家族性腺瘤性息肉病患者亲属的筛选
胡念平 晏仲舒 郭漫红 吕新生 詹文华
摘 要 目的 对家族性腺瘤性息肉病患者的高危亲属进行筛选, 以其早期发现及治疗无症状的致病基因携带者。方法 在明确家族性腺瘤性息肉病家系基因型后，提取其高危亲属外周血的脱氧核糖核酸(DNA)，检测该突变部位。结果 3例在15号外显子上发现突变家族性腺瘤性息肉病患者的高危亲属中，有1例检出致病基因，为携带者；2例未检出致病基因，为正常人。结论 对家族性腺瘤性息肉病患者及高危亲属的严格管理可将诊断年龄提早，并可在适当的时候进行预防性手术，以降低家族性腺瘤性息肉病的癌变率、病死率。
关键词：家族性腺瘤性息肉病 基因 多聚酶链反应
家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP)是一种常染色体显性遗传病，FAP患者的子女有50% 的可能性携带致病基因[1]。国外报道其外显率几乎高达100%，所以一般认为一旦携带致病基因，几乎全部的患者均会出现症状直至癌变[2]。目前对FAP的先证者经临床诊断后，常动员其高危亲属定期就诊和肠镜检查。这样，导致全部一级亲属(包括未遗传致病基因的那部分正常人)均需行反复肠镜检查，其经济负担重且十分痛苦。而且需要在患者已出现病变及临床症状时方能诊断，所以常导致漏诊和延误病情。随着分子生物学技术的发展，基因筛选诊断已给我们提供了一个更先进的诊断方法[3]。它是诊断无临床表现的FAP致病基因携带者最准确的方法之一[4]。通过对FAP患者进行家系管理可早期发现致病基因携带者，从而对其进行重点监控，早期进行预防性外科手术。而非致病基因携带者则可免除不必要的定期筛查。从而达到减轻患者及家属的经济负担和减少患者痛苦的目的[5]。
, 百拇医药
材料与方法
一. 检测样本
提取3例已知15号外显子突变位置和类型的FAP患者[6] (经临床确诊和分子生物学检查发现突变)的高危亲属外周血单个核细胞的DNA；1名男性，2名女性；平均年龄23.3(18～31)岁。
二. 多聚酶链反应(PCR)
反应总体积20 μL，其中分别加入：10X Biotech Buffer 2.0 μL，2 mM dNTPs 2.0 μL，25 mM MgCl2 1.2 μL，上下游引物1∶1混匀 0.4 μL，Ampli Taq酶0.2 μL，去离子水9.2 μL，25 ng/μL 模板DNA 5.0 μL，加石蜡油25 μL防蒸发。
反应条件：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30个循环。PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶中电泳。
, 百拇医药
三. 特异性扩增引物
所有PCR所需引物列表1。
表1 PCR扩增位置及引物设计序列
样本
上游引物
下游引物
2 号
5' CAGCAGTGTCACAGCACCCTA 3'
5' ACAGCTTTGTGCCTGGCTGAT 3'
7 号
5' AACTACCATCCAGCAACAGA 3'
, 百拇医药
5' GGCTGACACTTCTTCCATG 3'
4 号
5' TTTTCAAGATGTAGTTCATTA 3'
5' TCCAATCTTTTCTTTTATTTC 3'
结 果
一. 2号家系基因型
突变位于第15号外显子中第1 344号密码子，类型为点突变：CAG→TAG。亲属(患者女儿，18岁)样本对其家系突变区域进行PCR扩增时，仅出现一条正常条带，而患者出现正常条带(91bp)的同时，有一条异常条带(86bp)。表示她未遗传致病基因，为正常人(图1)。
二. 7号家系基因型
, 百拇医药
突变位于第15号外显子中第882号密码子，类型为点突变：CGA→TGA。亲属(患者弟弟，31岁)样本对其家系突变区域进行PCR扩增时，患者出现正常条带(92bp)的同时，另有一条异常条带(83bp)。而其亲属也出现两条条带，表示他遗传了致病基因，为致病基因携带者(图2)。
三. 4号家系基因型
突变位于第15号外显子中第1 292号密码子后，类型为插入突变：TAGGA。患者的女儿(21岁)样本对其突变区域进行PCR扩增时，患者出现正常条带(94bp)的同时，另有一条异常条带(99bp)。而其亲属仅出现一条正常条带。表示她未遗传母亲的致病基因，为正常人(图3)。
3例阳性FAP患者的高危亲属中，有2例为非致病基因携带者，1例为致病基因携带者。
, 百拇医药
讨 论
在每年新发FAP患者中，仅有25%的病例为新突变的FAP患者，其他均为FAP患者亲属中致病基因携带者发展成为患者[2]。对于先证者，目前尚无较好的方法对其进行诊断。一般须待先证者出现临床症状后，依靠患者病史、体征、体格检查(特别是肛查)以及纤维肠镜检查方能诊断。由于对先证者无法在未出现临床症状时诊断，常导致诊断延迟。有统计发现FAP患者到20岁时，有5%已发展成恶性肿瘤[8]。要早期诊断此类先证者，应在发现他的肠外表现，如骨瘤、纤维瘤、先天性视网膜色素上皮肥大(congenital hypertrophy of the retinal pigment epithelium，CHRPE)等时，及时行肠镜检查。一经诊断应尽快手术。由于FAP的肠外表现较易被忽视, 患者常不能引起足够的重视，这些都可导致诊断耽误。所以对FAP的管理重点在于使FAP的亲属能提前诊断，并使亲属中的正常人免除不必要的定期检查，减轻其痛苦。当基因诊断发现致病基因携带者，应用肠镜密切随诊患者，发现息肉应尽早手术[7]。由于该手术损伤大，将影响排尿、排便和性功能，患者年轻时一般都拒绝手术，如果患者当时尚无临床症状，息肉小于5～10 mm而且有随诊条件的可适当延迟手术，当息肉大于此范围时应动员其手术治疗，因为息肉大于1 cm时约47%的患者可能癌变，而直径超过2～3 cm时通常已经癌变了[8]。
, 百拇医药
本试验通过对3例已知突变基因型的FAP家系，进行高危亲属筛选，检出1例致病基因携带者。试验后对其进行肠镜检查，发现结直肠大量息肉，证实为FAP。而另2例试验阴性，对这类病例，过去建议在18岁、25岁和35岁时进行肠镜检查以避免误差。现在随着实验室技术的成熟，误差减少，试验阴性就可考虑免于肠镜检查。
用分子生物学方法对FAP家系进行筛选，在西方国家已广泛应用，并显示出很好的效果。如芬兰、荷兰和英国等对FAP家系进行登记管理，使癌变发生率降至10%以下[9]。而非致病基因携带者又可免除不必要的定期筛查。从而大大减轻患者的负担和痛苦。
作者单位：胡念平(510080 广州，中山医科大学附属第一医院胃肠胰外科)
詹文华(510080 广州，中山医科大学附属第一医院胃肠胰外科)
郭漫红(510080 广州，中山医科大学附属第一医院儿科)
, 百拇医药
晏仲舒(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院)
吕新生(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院)
参考文献
1，Petersen GM, Shohat T, Brown J, et al. Genetic counseling for familial adenomatous polyposis (FAP) with chromosome 5q linkage information. (Abstract) Am J Hum Genet 1989;45 (Suppl.):A125.
2，Bisgaard ML, Fenger K, Bulow S, et al. Familial adenomatous polyposis (FAP): frequency, penetrance, and mutation rate. Hum Mutat 1994;3:121-125.
, 百拇医药
3，Friedl W, Mandl M, Sengteller M, et al. Single step screening method for the most common mutations in familial adenomatous polyposis coli. Hum Mol Genet 1993;2:1481-1482.
4，Dunlop MG, Wyllie AH, Nakamura Y, et al. Genetic linkage map of six polymorphic DNA markers around the gene for familial adenomatous polyposis of chromosome 5. Am J Hum Genet 1990;47:982-987.
5，Bhattacharyya N, Banerjee S. A variant of DNA polymerase beta acts as a dominant negative mutant. Proc Natl Acad Sci 1997;94:10324-10329.
, 百拇医药
6，胡念平,晏仲舒.截短蛋白检测用于家族性腺瘤性息肉病的基因诊断(初步报告).中国普通外科杂志 2000；9：230-233.
7，Mills SJ, Chapman PD. Endoscopic screening and surgery for familial adenomatous polyposis: dangerous delays. Bri J Surg 1997;84:74-77.
8，José GG, Andrew JS, Jorge PC. Gastrointestinal polyposis syndrome. Curr Probl Surg 1999;36:221-323.
9，Powell SM, Petersen GM, Krush AJ,et al. Molecular diagnosis of familial adenomatous polyposis. N Engl J Med 1993;329:1982-1985., http://www.100md.com
摘 要 目的 对家族性腺瘤性息肉病患者的高危亲属进行筛选, 以其早期发现及治疗无症状的致病基因携带者。方法 在明确家族性腺瘤性息肉病家系基因型后，提取其高危亲属外周血的脱氧核糖核酸(DNA)，检测该突变部位。结果 3例在15号外显子上发现突变家族性腺瘤性息肉病患者的高危亲属中，有1例检出致病基因，为携带者；2例未检出致病基因，为正常人。结论 对家族性腺瘤性息肉病患者及高危亲属的严格管理可将诊断年龄提早，并可在适当的时候进行预防性手术，以降低家族性腺瘤性息肉病的癌变率、病死率。
关键词：家族性腺瘤性息肉病 基因 多聚酶链反应
家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP)是一种常染色体显性遗传病，FAP患者的子女有50% 的可能性携带致病基因[1]。国外报道其外显率几乎高达100%，所以一般认为一旦携带致病基因，几乎全部的患者均会出现症状直至癌变[2]。目前对FAP的先证者经临床诊断后，常动员其高危亲属定期就诊和肠镜检查。这样，导致全部一级亲属(包括未遗传致病基因的那部分正常人)均需行反复肠镜检查，其经济负担重且十分痛苦。而且需要在患者已出现病变及临床症状时方能诊断，所以常导致漏诊和延误病情。随着分子生物学技术的发展，基因筛选诊断已给我们提供了一个更先进的诊断方法[3]。它是诊断无临床表现的FAP致病基因携带者最准确的方法之一[4]。通过对FAP患者进行家系管理可早期发现致病基因携带者，从而对其进行重点监控，早期进行预防性外科手术。而非致病基因携带者则可免除不必要的定期筛查。从而达到减轻患者及家属的经济负担和减少患者痛苦的目的[5]。
, 百拇医药
材料与方法
一. 检测样本
提取3例已知15号外显子突变位置和类型的FAP患者[6] (经临床确诊和分子生物学检查发现突变)的高危亲属外周血单个核细胞的DNA；1名男性，2名女性；平均年龄23.3(18～31)岁。
二. 多聚酶链反应(PCR)
反应总体积20 μL，其中分别加入：10X Biotech Buffer 2.0 μL，2 mM dNTPs 2.0 μL，25 mM MgCl2 1.2 μL，上下游引物1∶1混匀 0.4 μL，Ampli Taq酶0.2 μL，去离子水9.2 μL，25 ng/μL 模板DNA 5.0 μL，加石蜡油25 μL防蒸发。
反应条件：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30个循环。PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶中电泳。
, 百拇医药
三. 特异性扩增引物
所有PCR所需引物列表1。
表1 PCR扩增位置及引物设计序列
样本
上游引物
下游引物
2 号
5' CAGCAGTGTCACAGCACCCTA 3'
5' ACAGCTTTGTGCCTGGCTGAT 3'
7 号
5' AACTACCATCCAGCAACAGA 3'
, 百拇医药
5' GGCTGACACTTCTTCCATG 3'
4 号
5' TTTTCAAGATGTAGTTCATTA 3'
5' TCCAATCTTTTCTTTTATTTC 3'
结 果
一. 2号家系基因型
突变位于第15号外显子中第1 344号密码子，类型为点突变：CAG→TAG。亲属(患者女儿，18岁)样本对其家系突变区域进行PCR扩增时，仅出现一条正常条带，而患者出现正常条带(91bp)的同时，有一条异常条带(86bp)。表示她未遗传致病基因，为正常人(图1)。
二. 7号家系基因型
, 百拇医药
突变位于第15号外显子中第882号密码子，类型为点突变：CGA→TGA。亲属(患者弟弟，31岁)样本对其家系突变区域进行PCR扩增时，患者出现正常条带(92bp)的同时，另有一条异常条带(83bp)。而其亲属也出现两条条带，表示他遗传了致病基因，为致病基因携带者(图2)。
三. 4号家系基因型
突变位于第15号外显子中第1 292号密码子后，类型为插入突变：TAGGA。患者的女儿(21岁)样本对其突变区域进行PCR扩增时，患者出现正常条带(94bp)的同时，另有一条异常条带(99bp)。而其亲属仅出现一条正常条带。表示她未遗传母亲的致病基因，为正常人(图3)。
3例阳性FAP患者的高危亲属中，有2例为非致病基因携带者，1例为致病基因携带者。
, 百拇医药
讨 论
在每年新发FAP患者中，仅有25%的病例为新突变的FAP患者，其他均为FAP患者亲属中致病基因携带者发展成为患者[2]。对于先证者，目前尚无较好的方法对其进行诊断。一般须待先证者出现临床症状后，依靠患者病史、体征、体格检查(特别是肛查)以及纤维肠镜检查方能诊断。由于对先证者无法在未出现临床症状时诊断，常导致诊断延迟。有统计发现FAP患者到20岁时，有5%已发展成恶性肿瘤[8]。要早期诊断此类先证者，应在发现他的肠外表现，如骨瘤、纤维瘤、先天性视网膜色素上皮肥大(congenital hypertrophy of the retinal pigment epithelium，CHRPE)等时，及时行肠镜检查。一经诊断应尽快手术。由于FAP的肠外表现较易被忽视, 患者常不能引起足够的重视，这些都可导致诊断耽误。所以对FAP的管理重点在于使FAP的亲属能提前诊断，并使亲属中的正常人免除不必要的定期检查，减轻其痛苦。当基因诊断发现致病基因携带者，应用肠镜密切随诊患者，发现息肉应尽早手术[7]。由于该手术损伤大，将影响排尿、排便和性功能，患者年轻时一般都拒绝手术，如果患者当时尚无临床症状，息肉小于5～10 mm而且有随诊条件的可适当延迟手术，当息肉大于此范围时应动员其手术治疗，因为息肉大于1 cm时约47%的患者可能癌变，而直径超过2～3 cm时通常已经癌变了[8]。
, 百拇医药
本试验通过对3例已知突变基因型的FAP家系，进行高危亲属筛选，检出1例致病基因携带者。试验后对其进行肠镜检查，发现结直肠大量息肉，证实为FAP。而另2例试验阴性，对这类病例，过去建议在18岁、25岁和35岁时进行肠镜检查以避免误差。现在随着实验室技术的成熟，误差减少，试验阴性就可考虑免于肠镜检查。
用分子生物学方法对FAP家系进行筛选，在西方国家已广泛应用，并显示出很好的效果。如芬兰、荷兰和英国等对FAP家系进行登记管理，使癌变发生率降至10%以下[9]。而非致病基因携带者又可免除不必要的定期筛查。从而大大减轻患者的负担和痛苦。
作者单位：胡念平(510080 广州，中山医科大学附属第一医院胃肠胰外科)
詹文华(510080 广州，中山医科大学附属第一医院胃肠胰外科)
郭漫红(510080 广州，中山医科大学附属第一医院儿科)
, 百拇医药
晏仲舒(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院)
吕新生(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院)
参考文献
1，Petersen GM, Shohat T, Brown J, et al. Genetic counseling for familial adenomatous polyposis (FAP) with chromosome 5q linkage information. (Abstract) Am J Hum Genet 1989;45 (Suppl.):A125.
2，Bisgaard ML, Fenger K, Bulow S, et al. Familial adenomatous polyposis (FAP): frequency, penetrance, and mutation rate. Hum Mutat 1994;3:121-125.
, 百拇医药
3，Friedl W, Mandl M, Sengteller M, et al. Single step screening method for the most common mutations in familial adenomatous polyposis coli. Hum Mol Genet 1993;2:1481-1482.
4，Dunlop MG, Wyllie AH, Nakamura Y, et al. Genetic linkage map of six polymorphic DNA markers around the gene for familial adenomatous polyposis of chromosome 5. Am J Hum Genet 1990;47:982-987.
5，Bhattacharyya N, Banerjee S. A variant of DNA polymerase beta acts as a dominant negative mutant. Proc Natl Acad Sci 1997;94:10324-10329.
, 百拇医药
6，胡念平,晏仲舒.截短蛋白检测用于家族性腺瘤性息肉病的基因诊断(初步报告).中国普通外科杂志 2000；9：230-233.
7，Mills SJ, Chapman PD. Endoscopic screening and surgery for familial adenomatous polyposis: dangerous delays. Bri J Surg 1997;84:74-77.
8，José GG, Andrew JS, Jorge PC. Gastrointestinal polyposis syndrome. Curr Probl Surg 1999;36:221-323.
9，Powell SM, Petersen GM, Krush AJ,et al. Molecular diagnosis of familial adenomatous polyposis. N Engl J Med 1993;329:1982-1985., http://www.100md.com