斑点热群立克次体中国分离株HL-93和HLJ-054亲缘关系的研究
陈敏 张健之 毕德增 范明远 陈香蕊
摘 要：目的 通过斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsiae，SFGR)rOmpA基因片段的序列分析对HL-93和HLJ-054的亲缘关系进行研究。方法 用PCR分段扩增rOmpA基因重复区后1.9kb片段，PCR产物直接测序，用Winstar DNA分析软件包进行同源性比较、进化树分析及酶切位点的分析。 结果 HL-93株和HLJ-054株核苷酸及推定氨基酸的同源性均在99%以上，在树形图上单独聚为一类。常用酶的酶切位点完全一致。结论 HL-93株和HLJ-054株为同一种SFGR，建议均命名为黑龙江立克次体，但可能存在株间差异性。
关键词：斑点热群立克次体 rOmpA基因片段
, 百拇医药
近年，由于分离检测技术的提高及人们对节肢动物传播疾病的关注，新的致病及非致病性斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsiae，SFGR)不断被发现。迄今，在国际上除已证实有10余种对人有致病性以外，尚有10余种仅从媒介和宿主动物中分离，对人的致病性有待证实[1]。中国斑点热的研究历时40年，已在媒介蜱、动物宿主及病人中分离到20余株SFGR。目前，经分子生物学的鉴定初步将其分为4种SFGR，分别是：黑龙江立克次体、虎林立克次体、内蒙古立克次体和西伯利亚立克次体。其中内蒙古立克次体由于在基因型与抗原上与在马赛Latimone医院发现的病人分离株相同，又称R.mongolotimonae，该立克次体已被证实是SFGR的新成员[1，2]。黑龙江立克次体(HLJ-054)于1982年从黑龙江绥芬河地区的森林革蜱中分离，该种立克次体经鉴定认为是SFGR的新成员[3]。但直到1998年才从该地区发热病人中分离到病原体[4]。结果表明：黑龙江立克次体对人具有致病性。虎林立克次体(HL-93)于1993年在黑龙江虎林地区的嗜群血蜱中分离成功，在抗原型和基因型上也与已知SFGR不同，被认为是新种，但对人的致病性尚未证实[5]。以前的研究表明这2株SFGR在基因型及蛋白图谱上有相似之处[6，7]。为了进一步探讨这2株SFGR的亲缘关系，我们在对其rOmpA蛋白基因起始部位进行序列分析的基础上，又对其重复区后1.9kb片段进行了序列分析。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 实验用立克次体菌株 斑点热群立克次体国际标准株立氏立克次体(R.rickettsii)R株获自军事医学科学院。HLJ-054株系沈阳军事医学科研所1982年自黑龙江省绥汾河地区的森林革蜱中分离，由军事医学科学院惠赠。HL-93株系中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所1993年自黑龙江省虎林地区的嗜群血蜱中分离。
1.2 PCR 常规方法提取立克次体DNA。PCR分段扩增rOmpA基因片段。引物Rr190.3653p-4585n(5ATTTTGGAGCCAGGAGTACT3，5CTCCAAG-TTCTAATTTACCTG3)根据立氏立克次体rOmpA基因设计，Rr 190.4442p-5664n(5CGATAGCCGG-AGGCAAGACGT，5TGCAAGCG-GTCCACCCGGTGC3)，来自文献[8]，由中国科学院微生物所合成。PCR反应条件为：94℃预变性10min，进入热循环：94℃变性1min，55℃复性40s，72℃延伸1min，共30个循环，最后一个循环于72℃延伸5min。取10μl PCR产物进行1.5%琼脂糖—溴化乙锭(0.5μg/ml)凝胶电泳检测。
, http://www.100md.com
图1 斑点热群立克次体rOmpA基因PCR结果
1.pBR322/Hinf Ⅰ分子量标准；2，5立氏立克次体；
3，6.HLJ-054；4，7.HL-93；8.空白对照
(2～4：引物Rr190.4442p-5664n扩增结果；5～7：引物Rr190.3653p-4585n扩增结果)
Fig.1 PCR amplification of rOmpA gene of SFGR
1.pBR322/Hinf I Markers 2，5 R.rickettsii 3，6.HLJ-054
4，7.HL-93 8.Control without template
, http://www.100md.com
(2～4：aplification with Rr 190.4442p-5664n primers；5～7：amplification with Rr190.3653p-4585n)
1.3 序列测定及分析 采用荧光标记双脱氧末端终止法对PCR产物进行直接测序，在373A型自动测序仪(ABI公司)上进行，由中国科学院微生物所完成。与GenBank中相关菌株的相应序列进行比较，用Winstar DNA分析软件包进行同源性比较、进化树分析及HLJ-054株和HL-93株株rOmpA基因片段的酶切位点分析。
2 结 果
2.1 PCR 用引物Rr190.3653p-4585n进行PCR扩增产生931bp预期大小片段，引物Rr190.4442p-5664n扩增产生1.2Rb片段。
2.2 序列同源性分析，树形图和酶切位点分析
, http://www.100md.com
表1 SFGR各株rOmpA基因片段的核苷酸和推定氨基酸同源性比较(%)
Table 1 Homologous comparison of nucleotide and putative amino acid of rOmpA gene fragment of SFGR
Rr
054
HL93
Rp
Rc
Rs
Rm
Rr
, http://www.100md.com
100
95.53
93.23
95.84
94.62
95.08
95.23
054
96.93
100
99.23
93.69
93.38
, 百拇医药
92.62
92.92
HL93
96.77
99.69
100
93.69
92.92
92.77
93.38
Rp
97.90
97.23
, 百拇医药
97.18
100
96.15
96.62
96.15
Rc
94.49
96.82
96.67
98.57
100
95.54
93.85
, 百拇医药
Rs
97.60
96.62
96.67
98.67
98.16
100
97.69
Rm
97.08
96.06
96.93
98.41
, 百拇医药
97.64
98.77
100
Note：1.Rr＝R.rickettsii；Rp＝R.parkeri；Rc＝R.conorii；Rs＝R.sibirica；Rm＝R.mongolotimonae
2.The left sides are the homologous comparison of rOmpA gene fragment and the right sides are the homologous comparison of putative amino acid of rOmpA gene fragment of SFGR
, 百拇医药
图2 SFGR各株rOmpA基因序列比较树状图
Fig.2 Phylogenetic tree of SFGR inferred from comparison of the rOmpA gene sequence
3 讨 论
斑点热群立克次体是一群与蜱或螨等节肢动物有密切关系的专性细胞内寄生菌。因此在一般细菌所见的基因交换现象在立克次体的基因进化作用上不明显。但在蜱内可能存在有斑点热群立克次体(SFGR)与埃利希体、柯克斯体及疏螺旋体的共同感染，这些可能对SFGR的进化有一定影响。另外，在立克次体的进化过程中，立克次体可能暴露于一定的选择压力中，这种压力来自于影响节肢动物和啮齿类动物的因素。虽然立克次体在节肢动物与啮齿类动物间具有水平传递现象，但立克次体主要通过蜱的垂直传播得以保持种的延续。这种立克次体和节肢动物间关系的性质表明立克次体的进化可能受节肢动物因素的影响较动物宿主多[9]。
, 百拇医药
16SrRNA、枸橼酸合成酶基因(gltA)虽已用于进行立克次体亲缘关系的研究，但由于它们进化慢，种间同源性较高，难以获得较稳定的种间发生学的研究[10，11]。rOmpA是SFGR的外膜蛋白，因其可能参与SFGR的免疫和致病过程而引起大家的关注，该蛋白几乎存在于所有的SFGR中。通过PCR、PCR/RFLP研究发现其编码基因在种间的变异较16SrRNA和gltA高，因此该基因被认为是研究种间进化的首选基因。目前立氏立克次体R株和康氏立克次体Malish 7株rOmpA基因的全序列已经清楚。
HLJ-054株和HL-93株是来自两个相邻地区不同蜱种的分离株，被认为是SFGR的新成员，以前的研究对HLJ-054株和HL-93株rOmpA基因起始部位533bp的序列分析和比较发现，在所有的SFGR中HLJ-054株与HL-93株在核苷酸同源性及推定氨基酸的同源性上最高，分别为98.12%，94.92%。两者在该段的PCR/RFLP图谱完全相同，蛋白图谱除在212～116kD范围内不同外，主带型基本相同[6，7]。在本次研究中，通过对HLJ-054株和HL-93株rOmpA基因重复区后1.9bp片段进行了序列分析、进化树及酶切位点的分析，结果显示两株核苷酸及推定氨基酸的同源性在99%以上，在树形图上单独聚为一类。常用酶的酶切位点也完全一致。尽管尚需进一步对rOmpA基因重复区进行多态性分析，但根据目前研究结果，我们认为HL-93株和HLJ-054株为同一种SFGR，建议命名为黑龙江立克次体(R.heilongjiangii)，该种立克次体可能存在株间差异性。
, http://www.100md.com
本研究为国家自然科学基金资助项目.项目编号39770041
陈敏(中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所 北京，102206)
张健之(中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所 北京，102206)
毕德增(中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所 北京，102206)
范明远(中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所 北京，102206)
陈香蕊(军事医学科学院微生物和流行病研究所)
参考文献
1，Raoult D and Roux V.Rickettsioses as paradigms of new or emerging infectious diseases[J].Clin Microbiol Rev，1997，10(4)：694.
, http://www.100md.com
2，范明远，张健之，陈敏，等.中国斑点热立克次体病[J].中国人兽共患病杂志，1999，15(5)：223.
3，娄丹，吴益民，王宾，等.斑点热立克次体的一个新成员——黑龙江立克次体分离鉴定[J].中华微生物学和免疫学杂志，1985，(5)：250.
4，吴益民，魏安明，胡玲美，等.从病人血液分离的斑点热群立克次体HLJ-H5株的鉴定[J].中国人兽共患病学杂志，1998，14(6)：23.
5，张健之，范明远，毕德增，等.斑点热群立克次体新种的分离和鉴定[J].中国人兽共患病学杂志，1996，12(5)：2.
6，陈敏，范明远，毕德增，等.福建省斑点热群立克次体的检测、分离和鉴定[J].中华微生物学和免疫学杂志，1997，17(6)：433.
, http://www.100md.com 7，陈敏，范明远，毕德增，等.斑点热群立克次体中国分离株基因片段的克隆及序列分析[J].微生物学报，1998，38(4)：276.
8，Regnery RL，Spruil CL，Plikaytis B.Genotypic identification of rickettsiae and estimation of intraspecies sequence divergence for portions of two rickettsial genes[J].J Bacteriol.173，1576～1589.
9，Fournier PE and Raoult D.Phylogenetic analysis of spotted fever group rickettsiae by study of the outer surface protein r0mpA[J].Int J Sys Bacteriol，1998，48：839.
10，Roux V and Raoult D.Phylogenetic analysis of the genus Rickettsia by 16 S rDNA sequencing[J].Res Microbiol，1995，146：385.
11，Roux V，Rydkina E，Eremeeva M.et al.Citrate synthase gene comparison，a new tool for phylogenetic analysis and its application for the rickettsiae[J].Int J Syst Bacteriol，1996，47：252., 百拇医药
摘 要：目的 通过斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsiae，SFGR)rOmpA基因片段的序列分析对HL-93和HLJ-054的亲缘关系进行研究。方法 用PCR分段扩增rOmpA基因重复区后1.9kb片段，PCR产物直接测序，用Winstar DNA分析软件包进行同源性比较、进化树分析及酶切位点的分析。 结果 HL-93株和HLJ-054株核苷酸及推定氨基酸的同源性均在99%以上，在树形图上单独聚为一类。常用酶的酶切位点完全一致。结论 HL-93株和HLJ-054株为同一种SFGR，建议均命名为黑龙江立克次体，但可能存在株间差异性。
关键词：斑点热群立克次体 rOmpA基因片段
, 百拇医药
近年，由于分离检测技术的提高及人们对节肢动物传播疾病的关注，新的致病及非致病性斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsiae，SFGR)不断被发现。迄今，在国际上除已证实有10余种对人有致病性以外，尚有10余种仅从媒介和宿主动物中分离，对人的致病性有待证实[1]。中国斑点热的研究历时40年，已在媒介蜱、动物宿主及病人中分离到20余株SFGR。目前，经分子生物学的鉴定初步将其分为4种SFGR，分别是：黑龙江立克次体、虎林立克次体、内蒙古立克次体和西伯利亚立克次体。其中内蒙古立克次体由于在基因型与抗原上与在马赛Latimone医院发现的病人分离株相同，又称R.mongolotimonae，该立克次体已被证实是SFGR的新成员[1，2]。黑龙江立克次体(HLJ-054)于1982年从黑龙江绥芬河地区的森林革蜱中分离，该种立克次体经鉴定认为是SFGR的新成员[3]。但直到1998年才从该地区发热病人中分离到病原体[4]。结果表明：黑龙江立克次体对人具有致病性。虎林立克次体(HL-93)于1993年在黑龙江虎林地区的嗜群血蜱中分离成功，在抗原型和基因型上也与已知SFGR不同，被认为是新种，但对人的致病性尚未证实[5]。以前的研究表明这2株SFGR在基因型及蛋白图谱上有相似之处[6，7]。为了进一步探讨这2株SFGR的亲缘关系，我们在对其rOmpA蛋白基因起始部位进行序列分析的基础上，又对其重复区后1.9kb片段进行了序列分析。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 实验用立克次体菌株 斑点热群立克次体国际标准株立氏立克次体(R.rickettsii)R株获自军事医学科学院。HLJ-054株系沈阳军事医学科研所1982年自黑龙江省绥汾河地区的森林革蜱中分离，由军事医学科学院惠赠。HL-93株系中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所1993年自黑龙江省虎林地区的嗜群血蜱中分离。
1.2 PCR 常规方法提取立克次体DNA。PCR分段扩增rOmpA基因片段。引物Rr190.3653p-4585n(5ATTTTGGAGCCAGGAGTACT3，5CTCCAAG-TTCTAATTTACCTG3)根据立氏立克次体rOmpA基因设计，Rr 190.4442p-5664n(5CGATAGCCGG-AGGCAAGACGT，5TGCAAGCG-GTCCACCCGGTGC3)，来自文献[8]，由中国科学院微生物所合成。PCR反应条件为：94℃预变性10min，进入热循环：94℃变性1min，55℃复性40s，72℃延伸1min，共30个循环，最后一个循环于72℃延伸5min。取10μl PCR产物进行1.5%琼脂糖—溴化乙锭(0.5μg/ml)凝胶电泳检测。
, http://www.100md.com
图1 斑点热群立克次体rOmpA基因PCR结果
1.pBR322/Hinf Ⅰ分子量标准；2，5立氏立克次体；
3，6.HLJ-054；4，7.HL-93；8.空白对照
(2～4：引物Rr190.4442p-5664n扩增结果；5～7：引物Rr190.3653p-4585n扩增结果)
Fig.1 PCR amplification of rOmpA gene of SFGR
1.pBR322/Hinf I Markers 2，5 R.rickettsii 3，6.HLJ-054
4，7.HL-93 8.Control without template
, http://www.100md.com
(2～4：aplification with Rr 190.4442p-5664n primers；5～7：amplification with Rr190.3653p-4585n)
1.3 序列测定及分析 采用荧光标记双脱氧末端终止法对PCR产物进行直接测序，在373A型自动测序仪(ABI公司)上进行，由中国科学院微生物所完成。与GenBank中相关菌株的相应序列进行比较，用Winstar DNA分析软件包进行同源性比较、进化树分析及HLJ-054株和HL-93株株rOmpA基因片段的酶切位点分析。
2 结 果
2.1 PCR 用引物Rr190.3653p-4585n进行PCR扩增产生931bp预期大小片段，引物Rr190.4442p-5664n扩增产生1.2Rb片段。
2.2 序列同源性分析，树形图和酶切位点分析
, http://www.100md.com
表1 SFGR各株rOmpA基因片段的核苷酸和推定氨基酸同源性比较(%)
Table 1 Homologous comparison of nucleotide and putative amino acid of rOmpA gene fragment of SFGR
Rr
054
HL93
Rp
Rc
Rs
Rm
Rr
, http://www.100md.com
100
95.53
93.23
95.84
94.62
95.08
95.23
054
96.93
100
99.23
93.69
93.38
, 百拇医药
92.62
92.92
HL93
96.77
99.69
100
93.69
92.92
92.77
93.38
Rp
97.90
97.23
, 百拇医药
97.18
100
96.15
96.62
96.15
Rc
94.49
96.82
96.67
98.57
100
95.54
93.85
, 百拇医药
Rs
97.60
96.62
96.67
98.67
98.16
100
97.69
Rm
97.08
96.06
96.93
98.41
, 百拇医药
97.64
98.77
100
Note：1.Rr＝R.rickettsii；Rp＝R.parkeri；Rc＝R.conorii；Rs＝R.sibirica；Rm＝R.mongolotimonae
2.The left sides are the homologous comparison of rOmpA gene fragment and the right sides are the homologous comparison of putative amino acid of rOmpA gene fragment of SFGR
, 百拇医药
图2 SFGR各株rOmpA基因序列比较树状图
Fig.2 Phylogenetic tree of SFGR inferred from comparison of the rOmpA gene sequence
3 讨 论
斑点热群立克次体是一群与蜱或螨等节肢动物有密切关系的专性细胞内寄生菌。因此在一般细菌所见的基因交换现象在立克次体的基因进化作用上不明显。但在蜱内可能存在有斑点热群立克次体(SFGR)与埃利希体、柯克斯体及疏螺旋体的共同感染，这些可能对SFGR的进化有一定影响。另外，在立克次体的进化过程中，立克次体可能暴露于一定的选择压力中，这种压力来自于影响节肢动物和啮齿类动物的因素。虽然立克次体在节肢动物与啮齿类动物间具有水平传递现象，但立克次体主要通过蜱的垂直传播得以保持种的延续。这种立克次体和节肢动物间关系的性质表明立克次体的进化可能受节肢动物因素的影响较动物宿主多[9]。
, 百拇医药
16SrRNA、枸橼酸合成酶基因(gltA)虽已用于进行立克次体亲缘关系的研究，但由于它们进化慢，种间同源性较高，难以获得较稳定的种间发生学的研究[10，11]。rOmpA是SFGR的外膜蛋白，因其可能参与SFGR的免疫和致病过程而引起大家的关注，该蛋白几乎存在于所有的SFGR中。通过PCR、PCR/RFLP研究发现其编码基因在种间的变异较16SrRNA和gltA高，因此该基因被认为是研究种间进化的首选基因。目前立氏立克次体R株和康氏立克次体Malish 7株rOmpA基因的全序列已经清楚。
HLJ-054株和HL-93株是来自两个相邻地区不同蜱种的分离株，被认为是SFGR的新成员，以前的研究对HLJ-054株和HL-93株rOmpA基因起始部位533bp的序列分析和比较发现，在所有的SFGR中HLJ-054株与HL-93株在核苷酸同源性及推定氨基酸的同源性上最高，分别为98.12%，94.92%。两者在该段的PCR/RFLP图谱完全相同，蛋白图谱除在212～116kD范围内不同外，主带型基本相同[6，7]。在本次研究中，通过对HLJ-054株和HL-93株rOmpA基因重复区后1.9bp片段进行了序列分析、进化树及酶切位点的分析，结果显示两株核苷酸及推定氨基酸的同源性在99%以上，在树形图上单独聚为一类。常用酶的酶切位点也完全一致。尽管尚需进一步对rOmpA基因重复区进行多态性分析，但根据目前研究结果，我们认为HL-93株和HLJ-054株为同一种SFGR，建议命名为黑龙江立克次体(R.heilongjiangii)，该种立克次体可能存在株间差异性。
, http://www.100md.com
本研究为国家自然科学基金资助项目.项目编号39770041
陈敏(中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所 北京，102206)
张健之(中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所 北京，102206)
毕德增(中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所 北京，102206)
范明远(中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所 北京，102206)
陈香蕊(军事医学科学院微生物和流行病研究所)
参考文献
1，Raoult D and Roux V.Rickettsioses as paradigms of new or emerging infectious diseases[J].Clin Microbiol Rev，1997，10(4)：694.
, http://www.100md.com
2，范明远，张健之，陈敏，等.中国斑点热立克次体病[J].中国人兽共患病杂志，1999，15(5)：223.
3，娄丹，吴益民，王宾，等.斑点热立克次体的一个新成员——黑龙江立克次体分离鉴定[J].中华微生物学和免疫学杂志，1985，(5)：250.
4，吴益民，魏安明，胡玲美，等.从病人血液分离的斑点热群立克次体HLJ-H5株的鉴定[J].中国人兽共患病学杂志，1998，14(6)：23.
5，张健之，范明远，毕德增，等.斑点热群立克次体新种的分离和鉴定[J].中国人兽共患病学杂志，1996，12(5)：2.
6，陈敏，范明远，毕德增，等.福建省斑点热群立克次体的检测、分离和鉴定[J].中华微生物学和免疫学杂志，1997，17(6)：433.
, http://www.100md.com 7，陈敏，范明远，毕德增，等.斑点热群立克次体中国分离株基因片段的克隆及序列分析[J].微生物学报，1998，38(4)：276.
8，Regnery RL，Spruil CL，Plikaytis B.Genotypic identification of rickettsiae and estimation of intraspecies sequence divergence for portions of two rickettsial genes[J].J Bacteriol.173，1576～1589.
9，Fournier PE and Raoult D.Phylogenetic analysis of spotted fever group rickettsiae by study of the outer surface protein r0mpA[J].Int J Sys Bacteriol，1998，48：839.
10，Roux V and Raoult D.Phylogenetic analysis of the genus Rickettsia by 16 S rDNA sequencing[J].Res Microbiol，1995，146：385.
11，Roux V，Rydkina E，Eremeeva M.et al.Citrate synthase gene comparison，a new tool for phylogenetic analysis and its application for the rickettsiae[J].Int J Syst Bacteriol，1996，47：252., 百拇医药