双黄连粉针剂抗柯萨奇病毒B3型效应的实验研究
作者：吕海涛 袁志昌 严文华 杨吉成 盛伟华 李丽娥
单位：吕海涛 袁志昌 严文华(215003 苏州医学院附属儿童医院)；杨吉成 盛伟华 李丽娥(苏州医学院基因室)
关键词：双黄连；柯萨奇病毒(B3型)；抗病毒作用
江苏医药000808 【摘要】 目的 探讨双黄连在体外抗柯萨奇病毒(CVB3)的效应。方法 在Wish细胞上采用微量细胞病变抑制法。结果 (1)3.0 mg/ml、1.5 mg/ml双黄连均可直接杀伤100、10 TCID50病毒，且3.0 mg/ml直接灭活CVB3的效应明显。(2)0.5、0.25、0.125 mg/ml双黄连可分别阻断100、10、1TCID50病毒吸附细胞。(3)1.5、0.25、0.25 mg/ml双黄连可分别抑制10、5、1 TCID50病毒在胞内复制。结论 在细胞培养上，双黄连不仅直接杀伤柯萨奇病毒、阻断或减缓病毒吸附细胞的作用明显，而且对细胞内低滴度病毒复制具有一定的抑制作用。
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Study on anti-coxsackie virus B3 Action of shuanghuanglian injection in vitro
LU Haitao，YUAN Zhichang，YAN Wenhua.
(The Affiliated Children Hospital of Suzhou Medical College，Suzhou 215003)
【Abstract】 Objective To investigate the anti-coxsackie virus B3 action of Shanghuanglian(SHHL) injection in vitro.Methods The method of microdose cytopathogenic effect inhibition assay was used in Wish cell cultures.Results (1)SHHL exhibited direct effect on viral particles of 100 TCID50，10 TCID50 at a concentration of 3.0 mg/ml and 1.5 mg/ml；(2)The effective dosages of SHHL to prevent cells from viral infection of 100，10，1 TCID50 were 0.5，0.25，0.125mg/ml，respectively；(3)The effective dosages of SHHL against replication of coxsackie virus B3 of 10，5，1 TCID50 in cultured cells are 1.5，0.25，0.25 mg/ml，respectively.Conclusion SHHL injection exhibited direct effect on viral particles obviously.It not only could prevent viral particles from adsorbing cells，but also inhibited the reproduction of low titers of coxsackie virus in Wish cell cultures.
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【Key words】Shuanghuanglian Coxsackie virus B3 Antiviral action
柯萨奇病毒可经呼吸道和消化道感染人体，常导致呼吸道感染、肠道感染、无菌性脑膜炎、心肌炎、心包炎等疾病。同时，宫内柯萨奇病毒感染也是诱发先天性心脏病的高危因素之一。本世纪国内外数次柯萨奇病毒大流行中小儿和青壮年易感，尤其是婴幼儿，且多累及心脏[1，2]。随着分子杂交技术和心脏活检技术的应用，病毒性心肌炎中病毒持续感染可发展为扩张性心肌病的观点已引起人们足够的重视，因而柯萨奇病毒感染越来越受到关注。
国内有关中药抗柯萨奇病毒的研究多限于单方中药制剂，复方中药制剂也仅限于口服剂型。我们选择静脉用双黄连粉针剂在Wish细胞上进行了抗柯萨奇病毒B3型(CVB3)的实验研究，并进行了机理探讨。
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材料与方法
一、病毒
CVB3(Nancy株)由卫生部病毒性心脏病重点实验室杨英珍教授提供。在Wish细胞上增殖，并用Wish细胞微量TCID50滴定法测定效价[3]，其效价为10-4/0.1 ml。
二、药品
双黄连粉针剂购自哈尔滨中药二厂，600 mg/支，生产批号为970609，使用时用含2%小牛血清的RPMI1640维持液稀释。
三、细胞培养
人羊膜Wish细胞为本院基因室保存。在96孔板上于37℃、5%CO2条件下用含10%小牛血清的RPMI1640培养基传代培养，形成单层后用于实验。
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四、双黄连对细胞的毒性试验
Wish细胞长成单层时，加入不同浓度的双黄连药液，37℃5%CO2培养72小时，每12小时观察细胞形态，并与正常细胞作对照。
五、双黄连抗CVB3病毒作用的确定
Wish细胞长成单层时，实验分三组(1)直接杀伤作用：不同浓度双黄连药液分别与等体积的不同滴度病毒液混合，置37℃恒温培养箱内作用6小时后，混合液接种于Wish细胞上，吸附1小时，去含药病毒液，加维持液，继续培养。(2)对CVB3吸附细胞的阻断作用：不同浓度药液先加入Wish细胞作用2小时后，去药液，再吸附病毒，继续培养。(3)对细胞内CVB3复制的抑制作用：病毒吸附单层细胞1小时后，去病毒液，加入不同浓度药液。各组实验均设正常细胞对照、病毒对照和药物对照组，共同在37℃、5%CO2培养，每隔12小时观察细胞病变(CPE)。待细胞对照、药液对照组细胞生长正常，病毒对照CPE达时判定结果。
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六、双黄连对CVB3所致细胞病变的抑制作用的动态观察
Wish细胞长成单层时，1.0 mg/ml双黄连药液加5 TCID50病毒为观察组，病毒对照组不加药物，各组于37℃、5%CO2继续培养，分别于感染后0、6、12、18和24小时取病毒上清，-20℃冻存后，经冻融一次，再按4倍梯度稀释，每一稀释度接种4孔，在Wish细胞上用微量TCID50法检测各时间点病毒上清的效价。以时间为横坐标，效价(log4TCID50)为纵坐标，如图1所示。
结 果
一、双黄连对细胞的毒性实验
用不同浓度的双黄连药液直接作用于Wish细胞，培养24小时，>6 mg/ml的浓度对细胞有明显的毒性，细胞出现圆缩、脱落及死亡。只有当双黄连浓度降至3.0 mg/ml以下时，对Wish细胞的毒性消失，甚至培养72小时也未出现细胞死亡的毒性反应。
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二、双黄连在抗CVB3引起细胞病变中的作用(见表1)
表1 双黄连在抗CVB3引起细胞病变中的作用 药物
mg/ml
直接杀伤
阻断吸附作用
抑制胞内病毒复制
100**
10***
100*
10**
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1**
10**
5**
1***
3.0
-
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-
-
-
+
+
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1.5
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+
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1.0
+
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+
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0.5
+
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0.25
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0.125
0.0625
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病毒对照
注：(1)带星号的数字均表示攻击病毒滴度(TCID50)；(2)*为12h判定的结果，**为24h判定的结果，***为48h判定的结果。
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如表1所示：(1)直接杀伤作用：3.0 mg/ml 1.5 mg/ml的双黄连药液与等体积病毒液于37℃作用6小时后接种细胞，其病毒感染力明显减弱。当药物浓度为3.0 mg/ml时，100 TCID50病毒攻击细胞24小时CPE为阴性，10 TCID50病毒攻击细胞48小时CPE也为阴性，可推测该浓度有直接灭活CVB3的效应。(2)对CVB3吸附细胞的阻断作用：当药物浓度≥0.5 mg/ml时，长成单层的细胞经药物吸附培养2小时后，可阻断或减轻100 TCID50病毒100 μl所致CPE的产生；随着药物浓度的增加，CPE的程度愈轻，与病毒对照组有明显差异；0.5、0.25、0.125 mg/ml双黄连可分别阻断100、10、1 TCID50病毒吸附Wish细胞。(3)对胞内CVB3复制的抑制作用：单层细胞先吸附病毒1小时后，加入不同浓度双黄连药液，可见双黄连仅对低滴度(≤10 TCID50)CVB3在胞内复制产生一定的抑制作用，在Wish细胞上，1.5、0.25、0.25 mg/ml双黄连可分别抑制10 TCID50、5 TCID50、1 TCID50病毒在胞内复制。
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三、双黄连抑制CVB3所致细胞病变的动态观察(见图1)
图1 双黄连抑制CVB3所致细胞病变的动态观察
图1中病毒滴度的比较可见，实验组各时间点的效价均低于病毒对照组，尤以病毒感染后的第6和12小时两个时间点，双黄连抑制病毒复制的作用最为明显。
讨 论
双黄连是由金银花、黄芩甙和连翘组成的复方中药静脉用制剂。本实验表明：双黄连在体外有较明显的直接灭活CVB3的作用，随着药物剂量的增加，其灭活病毒效应有增强趋势。同时我们发现双黄连还有阻止或减缓CVB3颗粒吸附和侵入细胞的作用。除此外，我们的实验还证明，双黄连在胞内可抑制低滴度CVB的复制。提示该药在病毒感染的上述三个环节上均可发挥作用。
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本实验可见：双黄连的作用环节以细胞外的环节为主，推测双黄连可能与病毒颗粒直接结合或以其它方式作用于病毒，以阻断病毒吸附侵入或者减慢病毒吸附到细胞上的速度，而延迟CPE的出现；对于已进入细胞内进行基因复制的病毒，其抑制作用较弱，通过实验可观察到：双黄连仅能完全抑制5 TCID50和1 TCID50CVB3病毒在细胞内的复制。张兴录等[4]曾报告50 TCID50呼吸道合胞病毒感染hela细胞2小时后，0.5%双黄连仍可发挥作用。据此推测，双黄连可能存在某些未知的作用机制，如进入胞浆后与病毒结合以阻止病毒核酸的合成释放，或诱生某些细胞因子如干扰素等以干扰病毒基因的复制，这些尚待进一步探究。
我们的实验结果表明，双黄连在CVB3感染的不同环节上发挥抗CVB3作用。本结果不仅为双黄连治疗CVB3引起的病毒性心肌炎提供了实验依据，而且对双黄连治疗病毒病的临床应用也有一定的参考价值。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Conaldi PG，Serra C，Mossa A，et al.Persistent infection of human vascular endothelial cells by group B coxsackieviruses.J Infect Dis，1997 Mar，175：693-696.
2，杨英珍，主编.病毒性心肌炎.上海：上海医科大学出版社，1991，19-22.
3，宿燕岗，杨英珍，郭祺.牛磺酸对培养大鼠心肌细胞感染coxsackievirusB3病毒的影响.中国药理学通报，1997，13：56-59.
4，张兴录，张振玲，刘瑞璋.双黄连注射液抗呼吸道合胞病毒的实验研究.中华微生物和免疫学杂志，1988，8：263-264.
收稿：1999-09-17 修回：1999-12-15, 百拇医药
单位：吕海涛 袁志昌 严文华(215003 苏州医学院附属儿童医院)；杨吉成 盛伟华 李丽娥(苏州医学院基因室)
关键词：双黄连；柯萨奇病毒(B3型)；抗病毒作用
江苏医药000808 【摘要】 目的 探讨双黄连在体外抗柯萨奇病毒(CVB3)的效应。方法 在Wish细胞上采用微量细胞病变抑制法。结果 (1)3.0 mg/ml、1.5 mg/ml双黄连均可直接杀伤100、10 TCID50病毒，且3.0 mg/ml直接灭活CVB3的效应明显。(2)0.5、0.25、0.125 mg/ml双黄连可分别阻断100、10、1TCID50病毒吸附细胞。(3)1.5、0.25、0.25 mg/ml双黄连可分别抑制10、5、1 TCID50病毒在胞内复制。结论 在细胞培养上，双黄连不仅直接杀伤柯萨奇病毒、阻断或减缓病毒吸附细胞的作用明显，而且对细胞内低滴度病毒复制具有一定的抑制作用。
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Study on anti-coxsackie virus B3 Action of shuanghuanglian injection in vitro
LU Haitao，YUAN Zhichang，YAN Wenhua.
(The Affiliated Children Hospital of Suzhou Medical College，Suzhou 215003)
【Abstract】 Objective To investigate the anti-coxsackie virus B3 action of Shanghuanglian(SHHL) injection in vitro.Methods The method of microdose cytopathogenic effect inhibition assay was used in Wish cell cultures.Results (1)SHHL exhibited direct effect on viral particles of 100 TCID50，10 TCID50 at a concentration of 3.0 mg/ml and 1.5 mg/ml；(2)The effective dosages of SHHL to prevent cells from viral infection of 100，10，1 TCID50 were 0.5，0.25，0.125mg/ml，respectively；(3)The effective dosages of SHHL against replication of coxsackie virus B3 of 10，5，1 TCID50 in cultured cells are 1.5，0.25，0.25 mg/ml，respectively.Conclusion SHHL injection exhibited direct effect on viral particles obviously.It not only could prevent viral particles from adsorbing cells，but also inhibited the reproduction of low titers of coxsackie virus in Wish cell cultures.
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【Key words】Shuanghuanglian Coxsackie virus B3 Antiviral action
柯萨奇病毒可经呼吸道和消化道感染人体，常导致呼吸道感染、肠道感染、无菌性脑膜炎、心肌炎、心包炎等疾病。同时，宫内柯萨奇病毒感染也是诱发先天性心脏病的高危因素之一。本世纪国内外数次柯萨奇病毒大流行中小儿和青壮年易感，尤其是婴幼儿，且多累及心脏[1，2]。随着分子杂交技术和心脏活检技术的应用，病毒性心肌炎中病毒持续感染可发展为扩张性心肌病的观点已引起人们足够的重视，因而柯萨奇病毒感染越来越受到关注。
国内有关中药抗柯萨奇病毒的研究多限于单方中药制剂，复方中药制剂也仅限于口服剂型。我们选择静脉用双黄连粉针剂在Wish细胞上进行了抗柯萨奇病毒B3型(CVB3)的实验研究，并进行了机理探讨。
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材料与方法
一、病毒
CVB3(Nancy株)由卫生部病毒性心脏病重点实验室杨英珍教授提供。在Wish细胞上增殖，并用Wish细胞微量TCID50滴定法测定效价[3]，其效价为10-4/0.1 ml。
二、药品
双黄连粉针剂购自哈尔滨中药二厂，600 mg/支，生产批号为970609，使用时用含2%小牛血清的RPMI1640维持液稀释。
三、细胞培养
人羊膜Wish细胞为本院基因室保存。在96孔板上于37℃、5%CO2条件下用含10%小牛血清的RPMI1640培养基传代培养，形成单层后用于实验。
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四、双黄连对细胞的毒性试验
Wish细胞长成单层时，加入不同浓度的双黄连药液，37℃5%CO2培养72小时，每12小时观察细胞形态，并与正常细胞作对照。
五、双黄连抗CVB3病毒作用的确定
Wish细胞长成单层时，实验分三组(1)直接杀伤作用：不同浓度双黄连药液分别与等体积的不同滴度病毒液混合，置37℃恒温培养箱内作用6小时后，混合液接种于Wish细胞上，吸附1小时，去含药病毒液，加维持液，继续培养。(2)对CVB3吸附细胞的阻断作用：不同浓度药液先加入Wish细胞作用2小时后，去药液，再吸附病毒，继续培养。(3)对细胞内CVB3复制的抑制作用：病毒吸附单层细胞1小时后，去病毒液，加入不同浓度药液。各组实验均设正常细胞对照、病毒对照和药物对照组，共同在37℃、5%CO2培养，每隔12小时观察细胞病变(CPE)。待细胞对照、药液对照组细胞生长正常，病毒对照CPE达时判定结果。
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六、双黄连对CVB3所致细胞病变的抑制作用的动态观察
Wish细胞长成单层时，1.0 mg/ml双黄连药液加5 TCID50病毒为观察组，病毒对照组不加药物，各组于37℃、5%CO2继续培养，分别于感染后0、6、12、18和24小时取病毒上清，-20℃冻存后，经冻融一次，再按4倍梯度稀释，每一稀释度接种4孔，在Wish细胞上用微量TCID50法检测各时间点病毒上清的效价。以时间为横坐标，效价(log4TCID50)为纵坐标，如图1所示。
结 果
一、双黄连对细胞的毒性实验
用不同浓度的双黄连药液直接作用于Wish细胞，培养24小时，>6 mg/ml的浓度对细胞有明显的毒性，细胞出现圆缩、脱落及死亡。只有当双黄连浓度降至3.0 mg/ml以下时，对Wish细胞的毒性消失，甚至培养72小时也未出现细胞死亡的毒性反应。
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二、双黄连在抗CVB3引起细胞病变中的作用(见表1)
表1 双黄连在抗CVB3引起细胞病变中的作用 药物
mg/ml
直接杀伤
阻断吸附作用
抑制胞内病毒复制
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注：(1)带星号的数字均表示攻击病毒滴度(TCID50)；(2)*为12h判定的结果，**为24h判定的结果，***为48h判定的结果。
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如表1所示：(1)直接杀伤作用：3.0 mg/ml 1.5 mg/ml的双黄连药液与等体积病毒液于37℃作用6小时后接种细胞，其病毒感染力明显减弱。当药物浓度为3.0 mg/ml时，100 TCID50病毒攻击细胞24小时CPE为阴性，10 TCID50病毒攻击细胞48小时CPE也为阴性，可推测该浓度有直接灭活CVB3的效应。(2)对CVB3吸附细胞的阻断作用：当药物浓度≥0.5 mg/ml时，长成单层的细胞经药物吸附培养2小时后，可阻断或减轻100 TCID50病毒100 μl所致CPE的产生；随着药物浓度的增加，CPE的程度愈轻，与病毒对照组有明显差异；0.5、0.25、0.125 mg/ml双黄连可分别阻断100、10、1 TCID50病毒吸附Wish细胞。(3)对胞内CVB3复制的抑制作用：单层细胞先吸附病毒1小时后，加入不同浓度双黄连药液，可见双黄连仅对低滴度(≤10 TCID50)CVB3在胞内复制产生一定的抑制作用，在Wish细胞上，1.5、0.25、0.25 mg/ml双黄连可分别抑制10 TCID50、5 TCID50、1 TCID50病毒在胞内复制。
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三、双黄连抑制CVB3所致细胞病变的动态观察(见图1)
图1 双黄连抑制CVB3所致细胞病变的动态观察
图1中病毒滴度的比较可见，实验组各时间点的效价均低于病毒对照组，尤以病毒感染后的第6和12小时两个时间点，双黄连抑制病毒复制的作用最为明显。
讨 论
双黄连是由金银花、黄芩甙和连翘组成的复方中药静脉用制剂。本实验表明：双黄连在体外有较明显的直接灭活CVB3的作用，随着药物剂量的增加，其灭活病毒效应有增强趋势。同时我们发现双黄连还有阻止或减缓CVB3颗粒吸附和侵入细胞的作用。除此外，我们的实验还证明，双黄连在胞内可抑制低滴度CVB的复制。提示该药在病毒感染的上述三个环节上均可发挥作用。
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本实验可见：双黄连的作用环节以细胞外的环节为主，推测双黄连可能与病毒颗粒直接结合或以其它方式作用于病毒，以阻断病毒吸附侵入或者减慢病毒吸附到细胞上的速度，而延迟CPE的出现；对于已进入细胞内进行基因复制的病毒，其抑制作用较弱，通过实验可观察到：双黄连仅能完全抑制5 TCID50和1 TCID50CVB3病毒在细胞内的复制。张兴录等[4]曾报告50 TCID50呼吸道合胞病毒感染hela细胞2小时后，0.5%双黄连仍可发挥作用。据此推测，双黄连可能存在某些未知的作用机制，如进入胞浆后与病毒结合以阻止病毒核酸的合成释放，或诱生某些细胞因子如干扰素等以干扰病毒基因的复制，这些尚待进一步探究。
我们的实验结果表明，双黄连在CVB3感染的不同环节上发挥抗CVB3作用。本结果不仅为双黄连治疗CVB3引起的病毒性心肌炎提供了实验依据，而且对双黄连治疗病毒病的临床应用也有一定的参考价值。
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参 考 文 献
1，Conaldi PG，Serra C，Mossa A，et al.Persistent infection of human vascular endothelial cells by group B coxsackieviruses.J Infect Dis，1997 Mar，175：693-696.
2，杨英珍，主编.病毒性心肌炎.上海：上海医科大学出版社，1991，19-22.
3，宿燕岗，杨英珍，郭祺.牛磺酸对培养大鼠心肌细胞感染coxsackievirusB3病毒的影响.中国药理学通报，1997，13：56-59.
4，张兴录，张振玲，刘瑞璋.双黄连注射液抗呼吸道合胞病毒的实验研究.中华微生物和免疫学杂志，1988，8：263-264.
收稿：1999-09-17 修回：1999-12-15, 百拇医药