因素较为复杂，不少作者认为与凋亡拮抗基因bcl-2关系密切，但也有持不同看法者[4，5]。Palucka等[6]对10例AML患者的体外研究表明，白血病细胞对DNR诱导凋亡的敏感性与bcl-2表达无关，而只取决于细胞对药物摄取的累积量大小。我们的观察结果则显示，AML初治患者骨髓细胞bcl-2高表达者CR率低，反之，则预后较好。
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参 考 文 献
1，万景华,殷建林,卞寿庚,等.急性非淋巴细胞白血病综合药敏试验的研究.中华血液学杂志,1989,10:247-249.
2，Csoka M, Bocsi J,Falus A, et al. Glucocorticoid-induced apoptosis and treatment sensitivity in acute lymphoblastic leukemia of children. Pediatr Hematol Oncol, 1997,14:433-442.
3，Smith BD, Bambach BJ,Vala MS,et al. Inhibited apoptosis and drug resistance in acute myeloid leukemia.Br J Haematol, 1998,102:1042-1049.
, 百拇医药
4，Campos L,Rouault JP, Sabido O, et al. High expression of bcl-2 protein in acute myeloid leukemia cells is associated with poor response to chemotherapy. Blood, 1993,81:3091-3097.
5，Banker DE, Groudine M, Norwood T, et al. Measurement of spontaneous and therapeutic agent-induced apoptosis with BCL-2 protein expression in acute myeloid leukemia. Blood, 1997,89:243-255.
6，Palucka KA, Knaust E, Xu D, et al. Intraclonal heterogeneity in the in vitro daunorubicin-induced apoptosis in acute myeloid leukemia. Leuk Lymphoma, 1999,32:309-316.
(收稿日期：1999-08-12), 百拇医药