抗肿瘤坏死因子单抗对内毒素血症家兔脑组织内部血流分配的影响
作者：朱明光 谢淑丽 吴兴裕
单位：第四军医大学吉林军医学院应用生理学教研室，吉林 132013
关键词：内毒素血症；血流分配；抗肿瘤坏死因子单克隆抗体
中国急救医学000704 [摘 要] 目的 观测内毒素血症时家兔脑组织血流总量及其分配的改变，并探讨这种变化的发生机理。方法 静脉注射内毒素造成动物内毒素血症，用放射性生物微球法检测注射中和性抗rhTNF单克隆抗体前后脑组织血流量的变化。结果 (1)内毒素组的左右半侧脑组织平均血流量及脑干、脑桥血流量均显著低于对照组(P<0.01)；(2)无关抗体组的左右半侧脑组织平均血流量及脑干、脑桥血流量均显著低于抗体保护组(P<0.01)。结论 严重内毒素血症可致脑血流量减少及脑组织内部血流分配紊乱，而抗rhTNF单克隆抗体可予以有效纠正。
[中图分类号]R 503 [文献标识码] A
, 百拇医药
[文章编号]1002-1949(2000)07-0390-02
Effects of anti-rhTNF monoclinal antibody on the blood flow among and within the brain of endotoxemia rabbits
ZHU Ming-guang,XIE Shu-li,WU Xing-yu
(Laboratory of Applied Physiology,Jilin Military Medical College,Jilin 132013,China)
[Abstract]Objective To measure tissue blood flow distribition and the effects of anti-rhTNF McAb on the distribution of blood flow among and within the brain of endotoxemia rabbits.Methods Endotoxemia was produced by venous endotoxin injection.Radio-labeled-biomicrosphere technique was adapted to measure blood flow distribution.Results (1)The average blood flow in both sides of brain and pallium in endotoxemia group was significantly lower than those of control group(P<0.01).(2)The average blood flow in both sides of brain and pallium in non-relative McAb group was remarkbly lower than that of anti-rhTNF McAb group.Conclusion This experiment suggests that endotoxemia can result in the reduction of brain blood flow and blood distribution,which can be effectively corrected by anti-rhTNF McAb.
, 百拇医药
[Key words]Endotoxemia; Blood flow distribution; Anti-rhTNF McAb
脑是机体的生命中枢，脑功能障碍将严重地影响机体的生命活动。脑功能维持依赖于充足的血液供应，任何原因引起的脑血流总量及其在脑组织内部分配的异常都将损害脑功能。严重内毒素血症是引起脑血流异常的常见原因。在内毒素血症状态下，机体组织器官的血流量重新分布，脑、心等生命器官的血流量增多，皮肤、内脏等部位的血流量减少，以保障重要脏器的血液供应。这种器官间的血流分配调节以往已有很多报道[1]，但器官内部尤其是脑组织内部血流分配调节的研究却很少见。内毒素对机体的很多损伤作用，目前倾向于认为主要是通过内毒素诱发机体所产生的内源性细胞因子所介导[2，3]。本实验拟观察严重内毒素血症状态下，家兔脑组织内部血流分布的变化及注射抗肿瘤坏死因子单克隆抗体(anti-rhTNF McAb)后的保护作用，并探讨这种变化及保护作用的发生机理。
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1 材料与方法
1.1 实验动物及手术准备 纯种大耳白兔，体重2.3±0.3 kg，雌雄不限，戊巴比妥钠(30 mg/kg)静注麻醉，施行气管插管及机械通气支持。一侧颈总动脉插管，连接三通开关，用以测量血压和采血。开胸暴露左心耳。
1.2 放射性生物微球的制备 取蟾蜍血1 ml，肝素抗凝，加还原剂氯化亚锡0.25 ml，温浴5 min，再加入5%乙二胺四乙酸钠0.25 ml，继续温浴1 min。离心后将红细胞制成混悬液，用激发态锝(99mTc)标记，福尔马林固化，最后制成99mTc-FRBC生物微球悬液[4]。
1.3 组织血流量测定 将99mTc-FRBC经左心耳注入体循环，最终栓塞于毛细血管，依据其在毛细血管处的堆积量计算器官血流量。各部位血流量计算式为：
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Q＝Qs.Tcpm/Scpm (1)
式中，Q＝局部血流量(ml/min/g)，Qs＝参考血样本量(ml/min)，Tcpm＝组织标本的cpm数，Scpm＝平均2 ml血样本的cpm数。
1.4 实验分组及处理 28只动物随机分成四组，每组7只，内毒素(ET)组于实验前24 h首次接受内毒素注射，用大肠杆菌内毒素(Escherichia Coli O26:B6 Lipopoly Saccharide Sigma Co.USA NO.L-3254)以注射水配制成0.5 g/L溶液，经耳缘静脉注入，剂量为0.1 mg/kg。对照(C)组注入等量注射用水。次日，手术后再行第二次ET注射，剂量同前。抗体保护组(anti-rhTNF McAb)与无关抗体组(anti-IL-2 McAb)的ET用量及用法同前。抗体保护组于每次ET攻击前30 min注入纯化的anti-rhTNF McAb(由第四军医大学免疫教研室提供)，用量为5 mg/kg；无关抗体组注入抗白细胞介素-2单抗(也由第四军医大学免疫教研室提供)，用法同前。实验过程各组随机排定。
, http://www.100md.com
1.5 实验步骤 手术准备后，从颈总动脉采取参考血标本2 ml，用蠕动泵控制流速(2 ml/min)。在开始抽取血标本10 s后，即从左心耳注入99mTc-FRBC悬液，用量0.4 ml/kg，20 s内注完，每毫升悬液约含FRBC 5×107。15 min后抽取静脉血2 ml。放血急速处死动物，取脑组织标本及动、静脉血样本置计数管内，用γ计数器(北京核仪器厂)检测放射量，进而计算脑组织的平均血流量及大脑皮层和脑干等部位的血流量。
1.6 统计学处理 数据以
±s表示，组间比较用t检验。
2 结果
2.1 实验动物一般状况 首次ET注射后，动物出现拒食、竖毛等反应。有些动物有腹泻、体温升高等表现。术后动物血压若低于10.7 kPa则弃之不用，即生物微球注入前血压必须保持在10.7 kPa以上，注入后心率、血压均无显著变化。
, 百拇医药
2.2 脑组织血流量的改变 取动物脑组织，生理盐水冲洗干净。先测量大脑左右半球的放射性，而后剥离大脑皮层，测皮层和脑干的放射性，依式(1)计算器官血流量。其血流分配情况见附表。从附表中可见，大脑左右半球血流量十分接近，说明所采用的技术方法稳定可靠。ET组脑组织的平均血流均显著低于C组(P<0.01)；无关抗体组显著低于抗体保护组(P<0.01)。大脑皮层及脑干平均血流量及无关抗体组无显著差异(P<0.05)，但均显著低于C组。皮层及脑干血流量占脑血流总量的百分比，ET组显著低于C组(P<0.05)。表明脑组织内部血流分配紊乱。抗体保护组各测量指标接近C组，表明抗rhTNF单抗能对抗内毒素所致的脑血流量减少，并能有效地纠正血流分配紊乱。
Table 1 Blood flow among different parts of brain measured
by radio-labeled-biomicrosphere(ml/min/g-1)(±s，n=7) Group
, 百拇医药
left brain
right brain
pallium
brainstem
control
0.37+0.15
0.66+0.17
1.21+0.23
0.79+0.17
endotoxin
0.43+0.05**
, http://www.100md.com
0.45+0.04**
0.94+0.16**
0.67+0.10**
anti-rhTNF McAb
0.71+0.18
0.69+0.17
1.18+0.20
0.77+0.19
anti-IL-2 McAb
0.31+0.10＃＃
, http://www.100md.com
0.31+0.11＃＃
0.91+0.17＃＃
0.69+0.11＃＃
**P<0.01 compared with control group
＃＃P<0.01 compared with anti-rhTNF McAb groupTable 2 Blood distribution ratio of pallium and brainstem vs.
total brain blood flow mesaured by radio-labeled
-biomicrosphere(%)(±s，n=7) Brain parts
, http://www.100md.com
control
endotoxin
anti-rhTNF McAb
anti-IL-2 McAb
pallium
31±6
26±5**
30±6
27±7＃
brainstem
16±5
, 百拇医药 11±5*
15±4
10±4＃＃
*P<0.05 **P<0.01 compared with control group
＃P<0.05 ＃＃P<0.01 compared with anti-rhTNF McAb group
3 讨论
本实验用99mTc标记蛙红细胞制成放射性生物微球，用以测量家兔局部器官组织血流量及血流量分配变化。方法简便，结果稳定。
脑功能正常的维持除需组织血液灌流量正常外，还需要血液在脑组织的分配正常。血液在器官间和器官内的分布取决于血管口径的大小。生理状态下，机体通过神经-体液和局部代谢等方面因素对组织血流量及其分配进行着精确的调控，而血管壁对上述调控因素的反应性正常则是精确调节的前提。从本实验结果看，内毒素组脑血流总量、大脑皮层及脑干血流量均明显低于正常组，这表明大脑不仅有血流总量的异常，而且还有内部血流分配的异常。机体对异常的刺激因素具有一定程度的代偿能力，但这种代偿能力有一定限度。超出代偿能力的刺激会引起机体失代偿，从而出现病理反应。严重内毒素血症构成了对血管系统的广泛损伤，血管失去了正常的代偿反应能力[6]，因而脑组织平均血流量减少，脑组织内部血流分配紊乱。大脑皮层是高度分化的组织，极易受缺血、缺氧的影响，供血不足时可能出现神情冷漠和意识障碍。脑干是呼吸和循环中枢所在地，供血量减少则使其机能受损。如呼吸血压不能保持稳定，则会危及生命。
, 百拇医药
近年来的研究表明，内源性细胞因子在机体对细菌内毒素产生的反应中起重要的中介作用[6]。内毒素血症时，内毒素对血管紧张度调节功能的破坏作用很可能是由TNF介导的。TNF通过趋化和激活粒细胞等途径损伤血管内皮细胞，使之发生结构和功能上的异常改变[5]。血管内皮细胞构成了血流与血管壁平滑肌之间的屏障。当这一屏障遭到破坏时，血流中的某些化学物质和激素必将直接作用于血管平滑肌，使其调节功能紊乱。本实验使用中和性抗体，阻断了内毒素所致的脑血流量减少和分布异常，提示TNF在脑血流异常中起重要作用。
[参考文献]
[1]Wyler F, Stalder G, Hof RP, et al. Effects of endotoxin on distribution of cardiac output in unanesthetized rabbits[J]. American J Physiol, 1970, 219:246-249.
, 百拇医药
[2]Cerami A, Buetler. The role of cachectin/TNF in endotoxic shock and cachecxia[J]. Immunol Today, 1988, 9:28-31.
[3]Tracey KJ, Cerami A. Tumor necrosis factor:an updated review of its biology[J]. Crit Care Med, 1993, 21:s415-420.
[4]王辅才.51Cr或99Tc标记蛙红细胞测量动物器官局部血流量.见：叶维新主编实验核医学技术[M].长春：吉林科学技术出版社，1991.79-81.
[5]Battafarano RJ. Dunn DL. Contribution of local cytokine production to the system host septic response[J].Crit Care Med, 1994, 22(1):7-8.
[6]Gamble JR, Harlan JM, Klebanoff SJ, et al. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant factor[J]. Pro Natl Sci USA, 1985, 82:8667-8671.
收稿：1999-07-12，修回：2000-01-20, 百拇医药
单位：第四军医大学吉林军医学院应用生理学教研室，吉林 132013
关键词：内毒素血症；血流分配；抗肿瘤坏死因子单克隆抗体
中国急救医学000704 [摘 要] 目的 观测内毒素血症时家兔脑组织血流总量及其分配的改变，并探讨这种变化的发生机理。方法 静脉注射内毒素造成动物内毒素血症，用放射性生物微球法检测注射中和性抗rhTNF单克隆抗体前后脑组织血流量的变化。结果 (1)内毒素组的左右半侧脑组织平均血流量及脑干、脑桥血流量均显著低于对照组(P<0.01)；(2)无关抗体组的左右半侧脑组织平均血流量及脑干、脑桥血流量均显著低于抗体保护组(P<0.01)。结论 严重内毒素血症可致脑血流量减少及脑组织内部血流分配紊乱，而抗rhTNF单克隆抗体可予以有效纠正。
[中图分类号]R 503 [文献标识码] A
, 百拇医药
[文章编号]1002-1949(2000)07-0390-02
Effects of anti-rhTNF monoclinal antibody on the blood flow among and within the brain of endotoxemia rabbits
ZHU Ming-guang,XIE Shu-li,WU Xing-yu
(Laboratory of Applied Physiology,Jilin Military Medical College,Jilin 132013,China)
[Abstract]Objective To measure tissue blood flow distribition and the effects of anti-rhTNF McAb on the distribution of blood flow among and within the brain of endotoxemia rabbits.Methods Endotoxemia was produced by venous endotoxin injection.Radio-labeled-biomicrosphere technique was adapted to measure blood flow distribution.Results (1)The average blood flow in both sides of brain and pallium in endotoxemia group was significantly lower than those of control group(P<0.01).(2)The average blood flow in both sides of brain and pallium in non-relative McAb group was remarkbly lower than that of anti-rhTNF McAb group.Conclusion This experiment suggests that endotoxemia can result in the reduction of brain blood flow and blood distribution,which can be effectively corrected by anti-rhTNF McAb.
, 百拇医药
[Key words]Endotoxemia; Blood flow distribution; Anti-rhTNF McAb
脑是机体的生命中枢，脑功能障碍将严重地影响机体的生命活动。脑功能维持依赖于充足的血液供应，任何原因引起的脑血流总量及其在脑组织内部分配的异常都将损害脑功能。严重内毒素血症是引起脑血流异常的常见原因。在内毒素血症状态下，机体组织器官的血流量重新分布，脑、心等生命器官的血流量增多，皮肤、内脏等部位的血流量减少，以保障重要脏器的血液供应。这种器官间的血流分配调节以往已有很多报道[1]，但器官内部尤其是脑组织内部血流分配调节的研究却很少见。内毒素对机体的很多损伤作用，目前倾向于认为主要是通过内毒素诱发机体所产生的内源性细胞因子所介导[2，3]。本实验拟观察严重内毒素血症状态下，家兔脑组织内部血流分布的变化及注射抗肿瘤坏死因子单克隆抗体(anti-rhTNF McAb)后的保护作用，并探讨这种变化及保护作用的发生机理。
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1 材料与方法
1.1 实验动物及手术准备 纯种大耳白兔，体重2.3±0.3 kg，雌雄不限，戊巴比妥钠(30 mg/kg)静注麻醉，施行气管插管及机械通气支持。一侧颈总动脉插管，连接三通开关，用以测量血压和采血。开胸暴露左心耳。
1.2 放射性生物微球的制备 取蟾蜍血1 ml，肝素抗凝，加还原剂氯化亚锡0.25 ml，温浴5 min，再加入5%乙二胺四乙酸钠0.25 ml，继续温浴1 min。离心后将红细胞制成混悬液，用激发态锝(99mTc)标记，福尔马林固化，最后制成99mTc-FRBC生物微球悬液[4]。
1.3 组织血流量测定 将99mTc-FRBC经左心耳注入体循环，最终栓塞于毛细血管，依据其在毛细血管处的堆积量计算器官血流量。各部位血流量计算式为：
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Q＝Qs.Tcpm/Scpm (1)
式中，Q＝局部血流量(ml/min/g)，Qs＝参考血样本量(ml/min)，Tcpm＝组织标本的cpm数，Scpm＝平均2 ml血样本的cpm数。
1.4 实验分组及处理 28只动物随机分成四组，每组7只，内毒素(ET)组于实验前24 h首次接受内毒素注射，用大肠杆菌内毒素(Escherichia Coli O26:B6 Lipopoly Saccharide Sigma Co.USA NO.L-3254)以注射水配制成0.5 g/L溶液，经耳缘静脉注入，剂量为0.1 mg/kg。对照(C)组注入等量注射用水。次日，手术后再行第二次ET注射，剂量同前。抗体保护组(anti-rhTNF McAb)与无关抗体组(anti-IL-2 McAb)的ET用量及用法同前。抗体保护组于每次ET攻击前30 min注入纯化的anti-rhTNF McAb(由第四军医大学免疫教研室提供)，用量为5 mg/kg；无关抗体组注入抗白细胞介素-2单抗(也由第四军医大学免疫教研室提供)，用法同前。实验过程各组随机排定。
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1.5 实验步骤 手术准备后，从颈总动脉采取参考血标本2 ml，用蠕动泵控制流速(2 ml/min)。在开始抽取血标本10 s后，即从左心耳注入99mTc-FRBC悬液，用量0.4 ml/kg，20 s内注完，每毫升悬液约含FRBC 5×107。15 min后抽取静脉血2 ml。放血急速处死动物，取脑组织标本及动、静脉血样本置计数管内，用γ计数器(北京核仪器厂)检测放射量，进而计算脑组织的平均血流量及大脑皮层和脑干等部位的血流量。
1.6 统计学处理 数据以
±s表示，组间比较用t检验。2 结果
2.1 实验动物一般状况 首次ET注射后，动物出现拒食、竖毛等反应。有些动物有腹泻、体温升高等表现。术后动物血压若低于10.7 kPa则弃之不用，即生物微球注入前血压必须保持在10.7 kPa以上，注入后心率、血压均无显著变化。
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2.2 脑组织血流量的改变 取动物脑组织，生理盐水冲洗干净。先测量大脑左右半球的放射性，而后剥离大脑皮层，测皮层和脑干的放射性，依式(1)计算器官血流量。其血流分配情况见附表。从附表中可见，大脑左右半球血流量十分接近，说明所采用的技术方法稳定可靠。ET组脑组织的平均血流均显著低于C组(P<0.01)；无关抗体组显著低于抗体保护组(P<0.01)。大脑皮层及脑干平均血流量及无关抗体组无显著差异(P<0.05)，但均显著低于C组。皮层及脑干血流量占脑血流总量的百分比，ET组显著低于C组(P<0.05)。表明脑组织内部血流分配紊乱。抗体保护组各测量指标接近C组，表明抗rhTNF单抗能对抗内毒素所致的脑血流量减少，并能有效地纠正血流分配紊乱。
Table 1 Blood flow among different parts of brain measured
by radio-labeled-biomicrosphere(ml/min/g-1)(
±s，n=7) Group, 百拇医药
left brain
right brain
pallium
brainstem
control
0.37+0.15
0.66+0.17
1.21+0.23
0.79+0.17
endotoxin
0.43+0.05**
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0.45+0.04**
0.94+0.16**
0.67+0.10**
anti-rhTNF McAb
0.71+0.18
0.69+0.17
1.18+0.20
0.77+0.19
anti-IL-2 McAb
0.31+0.10＃＃
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0.31+0.11＃＃
0.91+0.17＃＃
0.69+0.11＃＃
**P<0.01 compared with control group
＃＃P<0.01 compared with anti-rhTNF McAb groupTable 2 Blood distribution ratio of pallium and brainstem vs.
total brain blood flow mesaured by radio-labeled
-biomicrosphere(%)(
±s，n=7) Brain parts, http://www.100md.com
control
endotoxin
anti-rhTNF McAb
anti-IL-2 McAb
pallium
31±6
26±5**
30±6
27±7＃
brainstem
16±5
, 百拇医药 11±5*
15±4
10±4＃＃
*P<0.05 **P<0.01 compared with control group
＃P<0.05 ＃＃P<0.01 compared with anti-rhTNF McAb group
3 讨论
本实验用99mTc标记蛙红细胞制成放射性生物微球，用以测量家兔局部器官组织血流量及血流量分配变化。方法简便，结果稳定。
脑功能正常的维持除需组织血液灌流量正常外，还需要血液在脑组织的分配正常。血液在器官间和器官内的分布取决于血管口径的大小。生理状态下，机体通过神经-体液和局部代谢等方面因素对组织血流量及其分配进行着精确的调控，而血管壁对上述调控因素的反应性正常则是精确调节的前提。从本实验结果看，内毒素组脑血流总量、大脑皮层及脑干血流量均明显低于正常组，这表明大脑不仅有血流总量的异常，而且还有内部血流分配的异常。机体对异常的刺激因素具有一定程度的代偿能力，但这种代偿能力有一定限度。超出代偿能力的刺激会引起机体失代偿，从而出现病理反应。严重内毒素血症构成了对血管系统的广泛损伤，血管失去了正常的代偿反应能力[6]，因而脑组织平均血流量减少，脑组织内部血流分配紊乱。大脑皮层是高度分化的组织，极易受缺血、缺氧的影响，供血不足时可能出现神情冷漠和意识障碍。脑干是呼吸和循环中枢所在地，供血量减少则使其机能受损。如呼吸血压不能保持稳定，则会危及生命。
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近年来的研究表明，内源性细胞因子在机体对细菌内毒素产生的反应中起重要的中介作用[6]。内毒素血症时，内毒素对血管紧张度调节功能的破坏作用很可能是由TNF介导的。TNF通过趋化和激活粒细胞等途径损伤血管内皮细胞，使之发生结构和功能上的异常改变[5]。血管内皮细胞构成了血流与血管壁平滑肌之间的屏障。当这一屏障遭到破坏时，血流中的某些化学物质和激素必将直接作用于血管平滑肌，使其调节功能紊乱。本实验使用中和性抗体，阻断了内毒素所致的脑血流量减少和分布异常，提示TNF在脑血流异常中起重要作用。
[参考文献]
[1]Wyler F, Stalder G, Hof RP, et al. Effects of endotoxin on distribution of cardiac output in unanesthetized rabbits[J]. American J Physiol, 1970, 219:246-249.
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[2]Cerami A, Buetler. The role of cachectin/TNF in endotoxic shock and cachecxia[J]. Immunol Today, 1988, 9:28-31.
[3]Tracey KJ, Cerami A. Tumor necrosis factor:an updated review of its biology[J]. Crit Care Med, 1993, 21:s415-420.
[4]王辅才.51Cr或99Tc标记蛙红细胞测量动物器官局部血流量.见：叶维新主编实验核医学技术[M].长春：吉林科学技术出版社，1991.79-81.
[5]Battafarano RJ. Dunn DL. Contribution of local cytokine production to the system host septic response[J].Crit Care Med, 1994, 22(1):7-8.
[6]Gamble JR, Harlan JM, Klebanoff SJ, et al. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant factor[J]. Pro Natl Sci USA, 1985, 82:8667-8671.
收稿：1999-07-12，修回：2000-01-20, 百拇医药