直接原位逆转录-聚合酶链反应检测慢性粒细胞白血病bcr/abl mRNA
作者：李中秋 陈泊 李全贞
单位：李中秋(421001 衡阳市，解放军第169医院一内科)；陈泊(第一军医大学生化教研室)；李全贞(珠江医院血液科)
关键词：
中华血液学杂志000718 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测慢性粒细胞白血病(慢粒)bcr/abl mRNA已应用于临床诊断和微小残留病的检测，但该方法不能反映bcr/abl mRNA和细胞结构之间的关系，且RNA提取操作要求较高，应用受到一定的限制。我们拟建立直接原位RT-PCR检测慢粒bcr/abl mRNA的方法。
材料和方法
1 细胞 抽取经临床确诊的慢粒患者外周静脉血，Ficoll分离出外周血单个核细胞。
, 百拇医药 2 细胞涂片及固定 取2×106/ml单个核细胞悬液50μl，离心涂片于包被0.2g/L多聚赖氨酸的载片上，用体积分数为4%的多聚甲醛固定20min。
3 细胞预处理 10μg/ml蛋白酶K 37℃消化5min。
4 引物 引物设计参照文献[1,2]，bcr引物1:5′-CTCCAGACTGTCCACAGCATTCCG-3′,abl反义引物2:5′-CAGACCCTGAGGCTCAAAGTCAGA-3′，由中山医科大学达安基因诊断中心合成。
5 原位PCR 玻片置于多载片PCR仪，加逆转录反应液75μl，含RNasin 50U，AMV逆转录酶20U，dNTP 200μmol/L，MgCl2 60mmol/L，abl反义引物2 20pmol/L,40℃反应40min。每一载片加PCR反应液100μl，含Taq酶2U,MgCl2 1.5mmol/L,dNTP 200μmol/L及地高辛-dUTP 10μmol/L，bcr引物1和abl反义引物2 20pmol/L。预变性5min，94℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 60s，共10个循环，后72℃延伸5min。
, http://www.100md.com
6 洗脱 45℃ 0.1×SSC洗2次,每次20min。
7 地高辛检测及显色 使用地高辛检测试剂盒检测扩增产物。1∶500抗地高辛抗体孵育细胞2h，缓冲液彻底冲洗后加上反应物液NBT和BCIP，显微镜下观察结果。显微镜摄影。
8 对照的设置 K562细胞为阳性对照；阴性对照包括HL-60细胞，除省略逆转录酶或省略扩增引物外，其它条件与检测样本一致。
结果
1 结果判定 细胞胞浆中出现紫褐色为阳性结果；无紫褐色为阴性结果。阳性结果表示胞浆存在bcr/abl mRNA逆转录扩增产物。
2 检测结果 K562细胞表达阳性；被检样本表达阳性；阴性对照表达阴性或弱阳性(背景污染等所致)。
, http://www.100md.com 3 灵敏度 本方法能检测单个细胞内的RNA，灵敏度达到10-6。
讨论
直接原位RT-PCR是原位PCR的一种改良方案，这种方案更直接且容易实施，但由于引物错配和非特异性退火发生，容易产生非特异性结果[3]。Martinez等[4]认为，使用正确的对照能消除这个问题。本实验中我们采用直接原位RT-PCR检测bcr/abl mRNA，阳性对照及被检样本表达阳性，阴性对照表达阴性，肯定了该方法的特异性。我们采取了如下措施避免非特异性结果：①采取了物理热启动法PCR，减少了引物错配和引物二聚体形成的可能；②摸索出最适PCR循环数；③设立了严格的阴、阳性对照。
直接原位RT-PCR与传统RT-PCR相比，在技术操作和应用范围有如下优点：①传统RT-PCR不能反映扩增产物和组织结构之间的关系，直接原位RT-PCR能够在组织切片或完整细胞中检测单个拷贝的RNA，同时还可鉴定细胞结构；②直接原位RT-PCR避免了提取mRNA程序。
, 百拇医药
直接原位RT-PCR检测慢粒bcr/abl mRNA具有敏感性高,特异性好,无须提取RNA等优点，可应用于慢粒微小残留病的检测和基础研究。
参 考 文 献
1，Delage R,Soiffer RJ,Dear K，et al. Clinical significance of bcr/abl gene rearrangement detected by polymerase chain reaction after allogeneic bone marrow transplantation in chronic myelogenous leukemia. Blood,1991,78:2759-2767.
2，Dobrovic A,Trainor KJ,Morley AA.Detection of the molecular abnormality in chronic myeloid leukemia by use of the polymerase chain reaction. Blood,1988,72:2063-2065.
, http://www.100md.com
3，Komminoth P,Long AA.In situ polymerase chain reaction:an overview of methods, applications and limitations of a new molecular technique. Virchows Arch,1993,64:67-72.
4，Martinez A, Miller MJ, Quinn K, et al. Non-radioactive localization of nuleic acids by direct in situ PCR and in situ RT-PCR in paraffin-embedded sections. J Histochem Cytochem, 1995,43:739-747.
(收稿日期：1999-05-17), 百拇医药
单位：李中秋(421001 衡阳市，解放军第169医院一内科)；陈泊(第一军医大学生化教研室)；李全贞(珠江医院血液科)
关键词：
中华血液学杂志000718 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测慢性粒细胞白血病(慢粒)bcr/abl mRNA已应用于临床诊断和微小残留病的检测，但该方法不能反映bcr/abl mRNA和细胞结构之间的关系，且RNA提取操作要求较高，应用受到一定的限制。我们拟建立直接原位RT-PCR检测慢粒bcr/abl mRNA的方法。
材料和方法
1 细胞 抽取经临床确诊的慢粒患者外周静脉血，Ficoll分离出外周血单个核细胞。
, 百拇医药 2 细胞涂片及固定 取2×106/ml单个核细胞悬液50μl，离心涂片于包被0.2g/L多聚赖氨酸的载片上，用体积分数为4%的多聚甲醛固定20min。
3 细胞预处理 10μg/ml蛋白酶K 37℃消化5min。
4 引物 引物设计参照文献[1,2]，bcr引物1:5′-CTCCAGACTGTCCACAGCATTCCG-3′,abl反义引物2:5′-CAGACCCTGAGGCTCAAAGTCAGA-3′，由中山医科大学达安基因诊断中心合成。
5 原位PCR 玻片置于多载片PCR仪，加逆转录反应液75μl，含RNasin 50U，AMV逆转录酶20U，dNTP 200μmol/L，MgCl2 60mmol/L，abl反义引物2 20pmol/L,40℃反应40min。每一载片加PCR反应液100μl，含Taq酶2U,MgCl2 1.5mmol/L,dNTP 200μmol/L及地高辛-dUTP 10μmol/L，bcr引物1和abl反义引物2 20pmol/L。预变性5min，94℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 60s，共10个循环，后72℃延伸5min。
, http://www.100md.com
6 洗脱 45℃ 0.1×SSC洗2次,每次20min。
7 地高辛检测及显色 使用地高辛检测试剂盒检测扩增产物。1∶500抗地高辛抗体孵育细胞2h，缓冲液彻底冲洗后加上反应物液NBT和BCIP，显微镜下观察结果。显微镜摄影。
8 对照的设置 K562细胞为阳性对照；阴性对照包括HL-60细胞，除省略逆转录酶或省略扩增引物外，其它条件与检测样本一致。
结果
1 结果判定 细胞胞浆中出现紫褐色为阳性结果；无紫褐色为阴性结果。阳性结果表示胞浆存在bcr/abl mRNA逆转录扩增产物。
2 检测结果 K562细胞表达阳性；被检样本表达阳性；阴性对照表达阴性或弱阳性(背景污染等所致)。
, http://www.100md.com 3 灵敏度 本方法能检测单个细胞内的RNA，灵敏度达到10-6。
讨论
直接原位RT-PCR是原位PCR的一种改良方案，这种方案更直接且容易实施，但由于引物错配和非特异性退火发生，容易产生非特异性结果[3]。Martinez等[4]认为，使用正确的对照能消除这个问题。本实验中我们采用直接原位RT-PCR检测bcr/abl mRNA，阳性对照及被检样本表达阳性，阴性对照表达阴性，肯定了该方法的特异性。我们采取了如下措施避免非特异性结果：①采取了物理热启动法PCR，减少了引物错配和引物二聚体形成的可能；②摸索出最适PCR循环数；③设立了严格的阴、阳性对照。
直接原位RT-PCR与传统RT-PCR相比，在技术操作和应用范围有如下优点：①传统RT-PCR不能反映扩增产物和组织结构之间的关系，直接原位RT-PCR能够在组织切片或完整细胞中检测单个拷贝的RNA，同时还可鉴定细胞结构；②直接原位RT-PCR避免了提取mRNA程序。
, 百拇医药
直接原位RT-PCR检测慢粒bcr/abl mRNA具有敏感性高,特异性好,无须提取RNA等优点，可应用于慢粒微小残留病的检测和基础研究。
参 考 文 献
1，Delage R,Soiffer RJ,Dear K，et al. Clinical significance of bcr/abl gene rearrangement detected by polymerase chain reaction after allogeneic bone marrow transplantation in chronic myelogenous leukemia. Blood,1991,78:2759-2767.
2，Dobrovic A,Trainor KJ,Morley AA.Detection of the molecular abnormality in chronic myeloid leukemia by use of the polymerase chain reaction. Blood,1988,72:2063-2065.
, http://www.100md.com
3，Komminoth P,Long AA.In situ polymerase chain reaction:an overview of methods, applications and limitations of a new molecular technique. Virchows Arch,1993,64:67-72.
4，Martinez A, Miller MJ, Quinn K, et al. Non-radioactive localization of nuleic acids by direct in situ PCR and in situ RT-PCR in paraffin-embedded sections. J Histochem Cytochem, 1995,43:739-747.
(收稿日期：1999-05-17), 百拇医药