改善肿瘤抗原呈递研制新型细胞瘤苗
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国外医学肿瘤学分册 2000年6月第27卷第3期
改善肿瘤抗原呈递研制新型细胞瘤苗
天津医科大学(天津300070) 于津浦(综述) 闫燕华(审校)
摘 要 肿瘤细胞普遍存在抗原呈递障碍，因此利用新型细胞瘤苗改善肿瘤特异性抗原或相关性抗原的呈递过程，可成功地免疫识别并排斥肿瘤。目前实验用新型瘤苗包括基因改造的瘤细胞、瘤抗原肽/基因负载的专职APC、杂交瘤苗，为肿瘤生物治疗提供了希望。
关键词：抗原呈递 细胞瘤苗 抗瘤免疫
肿瘤的免疫治疗作为恶性肿瘤综合治疗的重要组成部分，日益受到人们的重视和关注。在几种免疫治疗方案中，利用以细胞为基础的瘤苗进行的主动免疫疗法，近年来正逐渐成为免疫学家和肿瘤学家的研究热点。细胞瘤苗的高免疫原性可以诱导宿主产生强大的特异性抗肿瘤免疫，阻止肿瘤的形成、生长、扩散和复发，甚至消除现存肿瘤。而其低毒性和非致瘤性则进一步保证了临床应用的安全可靠。
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最原始的细胞瘤苗是经简单物理、化学或生物技术灭活处理过的自身肿瘤细胞，但即使伴以佐剂接种病人也疗效甚微。大量实验已证实，大多数肿瘤，即使是免疫原性很弱的自发性肿瘤细胞表面也表达有肿瘤排斥性抗原(TSA)，但为何无法诱导机体产生有效的抗肿瘤免疫应答呢？抗原呈递过程的“双信号模式”提供了合理的解释。“双信号模式”指出，要想获得最佳的免疫细胞活化效果，在抗原呈递过程中至少要提供两个活化信号：第一活化信号是由靶细胞或抗原呈递细胞(APC)表面抗原肽-MHC分子复合体与免疫细胞(T细胞)表面TCR-CD3发生特异性结合而产生的；第二活化信号则是由细胞表面的多种协同刺激分子(如B7、ICAM-1、LFA-3等)与免疫细胞表面相应受体(如CD28、LFA-1、CD2等)结合后产生的。此外，某些Th细胞来源的细胞因子，如IL-2等在此过程中亦起重要作用，也被称为第二活化信号。在缺乏第二活化信号的情况下，单纯第一活化信号不仅无法启动特异性免疫应答，反而会造成免疫耐受，甚至引起相应克隆的免疫细胞凋亡。
肿瘤组织存在若干影响抗原呈递的因素，包括肿瘤抗原免疫原性弱、易调变；瘤细胞表面MHC分子表达下调；瘤细胞表面缺乏多种协同刺激分子；使瘤细胞无法将内源性的TSA/TAA信号传递给特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞，无法活化相应克隆，影响机体产生特异性的抗瘤排斥反应，造成肿瘤在体内不断生长，并广泛播散，最终影响多脏器功能。
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所以，要成功地免疫识别并排斥肿瘤，关键是改善肿瘤抗原呈递过程，这也是构建新型细胞瘤苗的基本指导思想。根据抗原呈递的双信号模式和MHC限制原则，经过基因工程技术和杂交瘤技术，目前已研制并广泛应用于各种动物和临床试验的细胞瘤苗有以下三大类。
一、经基因改造的肿瘤自身细胞
利用转基因技术纠正瘤细胞普遍存在的两类活化信号缺陷，以改善信号传递过程。
(一)改进第一活化信号的传递
Tanaka的研究发现在无免疫原性的肿瘤细胞，如BL6，MCA101、MCA102中检测不到MHC-Ⅰ类分子，但当用已转染了MHC-Ⅰ类分子H-2KK基因的BL6细胞免疫小鼠后，可获得特异性的抗肿瘤免疫。Hui和James等在ARK小鼠白血病细胞系K36.16(H-2K-)中的实验结果显示,当转染H-2KK基因以重建其MHC-Ⅰ类分子后,其致瘤性降低,免疫原性增加.用该转染体对同系小鼠进行免疫,可抵御野生型K36.16的再次攻击。
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大量研究证明，抗肿瘤免疫是由CD8+T和CD4+T细胞共同参与完成的，且CD4+细胞在此过程中起着不可或缺的关键作用。作为CD4分子的天然配体的MHC-Ⅱ类分子， 除可呈递外原性抗原外，同样可呈递内原性抗原，如TSA/TAA。而MHC-Ⅱ类分子在大多数肿瘤表面不表达，尤其是弱免疫原性肿瘤。Ostrand-Rosenberg用MHC-Ⅱ类基因转染小鼠肉瘤细胞Sal(缺乏MHC-Ⅱ类分子表达)后再给同系A/J小鼠进行腹腔和皮下接种，发现转染后Sal细胞不仅丧失致瘤性，而且经免疫的A/J小鼠在其后野生型Sal的再次攻击中受到保护。Chen等亦发现，共同表达了MHC-Ⅰ类分子(H-2KK)和MHC-Ⅱ类分子(H-2AK)的小鼠黑色素瘤细胞K1735(K1735/AK/KK)才能诱导C3H小鼠产生强烈的针对K1735黑色素瘤的排斥反应，且这种特异性抗肿瘤免疫同时需要CD4+T和CD8+T细胞的参与。
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(二)改善第二活化信号的传递
对于大多数有一定免疫原性的肿瘤细胞而言，MHC分子的缺陷并不严重，而表面协同刺激分子的缺乏是造成抗原呈递失败的关键。因此上调肿瘤细胞表面多种协同刺激分子的表达，加强第二活化信号的传递，是改善抗原呈递过程最切实有效的方法。
目前认为在众多的协同刺激分子中，B7/CD28的作用最重要。B7家族至少包括两个成员：B7-1(CD80)和B7-2(CD86)，均属于免疫球蛋白超家族。B7-1是由262个氨基酸组成的跨膜糖蛋白，分子量约44～45kD，主要表达于活化B细胞、树突状细胞(DC)、朗汉期细胞、活化单核细胞及活化T细胞表面。B7-2的分子结构和基因结构均与B7-1极为相似，在静止的T、B细胞表面即有少量表达，而活化后B7-2表达水平迅速提高，与B7-1相比，峰值出现早，表达量高。B7-1和B7-2拥有共同的受体，为恒定表达于T细胞表面的CD28和仅活化T细胞表面存在的CTLA-4。当B7与CD28结合时，可产生第二活化信号。在第一活化信号存在的情况下，使相应CD4+细胞和CD8+细胞克隆活化、增殖，并增加细胞表面多种粘附分子(如CD40L)的表达，加强细胞间相互作用。同时促进细胞内多种CK基因，主要是IL-2的表达，并稳定IL-2mRNA，从而推动整个免疫反应级联向纵深发展，当T细胞克隆活化后至一定程度后，膜表面CTLA-4开始表达。由于CTLA-4与B7的亲和力明显高于CD28，故B7更倾向于与CTLA-4结合，二者结合后，CTLA-4可通过直接诱导免疫细胞凋亡，或通过与CD28竞争配体B7而阻止保护因子(如bxl-xL)的上调，进而间接降低反应强度，保持整个免疫应答的平衡[1]。
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肿瘤细胞表面普遍缺乏B7的表达。Chen等[2]用CTLA-4Ig对多株鼠源性肿瘤细胞系做间接免疫染色发现，除部分B淋巴瘤外，均未检出B7表达。Hell-strom等通过免疫组化方法检测到多种人类恶性肿瘤均不能与B7-1A和B7-2的特异性单克隆抗体结合。故利用基因转染和(或)转导方法将编码B7分子的基因引入肿瘤细胞，重建肿瘤细胞的第二活化信号传递系统，可提高其免疫原性，并诱导宿主产生特异性抗肿瘤免疫，可提高其免疫原性，并诱导宿主产生特异性抗肿瘤免疫。相应实验已在多种肿瘤细胞系(包括黑色素瘤细胞系K1735，鼠肉瘤细胞系Sal，结肠癌细胞系MC38等)中得到验证。研究发现，经B7cDNA转染后肿瘤细胞表现出低致瘤性和高免疫原性，可诱导机体产生强效的特异性抗肿瘤免疫，不仅清除植入的转染细胞，而且可保护免疫宿主免受其后未转染的野生瘤细胞的攻击，甚至可以治愈荷瘤宿主体内肿瘤，明显延长其生存时间，减少转移[3，4]。
虽然B7治疗在一些肿瘤中获得成功，但有实验提示，B7分子并不是制约肿瘤特异性免疫反应强度的唯一因素。Chen[5]和Yang[6]均发现肿瘤本身的免疫原性直接影响B7转染对特异性抗肿瘤免疫反应的改善。免疫原性强的肿瘤细胞经B7转染后效果改善较好。Baskar[7]和Ostrand Rosenberg[8]将MHC-Ⅱ尖分子和B7分子的编码基因共同引入肿瘤细胞，可产生较单纯B7转染体更强的抗瘤免疫反应。Cavallo[9]用B7-1和ICAM cDNA转染一株无免疫原性肿瘤细胞系，成功获得了免疫识别和免疫排斥，并建立免疫记忆。Lindauer等[10]用基因转染使人结直肠癌细胞系SW480同时表达B7-1、HLA-DR3和ICAM-1，可有效地诱导T细胞增殖，用此多基因转染体进行重复刺激可产生针对亲本SW480的CD8+CTL。Tanaka[11]将IFN-γ和B7-1基因共同引入弱免疫原性肿瘤MCA-102、B16、LLC后可使自发肿瘤消退。以上实验结果提示，对于免疫原性弱的肿瘤细胞，多基因转移(包括MHC基因、协同刺激分子基因、CK基因)可能会产生最佳的抗肿瘤效果。
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二、经肿瘤抗原肽/抗原编码基因负载的专职APC
经基因改造的肿瘤细胞具有一定抗原呈递功能，但并不是最佳的细胞瘤苗构型。已证明基因改造后的肿瘤细胞虽具备向特异性CD4+细胞直接呈递抗原的能力，但对于特异性CD8+，必须通过专职APC(包括DC和巨噬细胞等)来间接呈递TSA/TAA，即所谓“交叉激活”模式(cross-priming)。因此表达MHC结合的肿瘤抗原肽的专职APC较基因改造的瘤细胞似乎具备更强的CTL活化效果。
在众多的专职APC中，DC备受青睐。成熟的DC表面表达有大量的MHC分子(包括MHCⅠ类和MHCⅡ类分子)及MHC-多肽复合物，并表达高水平的与T细胞活化相关的协同刺激分子和多种粘附分子，如B7-1、B7-2、ICAM-1 CD50、CD40等。它还能克服IL-10的抑制作用，并合成和分泌高水平IL-12，促进局部和全身免疫应答。与其他专职APC相比，DC不仅可活化已被抗原致敏的非童贞T细胞，还能够在体内和体外激活纯真T细胞(包括CD4+和CD8+)，因此，被认为是机体内最有效的抗原呈递细胞，也是最理想的肿瘤抗原载体[12]。目前以DC为基础的瘤苗有两大类。
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(一)抗原肽负载
用人工合成或瘤组织分离到癌基因表达产物或是已知TSA/TAA在体外与DC共同孵育使肿瘤抗原肽与DC表面的MHC-Ⅱ类分子紧密结合，以实现肿瘤抗原肽的间接呈递。Porgador[13]利用骨髓来源DC装配上MGC-Ⅰ限制性OVA多肽后，在体外诱导出的CD8+CTL可特异性识别并杀伤表达该多肽表位的肿瘤细胞；在体内一次免疫即可产生强大的保护性，使其抵抗表达OVA的瘤细胞(EG7-OVA)的二次攻击。
但由于至今大多数肿瘤最有效的T细胞识别表位并不清楚，因此，直接利用未经分离的肿瘤组织提取物进行负载更具实用价值。此法不要求确定具体的抗原识别表位，可广泛适用于多种肿瘤，并可避免发生某些变异株或缺陷株的免疫逃逸和继发转移，确保抗瘤免疫的全面和强效。Zitvogel[14]用骨髓来源的DC与肿瘤组织的酸性浸出液共同孵育获得致敏DC，在弱免疫原性肿瘤模型(MCA205和TS/A)中，5×105剂量的致敏DC即可显著抑制4～8天的荷瘤鼠的肿瘤生长。在免疫原性稍强的肿瘤模型(C3)中，则可使荷瘤14天的B6小鼠的肿瘤完全消退，并100%长期存活。
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(二)基因负载
利用基因转移方法可以有效地将目的基因导入CD34+细胞或成熟的DC细胞中，并使其稳定表达。Reeves将黑色素瘤基因MART-1引入CD34+细胞，分化为DC后有22%～28%表达目的基因。导入目的基因的DC在体外能明显刺激人CTL释放IFN-γ等细胞因子，并提高自体CTL的杀瘤能力。
与肿瘤抗原肽负载相比，用cDNA或总RNA进行DC负载不仅可降低肿瘤组织的需要量，而且可以提高或纯化TSA/TAA在DC表面的浓度，减少未分离的肿瘤提取物负载DC后可能引发自身免疫反应发生的机会，提高抗肿瘤免疫的强度。Boczkowski[15]发现，用编码OVA的RNA转导DC细胞后可在体外刺激出强烈的原发性CTL反应，其反应强度要高于单纯的OVA肽负载的DC所能引起的CTL反应。若将表达OVA肿瘤细胞未经纯化的总RNA对DC进行负载的话，亦可产生与单纯OVA负载DC同样的刺激CTL的活性。体内实验同时发现，用肿瘤细胞的总RNA负载的DC可诱导出强大的抗肿瘤免疫反应，免疫后小鼠在同种肿瘤细胞再次攻击时不发病。即使是在低免疫原性、高转移性的B16/F10.9黑色素瘤模型中,利用总RNA负载DC可有效控制肿瘤转移,明显减少肺部转移瘤结节的数目。因此，用肿瘤细胞的总RNA对DC进行负载是此类细胞瘤苗最有发展前途的方法。
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三、经细胞融合获得同时表达肿瘤抗原肽-MHC复合体和多种协同刺激分子的杂交瘤细胞
细胞融合是将两个基因型不同或基因型相同但组织表型不同的细胞利用生物、物理或化学的方法融成一个新的杂种细胞的过程。融合后的杂种细胞含有两个亲代细胞的染色体，可同时表达两个亲本的遗传特征。因此，如果将特异表达肿瘤抗原的肿瘤细胞与能够高表达抗原呈递过程中重要相关分子的细胞(一般指经典的抗原呈递细胞)进行融合的话，可在一个细胞上同时表达TSA/TAA和多种第二信号分子，纠正肿瘤细胞的双信号缺陷，显著改善肿瘤抗原的呈递过程，诱导特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞活化，进而诱导出强烈的抗肿瘤免疫反应，实现抑瘤，甚至是杀瘤作用。
最早进行此方面实验研究的是Guo[16]。他利用活化B细胞与Wistar大鼠的肝癌细胞BERH-2进行体外融合，经双阳性筛选获得融合细胞，体外继续培养得到杂交细胞系BERH-2-B。该BERH-2-B杂交细胞表面高度表达MHC-Ⅱ、ICAM-1、LFA-1和B7，并提高MHC-Ⅰ的表达量，但缺乏致瘤性。用BERH-2-B接种未接触肿瘤的同系大鼠可获得特异性免疫保护，对荷瘤同系大鼠则可明显延长生存期，甚至消灭肿瘤。其后郭亚军用此方法制备出人肝癌疫苗，并用60Co对融合细胞进行照射处理，发现照射后融合细胞失去增殖能力，但3天之内各种免疫相关表型：MHC-Ⅰ、 MHC-Ⅱ、B7及肿癌抗原GP75均无明显变化，仍可在一段时间内发挥抗原呈递能力，并有效诱发机体的抗肿瘤T细胞免疫反应。此后，国内陈习武[17]又用小鼠黑色素瘤B16与同基因型的活化B细胞进行融合，制备出杂交瘤苗B16.B，经FACS测定其表面分子表达情况，发现B7和H-2Kb表达量明显升高，且生长速度减慢，体内致瘤性显著降低。经丝裂霉素灭活的B16.B不仅在体外能诱发出明显的淋巴细胞增殖反应，促进免疫脾细胞分泌高水平IL-2、IFN-γ和IFN-α，且体内免疫后可在亲代B16攻击时推迟肿瘤发生时间，并延长荷瘤鼠存活期，进一步肯定了此方法对低免疫原性肿瘤的适用性。
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除活化B细胞外，用DC和瘤细胞来制备杂交瘤苗同样引人注目。1997年，Kufe用小鼠MC38与DC进行融合制备杂交瘤苗，取得了与Guo等相似的结果。其后，章卫平[18]等用经GM-CSF基因修饰的DC与小鼠黑色素瘤细胞B16.F10进行融合，产生的杂交瘤苗不仅高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、B7和ICAM-1，同时高表达GM-CSF。该瘤苗不仅可保护50%～78%同系小鼠在野生型B16.F10的再次攻击时不长瘤，而且使37.5%～62.5%的宿主达到长期存活;可更明显减少荷瘤鼠的肺转移结节数目,且50%～62.5%的动物肺表面转移结节完全消失。其他类似的相关实验近年来亦有报道，均从结论上肯定了融合细胞的抗瘤活性[19]。
纵观上述三种新型细胞瘤苗，虽各有优劣，但较传统细胞瘤苗，显示出更强的免疫活性、更高的安全性和更低的危险性，必将成为未来肿瘤生物治疗的重要组成部分。
参考文献
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18 章卫平，曹雪涛，黄欣，等.中华医学杂志，1997，77(1)：39～42
19 Lespagnard L, Mettens P,Verheyden AM, et al.Int J Cancer,1998,76(2):250～258, http://www.100md.com
天津医科大学(天津300070) 于津浦(综述) 闫燕华(审校)
摘 要 肿瘤细胞普遍存在抗原呈递障碍，因此利用新型细胞瘤苗改善肿瘤特异性抗原或相关性抗原的呈递过程，可成功地免疫识别并排斥肿瘤。目前实验用新型瘤苗包括基因改造的瘤细胞、瘤抗原肽/基因负载的专职APC、杂交瘤苗，为肿瘤生物治疗提供了希望。
关键词：抗原呈递 细胞瘤苗 抗瘤免疫
肿瘤的免疫治疗作为恶性肿瘤综合治疗的重要组成部分，日益受到人们的重视和关注。在几种免疫治疗方案中，利用以细胞为基础的瘤苗进行的主动免疫疗法，近年来正逐渐成为免疫学家和肿瘤学家的研究热点。细胞瘤苗的高免疫原性可以诱导宿主产生强大的特异性抗肿瘤免疫，阻止肿瘤的形成、生长、扩散和复发，甚至消除现存肿瘤。而其低毒性和非致瘤性则进一步保证了临床应用的安全可靠。
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最原始的细胞瘤苗是经简单物理、化学或生物技术灭活处理过的自身肿瘤细胞，但即使伴以佐剂接种病人也疗效甚微。大量实验已证实，大多数肿瘤，即使是免疫原性很弱的自发性肿瘤细胞表面也表达有肿瘤排斥性抗原(TSA)，但为何无法诱导机体产生有效的抗肿瘤免疫应答呢？抗原呈递过程的“双信号模式”提供了合理的解释。“双信号模式”指出，要想获得最佳的免疫细胞活化效果，在抗原呈递过程中至少要提供两个活化信号：第一活化信号是由靶细胞或抗原呈递细胞(APC)表面抗原肽-MHC分子复合体与免疫细胞(T细胞)表面TCR-CD3发生特异性结合而产生的；第二活化信号则是由细胞表面的多种协同刺激分子(如B7、ICAM-1、LFA-3等)与免疫细胞表面相应受体(如CD28、LFA-1、CD2等)结合后产生的。此外，某些Th细胞来源的细胞因子，如IL-2等在此过程中亦起重要作用，也被称为第二活化信号。在缺乏第二活化信号的情况下，单纯第一活化信号不仅无法启动特异性免疫应答，反而会造成免疫耐受，甚至引起相应克隆的免疫细胞凋亡。
肿瘤组织存在若干影响抗原呈递的因素，包括肿瘤抗原免疫原性弱、易调变；瘤细胞表面MHC分子表达下调；瘤细胞表面缺乏多种协同刺激分子；使瘤细胞无法将内源性的TSA/TAA信号传递给特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞，无法活化相应克隆，影响机体产生特异性的抗瘤排斥反应，造成肿瘤在体内不断生长，并广泛播散，最终影响多脏器功能。
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所以，要成功地免疫识别并排斥肿瘤，关键是改善肿瘤抗原呈递过程，这也是构建新型细胞瘤苗的基本指导思想。根据抗原呈递的双信号模式和MHC限制原则，经过基因工程技术和杂交瘤技术，目前已研制并广泛应用于各种动物和临床试验的细胞瘤苗有以下三大类。
一、经基因改造的肿瘤自身细胞
利用转基因技术纠正瘤细胞普遍存在的两类活化信号缺陷，以改善信号传递过程。
(一)改进第一活化信号的传递
Tanaka的研究发现在无免疫原性的肿瘤细胞，如BL6，MCA101、MCA102中检测不到MHC-Ⅰ类分子，但当用已转染了MHC-Ⅰ类分子H-2KK基因的BL6细胞免疫小鼠后，可获得特异性的抗肿瘤免疫。Hui和James等在ARK小鼠白血病细胞系K36.16(H-2K-)中的实验结果显示,当转染H-2KK基因以重建其MHC-Ⅰ类分子后,其致瘤性降低,免疫原性增加.用该转染体对同系小鼠进行免疫,可抵御野生型K36.16的再次攻击。
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大量研究证明，抗肿瘤免疫是由CD8+T和CD4+T细胞共同参与完成的，且CD4+细胞在此过程中起着不可或缺的关键作用。作为CD4分子的天然配体的MHC-Ⅱ类分子， 除可呈递外原性抗原外，同样可呈递内原性抗原，如TSA/TAA。而MHC-Ⅱ类分子在大多数肿瘤表面不表达，尤其是弱免疫原性肿瘤。Ostrand-Rosenberg用MHC-Ⅱ类基因转染小鼠肉瘤细胞Sal(缺乏MHC-Ⅱ类分子表达)后再给同系A/J小鼠进行腹腔和皮下接种，发现转染后Sal细胞不仅丧失致瘤性，而且经免疫的A/J小鼠在其后野生型Sal的再次攻击中受到保护。Chen等亦发现，共同表达了MHC-Ⅰ类分子(H-2KK)和MHC-Ⅱ类分子(H-2AK)的小鼠黑色素瘤细胞K1735(K1735/AK/KK)才能诱导C3H小鼠产生强烈的针对K1735黑色素瘤的排斥反应，且这种特异性抗肿瘤免疫同时需要CD4+T和CD8+T细胞的参与。
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(二)改善第二活化信号的传递
对于大多数有一定免疫原性的肿瘤细胞而言，MHC分子的缺陷并不严重，而表面协同刺激分子的缺乏是造成抗原呈递失败的关键。因此上调肿瘤细胞表面多种协同刺激分子的表达，加强第二活化信号的传递，是改善抗原呈递过程最切实有效的方法。
目前认为在众多的协同刺激分子中，B7/CD28的作用最重要。B7家族至少包括两个成员：B7-1(CD80)和B7-2(CD86)，均属于免疫球蛋白超家族。B7-1是由262个氨基酸组成的跨膜糖蛋白，分子量约44～45kD，主要表达于活化B细胞、树突状细胞(DC)、朗汉期细胞、活化单核细胞及活化T细胞表面。B7-2的分子结构和基因结构均与B7-1极为相似，在静止的T、B细胞表面即有少量表达，而活化后B7-2表达水平迅速提高，与B7-1相比，峰值出现早，表达量高。B7-1和B7-2拥有共同的受体，为恒定表达于T细胞表面的CD28和仅活化T细胞表面存在的CTLA-4。当B7与CD28结合时，可产生第二活化信号。在第一活化信号存在的情况下，使相应CD4+细胞和CD8+细胞克隆活化、增殖，并增加细胞表面多种粘附分子(如CD40L)的表达，加强细胞间相互作用。同时促进细胞内多种CK基因，主要是IL-2的表达，并稳定IL-2mRNA，从而推动整个免疫反应级联向纵深发展，当T细胞克隆活化后至一定程度后，膜表面CTLA-4开始表达。由于CTLA-4与B7的亲和力明显高于CD28，故B7更倾向于与CTLA-4结合，二者结合后，CTLA-4可通过直接诱导免疫细胞凋亡，或通过与CD28竞争配体B7而阻止保护因子(如bxl-xL)的上调，进而间接降低反应强度，保持整个免疫应答的平衡[1]。
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肿瘤细胞表面普遍缺乏B7的表达。Chen等[2]用CTLA-4Ig对多株鼠源性肿瘤细胞系做间接免疫染色发现，除部分B淋巴瘤外，均未检出B7表达。Hell-strom等通过免疫组化方法检测到多种人类恶性肿瘤均不能与B7-1A和B7-2的特异性单克隆抗体结合。故利用基因转染和(或)转导方法将编码B7分子的基因引入肿瘤细胞，重建肿瘤细胞的第二活化信号传递系统，可提高其免疫原性，并诱导宿主产生特异性抗肿瘤免疫，可提高其免疫原性，并诱导宿主产生特异性抗肿瘤免疫。相应实验已在多种肿瘤细胞系(包括黑色素瘤细胞系K1735，鼠肉瘤细胞系Sal，结肠癌细胞系MC38等)中得到验证。研究发现，经B7cDNA转染后肿瘤细胞表现出低致瘤性和高免疫原性，可诱导机体产生强效的特异性抗肿瘤免疫，不仅清除植入的转染细胞，而且可保护免疫宿主免受其后未转染的野生瘤细胞的攻击，甚至可以治愈荷瘤宿主体内肿瘤，明显延长其生存时间，减少转移[3，4]。
虽然B7治疗在一些肿瘤中获得成功，但有实验提示，B7分子并不是制约肿瘤特异性免疫反应强度的唯一因素。Chen[5]和Yang[6]均发现肿瘤本身的免疫原性直接影响B7转染对特异性抗肿瘤免疫反应的改善。免疫原性强的肿瘤细胞经B7转染后效果改善较好。Baskar[7]和Ostrand Rosenberg[8]将MHC-Ⅱ尖分子和B7分子的编码基因共同引入肿瘤细胞，可产生较单纯B7转染体更强的抗瘤免疫反应。Cavallo[9]用B7-1和ICAM cDNA转染一株无免疫原性肿瘤细胞系，成功获得了免疫识别和免疫排斥，并建立免疫记忆。Lindauer等[10]用基因转染使人结直肠癌细胞系SW480同时表达B7-1、HLA-DR3和ICAM-1，可有效地诱导T细胞增殖，用此多基因转染体进行重复刺激可产生针对亲本SW480的CD8+CTL。Tanaka[11]将IFN-γ和B7-1基因共同引入弱免疫原性肿瘤MCA-102、B16、LLC后可使自发肿瘤消退。以上实验结果提示，对于免疫原性弱的肿瘤细胞，多基因转移(包括MHC基因、协同刺激分子基因、CK基因)可能会产生最佳的抗肿瘤效果。
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二、经肿瘤抗原肽/抗原编码基因负载的专职APC
经基因改造的肿瘤细胞具有一定抗原呈递功能，但并不是最佳的细胞瘤苗构型。已证明基因改造后的肿瘤细胞虽具备向特异性CD4+细胞直接呈递抗原的能力，但对于特异性CD8+，必须通过专职APC(包括DC和巨噬细胞等)来间接呈递TSA/TAA，即所谓“交叉激活”模式(cross-priming)。因此表达MHC结合的肿瘤抗原肽的专职APC较基因改造的瘤细胞似乎具备更强的CTL活化效果。
在众多的专职APC中，DC备受青睐。成熟的DC表面表达有大量的MHC分子(包括MHCⅠ类和MHCⅡ类分子)及MHC-多肽复合物，并表达高水平的与T细胞活化相关的协同刺激分子和多种粘附分子，如B7-1、B7-2、ICAM-1 CD50、CD40等。它还能克服IL-10的抑制作用，并合成和分泌高水平IL-12，促进局部和全身免疫应答。与其他专职APC相比，DC不仅可活化已被抗原致敏的非童贞T细胞，还能够在体内和体外激活纯真T细胞(包括CD4+和CD8+)，因此，被认为是机体内最有效的抗原呈递细胞，也是最理想的肿瘤抗原载体[12]。目前以DC为基础的瘤苗有两大类。
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(一)抗原肽负载
用人工合成或瘤组织分离到癌基因表达产物或是已知TSA/TAA在体外与DC共同孵育使肿瘤抗原肽与DC表面的MHC-Ⅱ类分子紧密结合，以实现肿瘤抗原肽的间接呈递。Porgador[13]利用骨髓来源DC装配上MGC-Ⅰ限制性OVA多肽后，在体外诱导出的CD8+CTL可特异性识别并杀伤表达该多肽表位的肿瘤细胞；在体内一次免疫即可产生强大的保护性，使其抵抗表达OVA的瘤细胞(EG7-OVA)的二次攻击。
但由于至今大多数肿瘤最有效的T细胞识别表位并不清楚，因此，直接利用未经分离的肿瘤组织提取物进行负载更具实用价值。此法不要求确定具体的抗原识别表位，可广泛适用于多种肿瘤，并可避免发生某些变异株或缺陷株的免疫逃逸和继发转移，确保抗瘤免疫的全面和强效。Zitvogel[14]用骨髓来源的DC与肿瘤组织的酸性浸出液共同孵育获得致敏DC，在弱免疫原性肿瘤模型(MCA205和TS/A)中，5×105剂量的致敏DC即可显著抑制4～8天的荷瘤鼠的肿瘤生长。在免疫原性稍强的肿瘤模型(C3)中，则可使荷瘤14天的B6小鼠的肿瘤完全消退，并100%长期存活。
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(二)基因负载
利用基因转移方法可以有效地将目的基因导入CD34+细胞或成熟的DC细胞中，并使其稳定表达。Reeves将黑色素瘤基因MART-1引入CD34+细胞，分化为DC后有22%～28%表达目的基因。导入目的基因的DC在体外能明显刺激人CTL释放IFN-γ等细胞因子，并提高自体CTL的杀瘤能力。
与肿瘤抗原肽负载相比，用cDNA或总RNA进行DC负载不仅可降低肿瘤组织的需要量，而且可以提高或纯化TSA/TAA在DC表面的浓度，减少未分离的肿瘤提取物负载DC后可能引发自身免疫反应发生的机会，提高抗肿瘤免疫的强度。Boczkowski[15]发现，用编码OVA的RNA转导DC细胞后可在体外刺激出强烈的原发性CTL反应，其反应强度要高于单纯的OVA肽负载的DC所能引起的CTL反应。若将表达OVA肿瘤细胞未经纯化的总RNA对DC进行负载的话，亦可产生与单纯OVA负载DC同样的刺激CTL的活性。体内实验同时发现，用肿瘤细胞的总RNA负载的DC可诱导出强大的抗肿瘤免疫反应，免疫后小鼠在同种肿瘤细胞再次攻击时不发病。即使是在低免疫原性、高转移性的B16/F10.9黑色素瘤模型中,利用总RNA负载DC可有效控制肿瘤转移,明显减少肺部转移瘤结节的数目。因此，用肿瘤细胞的总RNA对DC进行负载是此类细胞瘤苗最有发展前途的方法。
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三、经细胞融合获得同时表达肿瘤抗原肽-MHC复合体和多种协同刺激分子的杂交瘤细胞
细胞融合是将两个基因型不同或基因型相同但组织表型不同的细胞利用生物、物理或化学的方法融成一个新的杂种细胞的过程。融合后的杂种细胞含有两个亲代细胞的染色体，可同时表达两个亲本的遗传特征。因此，如果将特异表达肿瘤抗原的肿瘤细胞与能够高表达抗原呈递过程中重要相关分子的细胞(一般指经典的抗原呈递细胞)进行融合的话，可在一个细胞上同时表达TSA/TAA和多种第二信号分子，纠正肿瘤细胞的双信号缺陷，显著改善肿瘤抗原的呈递过程，诱导特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞活化，进而诱导出强烈的抗肿瘤免疫反应，实现抑瘤，甚至是杀瘤作用。
最早进行此方面实验研究的是Guo[16]。他利用活化B细胞与Wistar大鼠的肝癌细胞BERH-2进行体外融合，经双阳性筛选获得融合细胞，体外继续培养得到杂交细胞系BERH-2-B。该BERH-2-B杂交细胞表面高度表达MHC-Ⅱ、ICAM-1、LFA-1和B7，并提高MHC-Ⅰ的表达量，但缺乏致瘤性。用BERH-2-B接种未接触肿瘤的同系大鼠可获得特异性免疫保护，对荷瘤同系大鼠则可明显延长生存期，甚至消灭肿瘤。其后郭亚军用此方法制备出人肝癌疫苗，并用60Co对融合细胞进行照射处理，发现照射后融合细胞失去增殖能力，但3天之内各种免疫相关表型：MHC-Ⅰ、 MHC-Ⅱ、B7及肿癌抗原GP75均无明显变化，仍可在一段时间内发挥抗原呈递能力，并有效诱发机体的抗肿瘤T细胞免疫反应。此后，国内陈习武[17]又用小鼠黑色素瘤B16与同基因型的活化B细胞进行融合，制备出杂交瘤苗B16.B，经FACS测定其表面分子表达情况，发现B7和H-2Kb表达量明显升高，且生长速度减慢，体内致瘤性显著降低。经丝裂霉素灭活的B16.B不仅在体外能诱发出明显的淋巴细胞增殖反应，促进免疫脾细胞分泌高水平IL-2、IFN-γ和IFN-α，且体内免疫后可在亲代B16攻击时推迟肿瘤发生时间，并延长荷瘤鼠存活期，进一步肯定了此方法对低免疫原性肿瘤的适用性。
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除活化B细胞外，用DC和瘤细胞来制备杂交瘤苗同样引人注目。1997年，Kufe用小鼠MC38与DC进行融合制备杂交瘤苗，取得了与Guo等相似的结果。其后，章卫平[18]等用经GM-CSF基因修饰的DC与小鼠黑色素瘤细胞B16.F10进行融合，产生的杂交瘤苗不仅高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、B7和ICAM-1，同时高表达GM-CSF。该瘤苗不仅可保护50%～78%同系小鼠在野生型B16.F10的再次攻击时不长瘤，而且使37.5%～62.5%的宿主达到长期存活;可更明显减少荷瘤鼠的肺转移结节数目,且50%～62.5%的动物肺表面转移结节完全消失。其他类似的相关实验近年来亦有报道，均从结论上肯定了融合细胞的抗瘤活性[19]。
纵观上述三种新型细胞瘤苗，虽各有优劣，但较传统细胞瘤苗，显示出更强的免疫活性、更高的安全性和更低的危险性，必将成为未来肿瘤生物治疗的重要组成部分。
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