环孢菌素A与维拉帕米并用逆转去甲氧柔红霉素的交叉耐药性的实验研究
作者：刘云鹏 罗颖 卢香兰 尚世丽 翟明
单位：110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院血液科
关键词：
中华血液学杂志000712 多药耐药基因mdr-1产物P-糖蛋白(P-gp)过度表达是耐药的重要原因之一。为探讨白血病细胞耐药机制及逆转方法，我们建立了高三尖杉酯碱(HHT)耐药细胞株，并观察了其P-gp的表达及环孢菌素A (CsA)和维拉帕米(Ver)在逆转耐药中并用的效果。
材料和方法
1 药品 HHT (Sigma公司)、柔红霉素(DNR，法玛西亚普强公司)、去甲氧柔红霉素(Ida，法玛西亚普强公司)和阿糖胞苷(Ara-C，Pharmacia & Upjohn公司)、长春新碱 (VCR，上海华联制药公司)、足叶乙甙(Vp16，上海医药工业研究院实验药厂)、CsA (瑞士Sandoz公司)、Ver (Sigma公司)均于实验前用注射用水配制，4℃保存。
, 百拇医药
2 细胞培养与HHT耐药株的建立 小鼠白血病L1210细胞生长在含体积分数为10%的小牛血清、12U/ml庆大霉素的RPMI 1640培养液中，培养于37℃，含体积分数为5%的CO2的饱和湿度培养箱。部分细胞培养于含有HHT的培养液中，当细胞倍增时间接近正常时，逐渐提高HHT浓度，诱导细胞产生耐药，最后用稀释培养法筛选出耐药亚株 L1210/H120。L1210/H120在脱离药物条件下，培养6个月，耐药性保持不变。化疗药物的细胞毒性测定采用MTT法。
3 P-gp检测 将细胞用离心涂片机制成涂片标本，丙酮固定10min，用抗P-gp单克隆抗体 C219 (P-glycoCHEK, Centcor, USA)进行免疫组化检测 (APAAP法)。
4 细胞内Ida含量的检测 将浓度为5×105/ml的L1210/H120细胞分为Ida、Ida+CsA、Ida+Ver和Ida+Ver+CsA组，L1210细胞作为对照组。Ida、CsA和Ver的终浓度分别为0.01 μmol/L，0.1 μg/ml和1.0 μmol/L。将细胞置于37℃水浴，在设定时间用流式细胞仪(FACScan)检测各组细胞内Ida荧光强度，并观察CsA和Ver分别及并用后对Ida杀伤L1210/H120细胞的影响。
, 百拇医药
结果
1 常规培养条件下，L1210细胞的倍增时间为12～14h，L1210/H120细胞的倍增时间为13～15h,两者的细胞周期分布基本相同。L1210和L1210/H120细胞分别与不同化疗药物共同培养48h的IC50表明，L1210/H120与L1210相比，除Ara-C之外，对HHT、VCR、Vp16、DNR和Ida均显示了不同程度的耐药性，其中，对HHT的耐药性最强，对Ida的耐药程度最低 (表1)。
表1 L1210/H120细胞的药物敏感性 细胞
IC50(μmol/L)
HHT
DNR
Ida
, http://www.100md.com
VCR
Vp16
Ara-C
L1210
0.05
0.08
0.02
0.25
0.37
1.40
L1210/H120
6.00
4.80
, http://www.100md.com
0.18
20.00
22.20
1.50
耐药倍数
120
60
9
80
60
1
2 L1210细胞P-gp表达为阴性，L1210/H120细胞呈均匀的强阳性，提示L1210/H120细胞存在P-gp的过度表达。
, http://www.100md.com
3 由图1可见，Ida加入培养液后，迅速进入L1210细胞，10min内达到峰值。此时， L1210/H120细胞内的 Ida荧光强度仅为 L1210细胞的10%(P<0.01)，提示耐药细胞内的Ida含量低于敏感细胞内的含量。当Ida和CsA或Ida和Ver同时加入细胞液后，L1210/H120细胞内的Ida荧光强度分别增加约2.5倍(P<0.01)，L1210细胞内Ida的荧光强度无明显变化(P>0.05)。将CsA、Ver和Ida同时添加后， L1210/H120细胞内的Ida荧光强度增加约6.0倍，明显高于CsA或Ver单独与Ida应用时的荧光强度(P<0.01)。细胞增殖抑制实验结果表明，0.1 μg/ml的CsA和1.0 μmol/L的Ver使L1210/H120细胞对Ida的耐药倍数分别降为约6.0和4.5倍。当上述浓度的CsA和Ver并用时，L1210/H120完全恢复了对Ida的敏感性(IC50为0.02 μmol/L，P<0.01,图2)，相同条件下，Ida对L1210的细胞毒性无明显增加(P>0.05)。
, 百拇医药
图1 CsA与Ver对L1210/H120细胞内Ida含量的影响
图2 CsA与Ver并用增强Ida对L1210/H120细胞的杀伤作用
讨论
P-gp存在于细胞膜，在 ATP和钙离子存在下可将许多结构和作用机制不同的抗癌药如植物碱类和蒽环类药物从细胞内排出，降低细胞内药物含量，使细胞表现出多药耐药性，但对代谢拮抗剂的细胞内药物含量及细胞毒性无影响。本实验结果证明，在 HHT的持续作用下，L1210/ H120细胞对HHT、VCR、Vp16、DNR和Ida均产生耐药性，而对Ara-C仍然保持敏感，同时， L1210/H120细胞P-gp过度表达，提示L1210/H120细胞的多药耐药性与P-gp密切相关。 Ida是DNR的新一代衍生物，临床研究证明，Ida的疗效明显优于DNR，并且对DNR耐药患者有较好疗效[1,2]。在本实验中， L1210/H120细胞内Ida含量明显减少，相对耐药性为L1210细胞的8.6倍，表明P-gp过表达的细胞对Ida也产生耐药性。L1210/H120细胞对Ida 的耐药性低于对DNR的耐药性。其原因可能与Ida比DNR脂溶性强，更容易通过细胞膜进入细胞，并且，Ida的细胞毒性作用更强有关[1,2]。另外，体外建立的耐药细胞株的耐药性往往高于敏感株的几十至几百倍，而患者化疗后产生的耐药性通常仅为化疗前的数倍，因此，对DNR轻度耐药时，对Ida仍然敏感。
, http://www.100md.com
许多体外实验已经证明，免疫抑制剂 CsA和钙离子拮抗剂能够逆转P-gp介导的耐药。Damiani等[3]报道急性非淋巴细胞白血病患者静滴CsA后，血浆Ida的浓度比对照者增加2倍。但是，临床应用时，Ver的血中浓度需大于3 μmol/L，CsA需大于1200～2400μg/L才能发挥逆转耐药的作用，而上述浓度的Ver易导致心律失常，CsA易产生肝肾毒性，因而限制了其临床应用[4,5]。本实验中较低浓度的Ver和CsA并用时，在逆转P-gp介导的多药耐药方面起到了协同作用，与Hu等[6]从耐长春花碱的白血病细胞株CEM/VLB所观察到的结果近似。这一结果对临床合理应用Ver和 CsA，降低不良反应可能有一定意义。
基金项目：辽宁省自然科学基金(962303)和辽宁省科委研究基金(96802006)资助项目
参 考 文 献
, http://www.100md.com 1，Berman E ,Heller G,Santorsa J,et al. Results of a randomized trial comparing idarubicin and cytosine arabinoside with daunorubicin and cytosine arabinoside in adult patients with newly diagnosed acute myelogenous leukemia. Blood, 1991, 77: 1666-1674.
2，Vogler WR, Velez-Garcia E, Weiner RS, et al. A phase Ⅲ trial comparing idarubicin and daunorubicin in combination with cytarabine in acute myelogenous leukemia: a Southeastern Cancer Study Group Study. J Clin Oncol, 1992, 10: 1103-1111.
, http://www.100md.com
3，Damiani D, Michieli M, Ermacora A, et al. Adjuvant treatment with cyclosporin A increases the toxicity of chemotherapy for remission induction in acute non-lymphocytic leukemia. Leukemia, 1998, 12:1236-1240.
4，Miller TP, Grogan TM, Dalton WS, et al. P-glycoprotein expression of in malignant lymphoma and reversal of clinical drug resistance with chemotherapy plus high-dose verapamil. J Clin Oncol, 1991, 9: 17-24.
5，Yahanda AM,Adler KM,Fisher GA, et al. Phase I trial of etoposide with cyclosporine as a modulator of multidrug resistance. J Clin Oncol, 1992, 10: 1624-1634.
6，Hu XF, Martin TJ, Bell DR, et al. Combined use of cyclosporin A and verapamil in modulating multidrug resistance in human leukemia cell lines. Cancer Res, 1990, 50: 2953-2957.
(收稿日期：1999-10-25), 百拇医药
单位：110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院血液科
关键词：
中华血液学杂志000712 多药耐药基因mdr-1产物P-糖蛋白(P-gp)过度表达是耐药的重要原因之一。为探讨白血病细胞耐药机制及逆转方法，我们建立了高三尖杉酯碱(HHT)耐药细胞株，并观察了其P-gp的表达及环孢菌素A (CsA)和维拉帕米(Ver)在逆转耐药中并用的效果。
材料和方法
1 药品 HHT (Sigma公司)、柔红霉素(DNR，法玛西亚普强公司)、去甲氧柔红霉素(Ida，法玛西亚普强公司)和阿糖胞苷(Ara-C，Pharmacia & Upjohn公司)、长春新碱 (VCR，上海华联制药公司)、足叶乙甙(Vp16，上海医药工业研究院实验药厂)、CsA (瑞士Sandoz公司)、Ver (Sigma公司)均于实验前用注射用水配制，4℃保存。
, 百拇医药
2 细胞培养与HHT耐药株的建立 小鼠白血病L1210细胞生长在含体积分数为10%的小牛血清、12U/ml庆大霉素的RPMI 1640培养液中，培养于37℃，含体积分数为5%的CO2的饱和湿度培养箱。部分细胞培养于含有HHT的培养液中，当细胞倍增时间接近正常时，逐渐提高HHT浓度，诱导细胞产生耐药，最后用稀释培养法筛选出耐药亚株 L1210/H120。L1210/H120在脱离药物条件下，培养6个月，耐药性保持不变。化疗药物的细胞毒性测定采用MTT法。
3 P-gp检测 将细胞用离心涂片机制成涂片标本，丙酮固定10min，用抗P-gp单克隆抗体 C219 (P-glycoCHEK, Centcor, USA)进行免疫组化检测 (APAAP法)。
4 细胞内Ida含量的检测 将浓度为5×105/ml的L1210/H120细胞分为Ida、Ida+CsA、Ida+Ver和Ida+Ver+CsA组，L1210细胞作为对照组。Ida、CsA和Ver的终浓度分别为0.01 μmol/L，0.1 μg/ml和1.0 μmol/L。将细胞置于37℃水浴，在设定时间用流式细胞仪(FACScan)检测各组细胞内Ida荧光强度，并观察CsA和Ver分别及并用后对Ida杀伤L1210/H120细胞的影响。
, 百拇医药
结果
1 常规培养条件下，L1210细胞的倍增时间为12～14h，L1210/H120细胞的倍增时间为13～15h,两者的细胞周期分布基本相同。L1210和L1210/H120细胞分别与不同化疗药物共同培养48h的IC50表明，L1210/H120与L1210相比，除Ara-C之外，对HHT、VCR、Vp16、DNR和Ida均显示了不同程度的耐药性，其中，对HHT的耐药性最强，对Ida的耐药程度最低 (表1)。
表1 L1210/H120细胞的药物敏感性 细胞
IC50(μmol/L)
HHT
DNR
Ida
, http://www.100md.com
VCR
Vp16
Ara-C
L1210
0.05
0.08
0.02
0.25
0.37
1.40
L1210/H120
6.00
4.80
, http://www.100md.com
0.18
20.00
22.20
1.50
耐药倍数
120
60
9
80
60
1
2 L1210细胞P-gp表达为阴性，L1210/H120细胞呈均匀的强阳性，提示L1210/H120细胞存在P-gp的过度表达。
, http://www.100md.com
3 由图1可见，Ida加入培养液后，迅速进入L1210细胞，10min内达到峰值。此时， L1210/H120细胞内的 Ida荧光强度仅为 L1210细胞的10%(P<0.01)，提示耐药细胞内的Ida含量低于敏感细胞内的含量。当Ida和CsA或Ida和Ver同时加入细胞液后，L1210/H120细胞内的Ida荧光强度分别增加约2.5倍(P<0.01)，L1210细胞内Ida的荧光强度无明显变化(P>0.05)。将CsA、Ver和Ida同时添加后， L1210/H120细胞内的Ida荧光强度增加约6.0倍，明显高于CsA或Ver单独与Ida应用时的荧光强度(P<0.01)。细胞增殖抑制实验结果表明，0.1 μg/ml的CsA和1.0 μmol/L的Ver使L1210/H120细胞对Ida的耐药倍数分别降为约6.0和4.5倍。当上述浓度的CsA和Ver并用时，L1210/H120完全恢复了对Ida的敏感性(IC50为0.02 μmol/L，P<0.01,图2)，相同条件下，Ida对L1210的细胞毒性无明显增加(P>0.05)。
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图1 CsA与Ver对L1210/H120细胞内Ida含量的影响
图2 CsA与Ver并用增强Ida对L1210/H120细胞的杀伤作用
讨论
P-gp存在于细胞膜，在 ATP和钙离子存在下可将许多结构和作用机制不同的抗癌药如植物碱类和蒽环类药物从细胞内排出，降低细胞内药物含量，使细胞表现出多药耐药性，但对代谢拮抗剂的细胞内药物含量及细胞毒性无影响。本实验结果证明，在 HHT的持续作用下，L1210/ H120细胞对HHT、VCR、Vp16、DNR和Ida均产生耐药性，而对Ara-C仍然保持敏感，同时， L1210/H120细胞P-gp过度表达，提示L1210/H120细胞的多药耐药性与P-gp密切相关。 Ida是DNR的新一代衍生物，临床研究证明，Ida的疗效明显优于DNR，并且对DNR耐药患者有较好疗效[1,2]。在本实验中， L1210/H120细胞内Ida含量明显减少，相对耐药性为L1210细胞的8.6倍，表明P-gp过表达的细胞对Ida也产生耐药性。L1210/H120细胞对Ida 的耐药性低于对DNR的耐药性。其原因可能与Ida比DNR脂溶性强，更容易通过细胞膜进入细胞，并且，Ida的细胞毒性作用更强有关[1,2]。另外，体外建立的耐药细胞株的耐药性往往高于敏感株的几十至几百倍，而患者化疗后产生的耐药性通常仅为化疗前的数倍，因此，对DNR轻度耐药时，对Ida仍然敏感。
, http://www.100md.com
许多体外实验已经证明，免疫抑制剂 CsA和钙离子拮抗剂能够逆转P-gp介导的耐药。Damiani等[3]报道急性非淋巴细胞白血病患者静滴CsA后，血浆Ida的浓度比对照者增加2倍。但是，临床应用时，Ver的血中浓度需大于3 μmol/L，CsA需大于1200～2400μg/L才能发挥逆转耐药的作用，而上述浓度的Ver易导致心律失常，CsA易产生肝肾毒性，因而限制了其临床应用[4,5]。本实验中较低浓度的Ver和CsA并用时，在逆转P-gp介导的多药耐药方面起到了协同作用，与Hu等[6]从耐长春花碱的白血病细胞株CEM/VLB所观察到的结果近似。这一结果对临床合理应用Ver和 CsA，降低不良反应可能有一定意义。
基金项目：辽宁省自然科学基金(962303)和辽宁省科委研究基金(96802006)资助项目
参 考 文 献
, http://www.100md.com 1，Berman E ,Heller G,Santorsa J,et al. Results of a randomized trial comparing idarubicin and cytosine arabinoside with daunorubicin and cytosine arabinoside in adult patients with newly diagnosed acute myelogenous leukemia. Blood, 1991, 77: 1666-1674.
2，Vogler WR, Velez-Garcia E, Weiner RS, et al. A phase Ⅲ trial comparing idarubicin and daunorubicin in combination with cytarabine in acute myelogenous leukemia: a Southeastern Cancer Study Group Study. J Clin Oncol, 1992, 10: 1103-1111.
, http://www.100md.com
3，Damiani D, Michieli M, Ermacora A, et al. Adjuvant treatment with cyclosporin A increases the toxicity of chemotherapy for remission induction in acute non-lymphocytic leukemia. Leukemia, 1998, 12:1236-1240.
4，Miller TP, Grogan TM, Dalton WS, et al. P-glycoprotein expression of in malignant lymphoma and reversal of clinical drug resistance with chemotherapy plus high-dose verapamil. J Clin Oncol, 1991, 9: 17-24.
5，Yahanda AM,Adler KM,Fisher GA, et al. Phase I trial of etoposide with cyclosporine as a modulator of multidrug resistance. J Clin Oncol, 1992, 10: 1624-1634.
6，Hu XF, Martin TJ, Bell DR, et al. Combined use of cyclosporin A and verapamil in modulating multidrug resistance in human leukemia cell lines. Cancer Res, 1990, 50: 2953-2957.
(收稿日期：1999-10-25), 百拇医药