羟喜树碱对人胰腺癌细胞增殖及凋亡的影响
作者：许青 高勇 王杰军 朱长力 王兵 郭静 鲍洪涛
单位：许青(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 200003)；高勇(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 200003)；王杰军(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 200003)；朱长力(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 200003)；王兵(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 200003)
关键词：羟喜树碱；胰腺肿瘤；凋亡；增殖
第二军医大学学报000810 [摘要] 目的：研究羟喜树碱(HCPT)体外抑制人胰腺癌细胞株SW-1990增殖并诱导其凋亡的作用。方法：体外培养的胰腺癌细胞经不同质量浓度(1.562 5， 3.125， 6.25， 12.5， 25，50， 100 μg/ml)的HCPT处理20～24 h后，用MTT法测定细胞增殖情况，再分别以AnnexinⅤ早期凋亡检测试剂盒、电子显微镜、流式细胞术和TUNEL标记以及bcl-2免疫细胞化学标记检测细胞凋亡情况。结果：(1)3.125～100 μg/ml HCPT作用24 h后，肿瘤细胞的增殖抑制率均非常显著高于对照组(P<0.01)。(2) 50 μg/ml HCPT作用20 h后，经流式细胞术及TUNEL标记检测，肿瘤细胞的凋亡率分别为13.2%和15.3%;100 μg/ml HCPT作用20 h后，两种方法检测的细胞凋亡率分别为26.1%和28.4%。 (3) 电镜及AnnexinⅤ标记荧光检测观察表明，50 μg/ml HCPT作用下，肿瘤细胞主要呈早期凋亡表现，凋亡率为18.4%。(4) 50 μg/ml HCPT作用24 h后，肿瘤细胞bcl-2表达较对照组明显减弱。结论：HCPT在体外可抑制SW-1990细胞的增殖，部分作用机制是诱导细胞凋亡;提示HCPT可作为细胞凋亡诱导剂用于胰腺癌的治疗。
, 百拇医药
[中图分类号] R 282.710.5 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)08-0731-03
Effects of hydroxyl camptothecinum on proliferation and apoptosis of human pancreatic cancer cell line
XU Qing GAO Yong WANG Jie-Jun ZHU Chang-Li WANG Bing GUO Jing
(Department of Oncology， Changzheng Hospital， Second Military Medical University， Shanghai 200003，China)
, 百拇医药
BAO Hong-Tao
(Department of Medical Affair Management)
[ABSTRACT] Objective: To study the effect of hydroxyl camptothecinum (HCPT) on proliferation and apoptosis of human pancreatic cancer cell in vitro. Methods: After treated with HCPT at different concentrations (1.562 5， 3.125， 6.25， 12.5， 25， 50， 100 μg/ml) for 20-24 h, the cultured SW-1990 cell proliferation were evaluated by MTT, and apoptosis by Annexin-Ⅴ-fluos staining, electronic microscopy, flow cytometry, bcl-2 immunocytochemical staining and in situ TUNEL (TdT-mediated dUTP-X nick end labeling). Results: (1) The rate of proliferation in each group of 3.125-100 μg/ml was significantly lower than that in the control group (P<0.01) after treated with HCPT for 24 hours. (2) The apoptosis rate of pancreatic cell was 13.2% and 15.3% after treated with HCPT at the concentration of 50 μg/ml for 20 hours, the rate was 26.1% and 28.4% at 100 μg/ml. (3)Annexin-Ⅴ-fluos staining and electronic microscopy detection showed the expression of apoptosis was mainly at the early morphological stage at the concentration of 50 μg/ml and the apoptosis rate of early stage was 18.4%. (4) The expression of bcl-2 were less than the control after treated with HCPT 50 μg/ml for 24 hours. Conclusion: HCPT can depress the proliferation of SW-1990 in vitro, partially through the induction of apoptosis, and HCPT is a potential agent for pancreatic cancer chemotherapy.
, http://www.100md.com
[KEY WORDS] hydroxycamptothecinum; pancreatic neoplasms; apoptosis; proliferation
胰腺癌是一预后极差的恶性肿瘤，目前对其治疗仍缺乏有效的手段。喜树碱类药物是从我国特有的喜树中提取的生物碱，是拓扑异构酶Ⅰ的抑制剂[1]，其在肿瘤防治中的作用及机制已引起众多研究者的关注。研究表明，凋亡的异常是肿瘤发生发展中的一个重要因素，在恶性肿瘤中，细胞凋亡的比例明显降低，如能诱导肿瘤细胞凋亡，使其凋亡的比例增加，则可能遏制肿瘤的发生发展[2, 3]。本研究拟了解羟喜树碱(HCPT)在体外对人胰腺癌细胞株SW-1990增殖的影响及其诱导凋亡的作用，以探讨其在胰腺癌防治中的潜在作用价值。
1 材料和方法
1.1 药物及主要试剂 HCPT注射液(吉林长春天诚药业有限公司提供，批号：吉卫药准字1996第122041号),使用时以DMEM稀释至所需浓度，加入培养的细胞中。MTT为Sigma公司产品，bcl-2免疫细胞化学检测试剂盒为武汉博士德公司进口分装，Annexin Ⅴ荧光显色试剂盒、TUNEL检测试剂盒均为德国宝灵曼公司产品。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 细胞培养与药物处理 人胰腺癌细胞株SW-1990(购自中国科学院细胞研究所)，以含10%小牛血清的DMEM培养液在5% CO2， 37℃条件下培养。细胞接种24 h后，分别加入不同质量浓度(1.562 5，3.125，6.25，12.5，25，50，100 μg/ml)的HCPT，作用20～24 h后，进行各种指标测定。
1.2.2 细胞增殖检测 将SW-1990细胞按1×103 个/孔接种于96孔板，每一浓度设3复孔。加入不同质量浓度的HCPT作用24 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl轻轻晃匀，37℃温育4 h，去除上清液，经吸水纸吸干后，每孔加入DMSO 100 μl，振荡混匀10 min后，用96孔Biolisa酶标仪检测570 nm处的光密度值。
1.2.3 bcl-2免疫细胞化学检测 将SW-1990细胞按1×105个/孔接种于预先置好盖玻片的6孔板中，培养24 h后，加入HCPT作用24 h，取出盖玻片，用生理盐水冲洗后，以4℃预冷的丙酮固定30 min，按试剂盒说明，加入一抗后4℃过夜，DAB显色、苏木精复染，光镜下观察。
, 百拇医药
1.2.4 荧光检测 按前述将细胞接种于6孔板之盖玻片上，药物作用24 h，以生理盐水轻轻冲洗后，按Annexin Ⅴ荧光显色试剂盒说明滴加荧光显色剂，室温10 min后，荧光显微镜观察、摄片、计数。
1.2.5 细胞形态观察 将经不同质量浓度HCPT处理过的肿瘤细胞和未处理过的对照组细胞，以2%戊二醛固定，包埋，制片，电镜(Hitachi,H-500)观察并照相[4]。
1.2.6 流式细胞术分析 EDTA消化收获细胞；70%乙醇固定；相应处理后，于EPICS 751型流式细胞仪(美国Coulter公司)上分析[5]。
1.2.7 TUNEL标记检测 按试剂盒说明进行。
1.3 统计学处理 进行未配对计量资料的t检验。
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2 结 果
2.1 MTT增殖检测结果 质量浓度分别为100， 50， 25， 12.5， 6.25， 3.125 μg/ml 的HCPT作用24 h后，对肿瘤细胞的增殖抑制率均显著高于空白对照组(P<0.01)；而1.562 5 μg/ml HCPT作用24 h后，与对照组相比则无显著性差异(表1)。
表 1 HCPT对SW-1990细胞体外增殖的影响
Tab 1 Effects of HCPT on the proliferation
of SW-1990 in vitron=3，
±s) Group
D(570)
, http://www.100md.com
Control
0.276 3±0.003 2
HCPT (ρB/μg.ml-1)
1.562 5
0.248 5±0.010 7
3.125
0.229 2±0.004 6**
6.25
0.225 7±0.007 9**
12.5
, http://www.100md.com
0.173 8±0.008 3**
25
0.165 9±0.007 8**
50
0.188 7±0.002 5**
100
0.209 1±0.008 7**
** P<0.01 vs control group2.2 电镜下表现 50 μg/ml HCPT作用于SW-1990细胞20 h后，细胞出现凋亡现象，且以早期形态变化为主，核膜皱缩，染色质密集于核膜下(图1A)。而100 μg/ml HCPT作用20 h后，细胞出现明显的凋亡现象，且以晚期表现为多，核膜消失，染色质断裂，核分裂成碎片，有凋亡小体形成(图1B)。
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图 1 HCPT处理后SW-1990细胞
电镜下形态学变化(×10 000)
Fig 1 Morphological change of SW-1990 cell
after treated with HCPT(×10 000)
A:50 μg/ml，↑Chromatin; B:100 μg/ml，↑Apoptosis body
2.3 流式细胞术分析结果 50 μg/ml HCPT作用20 h后，凋亡细胞的比例为13.2%；100 μg/ml HCPT作用20 h后，凋亡细胞的比例为26.1%。
2.4 AnnexinⅤ荧光检测结果 经50 μg/ml HCPT作用24 h后，部分细胞呈绿色荧光染色，经计数，比例为18.4%；坏死细胞染成红色，占2.2%(图2，图见封三)。
, 百拇医药
2.5 bcl-2免疫细胞化学检测 经50 μg/ml HCPT 作用24 h后，bcl-2表达较对照组明显减弱(图3，图见封三)。
2.6 TUNEL标记检测结果 光镜下观察结果表明，100 μg/ml HCTP作用后，细胞凋亡率为28.4%；而在50 μg/ml时，细胞凋亡率为15.3%。
图3 Annexin V荧光检测结果
Fig3 Results of Annexin -V-flous detection
图4 bcl-2 免疫细胞化学检测结果
, 百拇医药 Fig 4 Results of bcl -2 immunocytochemical detection A:Before treated ;B:After treated
3 讨 论
HCPT作为一类极富前景的抗癌药物，已引起众多研究者关注[1]。其对肿瘤细胞的主要作用机制是抑制拓扑异构酶Ⅰ的活性，从而抑制肿瘤细胞有丝分裂、DNA复制。但有关HCPT通过诱导细胞凋亡而抑制胰腺癌细胞生长方面的研究却少见报道。
我们对HCPT体外抑制人胰腺癌细胞株SW-1990增殖并诱导其凋亡的研究结果表明：质量浓度分别为100，50，25，12.5，6.25，3.125 μg/ml 的HCPT作用24 h后，对肿瘤细胞的增殖抑制率均显著高于空白对照组(P<0.01)，而1.562 5 μg/ml HCPT组与对照组相比则无显著差异，提示在3.125～100 μg/ml质量浓度下HCPT对SW-1990细胞具有明显的体外抑制增殖作用。为进一步明确HCPT抑制癌细胞增殖与诱导其凋亡之间的关系，我们在预实验的基础上，选取50和100 μg/ml两个浓度进行了凋亡相关指标的测定与检测。
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本研究结果表明，HCPT在50 μg/ml质量浓度下，作用于体外培养的SW-1990细胞20 h后，肿瘤细胞有明显的凋亡现象发生，主要以早、中期的表现为主，凋亡率为13.2%和15.3%(流式细胞术与TUNEL检测结果)；在100 μg/ml质量浓度下，细胞凋亡率为26.1%和28.4%，此时的形态学变化主要以凋亡晚期表现为主。提示HCPT抑制肿瘤细胞增殖的作用机制可能与诱导其凋亡有关。
细胞凋亡早期，主要是细胞膜发生变化[6，4]。其中的一个重要改变是磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine ，PS)易位，从胞膜内到胞膜外，暴露在细胞表面。Annexin Ⅴ是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和性。虽然坏死细胞亦可出现此类表现，但由于同时结合propidium joidide DNA染色，使坏死细胞染成红色，因此可以根据染色结果排除坏死细胞。我们的实验结果显示，经50 μg/ml HCPT作用24 h后，部分细胞呈绿色荧光染色，经计数，比例为18.4%；而坏死细胞染成红色，仅占2.2%。由此也进一步证实HCPT对SW-1990细胞体外增殖的影响可能确与其诱导细胞凋亡有关。
, 百拇医药
bcl-2不同于一般意义上加速细胞增殖而致癌的癌基因，而是通过抵抗多种形式的细胞死亡，延长细胞寿命，使细胞数目累积增多来促进肿瘤形成的，是细胞凋亡的抑制基因[4，7]。本研究结果表明， 50 μg/ml HCPT作用24 h后，bcl-2表达较对照组明显减少，提示HCPT可能通过抑制bcl-2表达这一途径诱导肿瘤细胞凋亡。
本研究证明，HCPT在体外可抑制人胰腺癌细胞株SW-1990的增殖，其作用机制可能系通过抑制bcl-2表达而诱导肿瘤细胞凋亡。对HCPT类药物临床用于胰腺癌的治疗具有指导意义。
致谢 诚挚感谢本院临床实验科张玲珍、李莉，病理科叶挺军、赵奕以及血液科傅卫军等同志在本研究过程中给予的热心帮助。
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39770836).
[作者简介] 许 青(1964-)，男(汉族)，博士，主治医师.
, 百拇医药
作者单位:郭静(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 200003)
鲍洪涛(医教部)
[参 考 文 献]
[1] Burris HA, Rothernberg ML, Kuhn JG, et al. Clinical trials with topoisomerase Ⅰ inhibitors[J]. Sem Oncol, 1992, 19(6):663-669.
[2] O′Connar DS, Schechner JS, Adida C. Control of apoptosis during angiogenesis by survivin expression in endothelial cells[J]. Am J Pathol, 2000, 156(2):392-399.
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[3] Majno G, Jotis I. Apoptosis, oncosis, and necrosis: an overview of cell death[J]. Am J Pathol, 1995,146(1):3-15.
[4] Creutz CE. The annexins and exocytosis. Science, 1992, 258 (6): 924-931.
[5] 李德玲，王会信，周廷冲. 细胞程序性死亡的判定方法[J]. 生物化学与生物物理进展, 1996，23(4)：322-325.
[6] Andree HA, Reutelingesperger CP, Hauptmann R, et al. Binding of vascular anticoagulant alpha (VAC alpha) to planar phospholipid bilayers[J]. J Biol Chem, 1990, 265(9):4923-4928.
[7] Voutsadakis IA. Apoptosis and the pathogenesis of lymphoma[J]. Acta Oncol, 2000,39(2):151-156.
[收稿日期] 2000-03-16
[修回日期] 2000-06-08, 百拇医药
单位：许青(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 200003)；高勇(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 200003)；王杰军(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 200003)；朱长力(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 200003)；王兵(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 200003)
关键词：羟喜树碱；胰腺肿瘤；凋亡；增殖
第二军医大学学报000810 [摘要] 目的：研究羟喜树碱(HCPT)体外抑制人胰腺癌细胞株SW-1990增殖并诱导其凋亡的作用。方法：体外培养的胰腺癌细胞经不同质量浓度(1.562 5， 3.125， 6.25， 12.5， 25，50， 100 μg/ml)的HCPT处理20～24 h后，用MTT法测定细胞增殖情况，再分别以AnnexinⅤ早期凋亡检测试剂盒、电子显微镜、流式细胞术和TUNEL标记以及bcl-2免疫细胞化学标记检测细胞凋亡情况。结果：(1)3.125～100 μg/ml HCPT作用24 h后，肿瘤细胞的增殖抑制率均非常显著高于对照组(P<0.01)。(2) 50 μg/ml HCPT作用20 h后，经流式细胞术及TUNEL标记检测，肿瘤细胞的凋亡率分别为13.2%和15.3%;100 μg/ml HCPT作用20 h后，两种方法检测的细胞凋亡率分别为26.1%和28.4%。 (3) 电镜及AnnexinⅤ标记荧光检测观察表明，50 μg/ml HCPT作用下，肿瘤细胞主要呈早期凋亡表现，凋亡率为18.4%。(4) 50 μg/ml HCPT作用24 h后，肿瘤细胞bcl-2表达较对照组明显减弱。结论：HCPT在体外可抑制SW-1990细胞的增殖，部分作用机制是诱导细胞凋亡;提示HCPT可作为细胞凋亡诱导剂用于胰腺癌的治疗。
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[中图分类号] R 282.710.5 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)08-0731-03
Effects of hydroxyl camptothecinum on proliferation and apoptosis of human pancreatic cancer cell line
XU Qing GAO Yong WANG Jie-Jun ZHU Chang-Li WANG Bing GUO Jing
(Department of Oncology， Changzheng Hospital， Second Military Medical University， Shanghai 200003，China)
, 百拇医药
BAO Hong-Tao
(Department of Medical Affair Management)
[ABSTRACT] Objective: To study the effect of hydroxyl camptothecinum (HCPT) on proliferation and apoptosis of human pancreatic cancer cell in vitro. Methods: After treated with HCPT at different concentrations (1.562 5， 3.125， 6.25， 12.5， 25， 50， 100 μg/ml) for 20-24 h, the cultured SW-1990 cell proliferation were evaluated by MTT, and apoptosis by Annexin-Ⅴ-fluos staining, electronic microscopy, flow cytometry, bcl-2 immunocytochemical staining and in situ TUNEL (TdT-mediated dUTP-X nick end labeling). Results: (1) The rate of proliferation in each group of 3.125-100 μg/ml was significantly lower than that in the control group (P<0.01) after treated with HCPT for 24 hours. (2) The apoptosis rate of pancreatic cell was 13.2% and 15.3% after treated with HCPT at the concentration of 50 μg/ml for 20 hours, the rate was 26.1% and 28.4% at 100 μg/ml. (3)Annexin-Ⅴ-fluos staining and electronic microscopy detection showed the expression of apoptosis was mainly at the early morphological stage at the concentration of 50 μg/ml and the apoptosis rate of early stage was 18.4%. (4) The expression of bcl-2 were less than the control after treated with HCPT 50 μg/ml for 24 hours. Conclusion: HCPT can depress the proliferation of SW-1990 in vitro, partially through the induction of apoptosis, and HCPT is a potential agent for pancreatic cancer chemotherapy.
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[KEY WORDS] hydroxycamptothecinum; pancreatic neoplasms; apoptosis; proliferation
胰腺癌是一预后极差的恶性肿瘤，目前对其治疗仍缺乏有效的手段。喜树碱类药物是从我国特有的喜树中提取的生物碱，是拓扑异构酶Ⅰ的抑制剂[1]，其在肿瘤防治中的作用及机制已引起众多研究者的关注。研究表明，凋亡的异常是肿瘤发生发展中的一个重要因素，在恶性肿瘤中，细胞凋亡的比例明显降低，如能诱导肿瘤细胞凋亡，使其凋亡的比例增加，则可能遏制肿瘤的发生发展[2, 3]。本研究拟了解羟喜树碱(HCPT)在体外对人胰腺癌细胞株SW-1990增殖的影响及其诱导凋亡的作用，以探讨其在胰腺癌防治中的潜在作用价值。
1 材料和方法
1.1 药物及主要试剂 HCPT注射液(吉林长春天诚药业有限公司提供，批号：吉卫药准字1996第122041号),使用时以DMEM稀释至所需浓度，加入培养的细胞中。MTT为Sigma公司产品，bcl-2免疫细胞化学检测试剂盒为武汉博士德公司进口分装，Annexin Ⅴ荧光显色试剂盒、TUNEL检测试剂盒均为德国宝灵曼公司产品。
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养与药物处理 人胰腺癌细胞株SW-1990(购自中国科学院细胞研究所)，以含10%小牛血清的DMEM培养液在5% CO2， 37℃条件下培养。细胞接种24 h后，分别加入不同质量浓度(1.562 5，3.125，6.25，12.5，25，50，100 μg/ml)的HCPT，作用20～24 h后，进行各种指标测定。
1.2.2 细胞增殖检测 将SW-1990细胞按1×103 个/孔接种于96孔板，每一浓度设3复孔。加入不同质量浓度的HCPT作用24 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl轻轻晃匀，37℃温育4 h，去除上清液，经吸水纸吸干后，每孔加入DMSO 100 μl，振荡混匀10 min后，用96孔Biolisa酶标仪检测570 nm处的光密度值。
1.2.3 bcl-2免疫细胞化学检测 将SW-1990细胞按1×105个/孔接种于预先置好盖玻片的6孔板中，培养24 h后，加入HCPT作用24 h，取出盖玻片，用生理盐水冲洗后，以4℃预冷的丙酮固定30 min，按试剂盒说明，加入一抗后4℃过夜，DAB显色、苏木精复染，光镜下观察。
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1.2.4 荧光检测 按前述将细胞接种于6孔板之盖玻片上，药物作用24 h，以生理盐水轻轻冲洗后，按Annexin Ⅴ荧光显色试剂盒说明滴加荧光显色剂，室温10 min后，荧光显微镜观察、摄片、计数。
1.2.5 细胞形态观察 将经不同质量浓度HCPT处理过的肿瘤细胞和未处理过的对照组细胞，以2%戊二醛固定，包埋，制片，电镜(Hitachi,H-500)观察并照相[4]。
1.2.6 流式细胞术分析 EDTA消化收获细胞；70%乙醇固定；相应处理后，于EPICS 751型流式细胞仪(美国Coulter公司)上分析[5]。
1.2.7 TUNEL标记检测 按试剂盒说明进行。
1.3 统计学处理 进行未配对计量资料的t检验。
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2 结 果
2.1 MTT增殖检测结果 质量浓度分别为100， 50， 25， 12.5， 6.25， 3.125 μg/ml 的HCPT作用24 h后，对肿瘤细胞的增殖抑制率均显著高于空白对照组(P<0.01)；而1.562 5 μg/ml HCPT作用24 h后，与对照组相比则无显著性差异(表1)。
表 1 HCPT对SW-1990细胞体外增殖的影响
Tab 1 Effects of HCPT on the proliferation
of SW-1990 in vitron=3，
±s) GroupD(570)
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Control
0.276 3±0.003 2
HCPT (ρB/μg.ml-1)
1.562 5
0.248 5±0.010 7
3.125
0.229 2±0.004 6**
6.25
0.225 7±0.007 9**
12.5
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0.173 8±0.008 3**
25
0.165 9±0.007 8**
50
0.188 7±0.002 5**
100
0.209 1±0.008 7**
** P<0.01 vs control group2.2 电镜下表现 50 μg/ml HCPT作用于SW-1990细胞20 h后，细胞出现凋亡现象，且以早期形态变化为主，核膜皱缩，染色质密集于核膜下(图1A)。而100 μg/ml HCPT作用20 h后，细胞出现明显的凋亡现象，且以晚期表现为多，核膜消失，染色质断裂，核分裂成碎片，有凋亡小体形成(图1B)。
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图 1 HCPT处理后SW-1990细胞
电镜下形态学变化(×10 000)
Fig 1 Morphological change of SW-1990 cell
after treated with HCPT(×10 000)
A:50 μg/ml，↑Chromatin; B:100 μg/ml，↑Apoptosis body
2.3 流式细胞术分析结果 50 μg/ml HCPT作用20 h后，凋亡细胞的比例为13.2%；100 μg/ml HCPT作用20 h后，凋亡细胞的比例为26.1%。
2.4 AnnexinⅤ荧光检测结果 经50 μg/ml HCPT作用24 h后，部分细胞呈绿色荧光染色，经计数，比例为18.4%；坏死细胞染成红色，占2.2%(图2，图见封三)。
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2.5 bcl-2免疫细胞化学检测 经50 μg/ml HCPT 作用24 h后，bcl-2表达较对照组明显减弱(图3，图见封三)。
2.6 TUNEL标记检测结果 光镜下观察结果表明，100 μg/ml HCTP作用后，细胞凋亡率为28.4%；而在50 μg/ml时，细胞凋亡率为15.3%。
图3 Annexin V荧光检测结果
Fig3 Results of Annexin -V-flous detection
图4 bcl-2 免疫细胞化学检测结果
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3 讨 论
HCPT作为一类极富前景的抗癌药物，已引起众多研究者关注[1]。其对肿瘤细胞的主要作用机制是抑制拓扑异构酶Ⅰ的活性，从而抑制肿瘤细胞有丝分裂、DNA复制。但有关HCPT通过诱导细胞凋亡而抑制胰腺癌细胞生长方面的研究却少见报道。
我们对HCPT体外抑制人胰腺癌细胞株SW-1990增殖并诱导其凋亡的研究结果表明：质量浓度分别为100，50，25，12.5，6.25，3.125 μg/ml 的HCPT作用24 h后，对肿瘤细胞的增殖抑制率均显著高于空白对照组(P<0.01)，而1.562 5 μg/ml HCPT组与对照组相比则无显著差异，提示在3.125～100 μg/ml质量浓度下HCPT对SW-1990细胞具有明显的体外抑制增殖作用。为进一步明确HCPT抑制癌细胞增殖与诱导其凋亡之间的关系，我们在预实验的基础上，选取50和100 μg/ml两个浓度进行了凋亡相关指标的测定与检测。
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本研究结果表明，HCPT在50 μg/ml质量浓度下，作用于体外培养的SW-1990细胞20 h后，肿瘤细胞有明显的凋亡现象发生，主要以早、中期的表现为主，凋亡率为13.2%和15.3%(流式细胞术与TUNEL检测结果)；在100 μg/ml质量浓度下，细胞凋亡率为26.1%和28.4%，此时的形态学变化主要以凋亡晚期表现为主。提示HCPT抑制肿瘤细胞增殖的作用机制可能与诱导其凋亡有关。
细胞凋亡早期，主要是细胞膜发生变化[6，4]。其中的一个重要改变是磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine ，PS)易位，从胞膜内到胞膜外，暴露在细胞表面。Annexin Ⅴ是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和性。虽然坏死细胞亦可出现此类表现，但由于同时结合propidium joidide DNA染色，使坏死细胞染成红色，因此可以根据染色结果排除坏死细胞。我们的实验结果显示，经50 μg/ml HCPT作用24 h后，部分细胞呈绿色荧光染色，经计数，比例为18.4%；而坏死细胞染成红色，仅占2.2%。由此也进一步证实HCPT对SW-1990细胞体外增殖的影响可能确与其诱导细胞凋亡有关。
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bcl-2不同于一般意义上加速细胞增殖而致癌的癌基因，而是通过抵抗多种形式的细胞死亡，延长细胞寿命，使细胞数目累积增多来促进肿瘤形成的，是细胞凋亡的抑制基因[4，7]。本研究结果表明， 50 μg/ml HCPT作用24 h后，bcl-2表达较对照组明显减少，提示HCPT可能通过抑制bcl-2表达这一途径诱导肿瘤细胞凋亡。
本研究证明，HCPT在体外可抑制人胰腺癌细胞株SW-1990的增殖，其作用机制可能系通过抑制bcl-2表达而诱导肿瘤细胞凋亡。对HCPT类药物临床用于胰腺癌的治疗具有指导意义。
致谢 诚挚感谢本院临床实验科张玲珍、李莉，病理科叶挺军、赵奕以及血液科傅卫军等同志在本研究过程中给予的热心帮助。
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39770836).
[作者简介] 许 青(1964-)，男(汉族)，博士，主治医师.
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作者单位:郭静(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 200003)
鲍洪涛(医教部)
[参 考 文 献]
[1] Burris HA, Rothernberg ML, Kuhn JG, et al. Clinical trials with topoisomerase Ⅰ inhibitors[J]. Sem Oncol, 1992, 19(6):663-669.
[2] O′Connar DS, Schechner JS, Adida C. Control of apoptosis during angiogenesis by survivin expression in endothelial cells[J]. Am J Pathol, 2000, 156(2):392-399.
, http://www.100md.com
[3] Majno G, Jotis I. Apoptosis, oncosis, and necrosis: an overview of cell death[J]. Am J Pathol, 1995,146(1):3-15.
[4] Creutz CE. The annexins and exocytosis. Science, 1992, 258 (6): 924-931.
[5] 李德玲，王会信，周廷冲. 细胞程序性死亡的判定方法[J]. 生物化学与生物物理进展, 1996，23(4)：322-325.
[6] Andree HA, Reutelingesperger CP, Hauptmann R, et al. Binding of vascular anticoagulant alpha (VAC alpha) to planar phospholipid bilayers[J]. J Biol Chem, 1990, 265(9):4923-4928.
[7] Voutsadakis IA. Apoptosis and the pathogenesis of lymphoma[J]. Acta Oncol, 2000,39(2):151-156.
[收稿日期] 2000-03-16
[修回日期] 2000-06-08, 百拇医药