烧伤后肠系膜淋巴结GP130基因表达与细胞凋亡
作者：白晓东 刘贤华 肖光夏
单位：白晓东(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所)；刘贤华(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所；重庆 400038)；肖光夏(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所)
关键词：烧伤；IL-6；IL-6受体；GP130；细胞凋亡
第三军医大学学报000804 提 要： 目的 观察烧伤后肠系膜淋巴结GP130基因表达与细胞凋亡变化的时相关系。方法 BALB/c种小鼠60只，分为致伤组、正常对照组。致伤组动物予以20%TBSA Ⅲ度烧伤。于伤后1、2、3 d活杀致伤组，并活杀对照组。取肠系膜淋巴结：ELISA检测IL-6水平；提取RNA，RT-PCR检测GP130基因表达变化；采用TUNNEL法对细胞凋亡进行观察。结果 在伤后3 d以内IL-6含量明显升高；GP130基因表达、细胞凋亡在伤后1d明显增加。结论 在烧伤后早期，肠系膜淋巴结IL-6、GP130表达与细胞凋亡均增加。
, 百拇医药
中图法分类号： R329.25;R644 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)08-0724-03
Expression of GP130 in mesenteric lymph node and its relationship with cell apoptosis after burn injury in mice
BAI Xiao-dong，LIU Xian-hua，XIAO Guang-xia
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)
, 百拇医药 Abstract： Objective To study the change of IL-6R GP130 gene expression in mesenteric lymph nodes (MLN) after burns and its relationship with cell apoptosis. Methods Sixty mice were devided into control group and injury group .In the injury group, animals were inflicted with 20% TBSA full thickness burns. On 1 d,2 d and 3 d after burns, mice were killed, and the mesenteric lymph nodes were taken. IL-6 were measured with ELISA. Isolated cells from the mesenteric lymph nodes were examined with RT-PCR to observe the expression of GP130 gene. Meanwhile cell apoptosis was investigated with “TUNNEL” staining. Results IL-6 was increased on 3 d after burns, Expression of GP130 and cell apoptosis were increased on 1 d after burns. Conclusion In the early period postburn,expression of IL-6 and GP130 are increased, so does cell apoptosis.
, 百拇医药
Key words: burns； IL-6; IL-6R； GP130； apoptosis
IL-6是调节细胞分化、抑制细胞凋亡的主要因子， IL-6受体由二个亚基构成[1]，α亚基及β亚基。前者为GP80蛋白，后者为GP130蛋白。α亚基存在于膜上，负责与IL-6分子结合；GP130主要部分在胞内。当α亚基与IL-6分子结合后，必须与GP130耦联才能激发信号传递。其次，IL-6与SIL-6R(GP80)结合后亦可激活GP130而产生效应。因此GP130是重要的功能亚基，是多种细胞因子共用的一个信号传递分子。目前有关烧伤后肠系膜淋巴结内细胞凋亡以及GP130表达如何变化，尚无文献报道。本研究采用RT-PCR对伤后肠系膜淋巴结内GP130的基因表达及其与细胞凋亡的时相关系进行观察,以初步阐明烧伤后粘膜免疫的变化机制。
1 材料和方法
1.1 试剂
, 百拇医药
RNA提取试剂盒、RNase-抑制剂、dNTP购自BoehringerMannheim公司；反转录引物：Oligo(dT)15引物、AMV逆转录酶购自Promega公司；Taq聚合酶购自上海生工公司。
1.2 RT-PCR引物设计及合成
采用如下序列[2]，引物由上海生工公司合成，并经纯化。
GP130：扩增长度为687bp。5'-primerCAGCGTACACTGATGAAGGTGGGAAAGA；3'-primerGCTGACTGCAGTTCTGCTTGA
GAPDH：扩增片段长度为934bp。5'-primerTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC；3'-primerCATGTAGGCCATGAGGTCCA-CCAC
, 百拇医药
1.3 动物分组及致伤
BALB/c健康雄性小鼠60只，22g左右，5周龄。随机分为对照组及致伤组。致伤组动物经背部剃毛后，经3%凝固汽油燃烧7s，给予20%Ⅲ度TBSA烧伤。分别于伤后1、2、3d分批活杀致伤组动物。动物取材：活杀小鼠，无菌打开腹腔，取肠系膜淋巴结(Mesentericlymphnodes,MLN)。每个时间点5只小鼠的MLN用于RT-PCR；另外10只的MLN一半制成病理切片、一半用于IL-6测定。
1.4 MLN细胞RNA提取
同时间点5只小鼠的MLN归集一处,过200目不锈钢网，成单细胞，离心收集。采用常规方法提取RNA，备用。
1.5 RT-PCR反转录
按下列顺序加样：5×RTBuffer，4μl；dNTP,2μl；Oligo(dT)1μl；提取RNA，1.5μl(约1μg)；1%DEPC，10μl；在PCR仪上，68℃，5min，冰浴3～5min，加入0.5μlRNAase抑制剂，1μlAMV酶，在42℃水浴中2h。95℃，5min，5℃，5min，产物于-20℃冻存备用。
, 百拇医药
反转录产物PCR：按下列顺序进行：反转录产物(CDNA)2μl；10×Buffer5μl；25mmol/LMgCl23μl；dNTP，3μl；GP1305'-引物1μl；GP1303'-引物1μl；双蒸水34μl；97℃，6min，冰浴5min,加Taq酶1μl；97℃，90s；60℃，60s；72℃,80s，30循环；72℃，延长7min；GAPDH与GP130同时扩增。PCR产物在1.5%琼脂糖胶中，50V，电泳。设立GAPDH参照，各时相逆转录产物在用GP130引物PCR扩增同时，亦用GAPDH的引物扩增，二者除引物外，其余条件均完全一致。阴性对照：PCR扩增时，不加特异引物，其余与上述条件完全一致。
1.6 RT-PCR半定量
将电泳结果在本所四星电泳分析仪上测定，以GP130/GAPDH的灰度计数值之比为结果。
1.7 MLN中IL-6测定
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称重，入2ml0.01mol/LpH7.2PBS中匀浆。匀浆液中IL-6测定按ELISA试剂盒中步骤进行。
1.8 肠系膜淋巴结中细胞凋亡观察记数
采用“TUNNEL”法。MLN常规制病理石蜡切片，按试剂盒说明的步骤进行染色。阳性细胞记数：计数400倍视野中的阳性细胞数，每个时间点共随机观察50个视野，计算平均数。
1.9 统计学分析
采用t检验进行组间比较。
2 结果
2.1 RT-PCR检测MLN细胞膜受体GP130表达
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对照组中GP130保持一定量的表达。烧伤后各时相均见GP130表达，见图1。GP130/GAPDH:对照组为1.26±0.11,致伤后1d为6.07±0.22(P<0.05vscontrol),2d为3.65±0.31(P<0.05vscontrol),3d为1.19±0.18。
2.2 MLN中IL-6
对照组为(138.89±108.78)ng/g，伤后IL-6水平明显升高，1d为(653.14±258.71)ng/g，2d为(435.7±207.6)ng/g，3d为(2121.09±1085.78)ng/g，均明显高于对照组(P<0.05)。
图1 致伤组各时相RT-PCR结果
Fig1 Result of RT-PCR of injury group at different time points
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Lane1：PCR marker；Lane2：GAPDHon1d；Lane3：GP130 on 1d；Lane4：GAPDH on 2d；Lane5：GP130 on 2d；Lane6：GAPDH on 3d;Lane7:GP130 on 3d
2.3 MLN中细胞凋亡计数
每个视野凋亡细胞数对照组为75.68±8.41，见图2。致伤后1d为102.40±70.79，2d为10.24±2.95，3d为11.84±1.31，与对照组差异显著(P<0.05)。
图2 肠系膜淋巴结中细胞凋亡 (TUNNEL 染色×200)
Fig 2 Cell apoptosis in MLN (TUNNEL stain×200)
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3 讨论
在GALT中，IL-6起着不可缺少的作用，如果将IL-6基因从小鼠体内剔除，GALT则不能产生相应高水平的IgA抗体应答，同时IgA型浆细胞在MLN、小肠、肺部的数量明显减少。然而IL-6所表现出的作用特性，在很大程度上依靠其靶细胞膜上的IL-6受体的功能。IL-6R是由两条跨膜糖蛋白α亚基和β亚基组成，前者分子量80 000，负责与配体IL-6的结合，以及负责与β亚基的耦联。β亚基即GP130，分子量为130 000，主要参与信号传导。IL-6结合GP130的途径有二条：①IL-6与GP80在膜上结合，然后与GP130耦联，将信号传递入胞内；②IL-6与胞外SIL-6R(可溶性IL-6R，主要为GP80的胞外部分)结合，直接与GP130结合，启动信号传递。因此，GP130是IL-6传递信号中的关键环节。
最近有作者提出，体内持续高水平的IL-6可导致GP130表达减少[3]。有关烧伤后淋巴细胞膜表面IL-6R的表达变化的研究较少，在应激状态时，血浆中IL-6及SIL-6R的水平往往呈同步上升趋势[4]。因SIL-6R主要来源于α亚基的胞外部分(GP55)。从而提示病理状态下，IL-6升高同时合并α亚基表达增多。但是有关烧伤后GP130表达，特别是GALT中的表达变化，尚未见研究报道。本研究证实烧伤后IL-6升高并未抑制β亚基即GP130的基因表达：MLN中IL-6在1、2、3 d均高于伤前水平，而GP130主要在1 d增高，3 d则恢复至伤前水平。IL-6的生物活性之一为抑制细胞凋亡，IL-6通过其受体起调控作用。但是伤后1 d，即使IL-6、GP130表达增加，细胞凋亡仍增加，提示伤后1 d MLN中存在导致凋亡增加的其它可能因素，其促进凋亡增加、从而导致局部免疫功能紊乱。在伤后2、3 d，IL-6通过其受体在一定程度上抑制了细胞凋亡的发生,使凋亡细胞数量减少。
, http://www.100md.com
作者简介：白晓东(1969-)，男，山西省太原市人，博士，主治医师，讲师，主要从事烧伤感染方面的研究，发表论文12篇。电话：(023)68754578
参考文献：
[1] 董家新，任蕴芳，沈倍奋.IL-6受体结构与功能的研究进展[J].生物化学与生物物理进展，1995，22(3)：194-197.
[2] Song C L, Yamte T, Taguchi Y, et al. Regulation of the gp80 and gp130 subunits of the IL-6 receptor by sex steroids in the murine bone marrow[J]. J Clin Invest，1995，100(6):1 980-1 990.
[3] Wang X J, Taga T, Yoshida K, et al. gp130, the cytokine common signal-transducer of IL-6 cytokine family, is downregulated in T cells in vivo by IL-6[J]. Blood，1998，91(9):3 308-3 314.
[4] Barak V, Schwartz A, Kalickman I, et al. Prevalence of hypophosphatemia in sepsis and infection: the role of cytokines[J]. Am J Med，1998，104(1):40-47.
收稿日期：1999-12-05；修回日期：2000-05-09, 百拇医药
单位：白晓东(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所)；刘贤华(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所；重庆 400038)；肖光夏(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所)
关键词：烧伤；IL-6；IL-6受体；GP130；细胞凋亡
第三军医大学学报000804 提 要： 目的 观察烧伤后肠系膜淋巴结GP130基因表达与细胞凋亡变化的时相关系。方法 BALB/c种小鼠60只，分为致伤组、正常对照组。致伤组动物予以20%TBSA Ⅲ度烧伤。于伤后1、2、3 d活杀致伤组，并活杀对照组。取肠系膜淋巴结：ELISA检测IL-6水平；提取RNA，RT-PCR检测GP130基因表达变化；采用TUNNEL法对细胞凋亡进行观察。结果 在伤后3 d以内IL-6含量明显升高；GP130基因表达、细胞凋亡在伤后1d明显增加。结论 在烧伤后早期，肠系膜淋巴结IL-6、GP130表达与细胞凋亡均增加。
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中图法分类号： R329.25;R644 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)08-0724-03
Expression of GP130 in mesenteric lymph node and its relationship with cell apoptosis after burn injury in mice
BAI Xiao-dong，LIU Xian-hua，XIAO Guang-xia
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)
, 百拇医药 Abstract： Objective To study the change of IL-6R GP130 gene expression in mesenteric lymph nodes (MLN) after burns and its relationship with cell apoptosis. Methods Sixty mice were devided into control group and injury group .In the injury group, animals were inflicted with 20% TBSA full thickness burns. On 1 d,2 d and 3 d after burns, mice were killed, and the mesenteric lymph nodes were taken. IL-6 were measured with ELISA. Isolated cells from the mesenteric lymph nodes were examined with RT-PCR to observe the expression of GP130 gene. Meanwhile cell apoptosis was investigated with “TUNNEL” staining. Results IL-6 was increased on 3 d after burns, Expression of GP130 and cell apoptosis were increased on 1 d after burns. Conclusion In the early period postburn,expression of IL-6 and GP130 are increased, so does cell apoptosis.
, 百拇医药
Key words: burns； IL-6; IL-6R； GP130； apoptosis
IL-6是调节细胞分化、抑制细胞凋亡的主要因子， IL-6受体由二个亚基构成[1]，α亚基及β亚基。前者为GP80蛋白，后者为GP130蛋白。α亚基存在于膜上，负责与IL-6分子结合；GP130主要部分在胞内。当α亚基与IL-6分子结合后，必须与GP130耦联才能激发信号传递。其次，IL-6与SIL-6R(GP80)结合后亦可激活GP130而产生效应。因此GP130是重要的功能亚基，是多种细胞因子共用的一个信号传递分子。目前有关烧伤后肠系膜淋巴结内细胞凋亡以及GP130表达如何变化，尚无文献报道。本研究采用RT-PCR对伤后肠系膜淋巴结内GP130的基因表达及其与细胞凋亡的时相关系进行观察,以初步阐明烧伤后粘膜免疫的变化机制。
1 材料和方法
1.1 试剂
, 百拇医药
RNA提取试剂盒、RNase-抑制剂、dNTP购自BoehringerMannheim公司；反转录引物：Oligo(dT)15引物、AMV逆转录酶购自Promega公司；Taq聚合酶购自上海生工公司。
1.2 RT-PCR引物设计及合成
采用如下序列[2]，引物由上海生工公司合成，并经纯化。
GP130：扩增长度为687bp。5'-primerCAGCGTACACTGATGAAGGTGGGAAAGA；3'-primerGCTGACTGCAGTTCTGCTTGA
GAPDH：扩增片段长度为934bp。5'-primerTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC；3'-primerCATGTAGGCCATGAGGTCCA-CCAC
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1.3 动物分组及致伤
BALB/c健康雄性小鼠60只，22g左右，5周龄。随机分为对照组及致伤组。致伤组动物经背部剃毛后，经3%凝固汽油燃烧7s，给予20%Ⅲ度TBSA烧伤。分别于伤后1、2、3d分批活杀致伤组动物。动物取材：活杀小鼠，无菌打开腹腔，取肠系膜淋巴结(Mesentericlymphnodes,MLN)。每个时间点5只小鼠的MLN用于RT-PCR；另外10只的MLN一半制成病理切片、一半用于IL-6测定。
1.4 MLN细胞RNA提取
同时间点5只小鼠的MLN归集一处,过200目不锈钢网，成单细胞，离心收集。采用常规方法提取RNA，备用。
1.5 RT-PCR反转录
按下列顺序加样：5×RTBuffer，4μl；dNTP,2μl；Oligo(dT)1μl；提取RNA，1.5μl(约1μg)；1%DEPC，10μl；在PCR仪上，68℃，5min，冰浴3～5min，加入0.5μlRNAase抑制剂，1μlAMV酶，在42℃水浴中2h。95℃，5min，5℃，5min，产物于-20℃冻存备用。
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反转录产物PCR：按下列顺序进行：反转录产物(CDNA)2μl；10×Buffer5μl；25mmol/LMgCl23μl；dNTP，3μl；GP1305'-引物1μl；GP1303'-引物1μl；双蒸水34μl；97℃，6min，冰浴5min,加Taq酶1μl；97℃，90s；60℃，60s；72℃,80s，30循环；72℃，延长7min；GAPDH与GP130同时扩增。PCR产物在1.5%琼脂糖胶中，50V，电泳。设立GAPDH参照，各时相逆转录产物在用GP130引物PCR扩增同时，亦用GAPDH的引物扩增，二者除引物外，其余条件均完全一致。阴性对照：PCR扩增时，不加特异引物，其余与上述条件完全一致。
1.6 RT-PCR半定量
将电泳结果在本所四星电泳分析仪上测定，以GP130/GAPDH的灰度计数值之比为结果。
1.7 MLN中IL-6测定
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称重，入2ml0.01mol/LpH7.2PBS中匀浆。匀浆液中IL-6测定按ELISA试剂盒中步骤进行。
1.8 肠系膜淋巴结中细胞凋亡观察记数
采用“TUNNEL”法。MLN常规制病理石蜡切片，按试剂盒说明的步骤进行染色。阳性细胞记数：计数400倍视野中的阳性细胞数，每个时间点共随机观察50个视野，计算平均数。
1.9 统计学分析
采用t检验进行组间比较。
2 结果
2.1 RT-PCR检测MLN细胞膜受体GP130表达
, 百拇医药
对照组中GP130保持一定量的表达。烧伤后各时相均见GP130表达，见图1。GP130/GAPDH:对照组为1.26±0.11,致伤后1d为6.07±0.22(P<0.05vscontrol),2d为3.65±0.31(P<0.05vscontrol),3d为1.19±0.18。
2.2 MLN中IL-6
对照组为(138.89±108.78)ng/g，伤后IL-6水平明显升高，1d为(653.14±258.71)ng/g，2d为(435.7±207.6)ng/g，3d为(2121.09±1085.78)ng/g，均明显高于对照组(P<0.05)。
图1 致伤组各时相RT-PCR结果
Fig1 Result of RT-PCR of injury group at different time points
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Lane1：PCR marker；Lane2：GAPDHon1d；Lane3：GP130 on 1d；Lane4：GAPDH on 2d；Lane5：GP130 on 2d；Lane6：GAPDH on 3d;Lane7:GP130 on 3d
2.3 MLN中细胞凋亡计数
每个视野凋亡细胞数对照组为75.68±8.41，见图2。致伤后1d为102.40±70.79，2d为10.24±2.95，3d为11.84±1.31，与对照组差异显著(P<0.05)。
图2 肠系膜淋巴结中细胞凋亡 (TUNNEL 染色×200)
Fig 2 Cell apoptosis in MLN (TUNNEL stain×200)
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3 讨论
在GALT中，IL-6起着不可缺少的作用，如果将IL-6基因从小鼠体内剔除，GALT则不能产生相应高水平的IgA抗体应答，同时IgA型浆细胞在MLN、小肠、肺部的数量明显减少。然而IL-6所表现出的作用特性，在很大程度上依靠其靶细胞膜上的IL-6受体的功能。IL-6R是由两条跨膜糖蛋白α亚基和β亚基组成，前者分子量80 000，负责与配体IL-6的结合，以及负责与β亚基的耦联。β亚基即GP130，分子量为130 000，主要参与信号传导。IL-6结合GP130的途径有二条：①IL-6与GP80在膜上结合，然后与GP130耦联，将信号传递入胞内；②IL-6与胞外SIL-6R(可溶性IL-6R，主要为GP80的胞外部分)结合，直接与GP130结合，启动信号传递。因此，GP130是IL-6传递信号中的关键环节。
最近有作者提出，体内持续高水平的IL-6可导致GP130表达减少[3]。有关烧伤后淋巴细胞膜表面IL-6R的表达变化的研究较少，在应激状态时，血浆中IL-6及SIL-6R的水平往往呈同步上升趋势[4]。因SIL-6R主要来源于α亚基的胞外部分(GP55)。从而提示病理状态下，IL-6升高同时合并α亚基表达增多。但是有关烧伤后GP130表达，特别是GALT中的表达变化，尚未见研究报道。本研究证实烧伤后IL-6升高并未抑制β亚基即GP130的基因表达：MLN中IL-6在1、2、3 d均高于伤前水平，而GP130主要在1 d增高，3 d则恢复至伤前水平。IL-6的生物活性之一为抑制细胞凋亡，IL-6通过其受体起调控作用。但是伤后1 d，即使IL-6、GP130表达增加，细胞凋亡仍增加，提示伤后1 d MLN中存在导致凋亡增加的其它可能因素，其促进凋亡增加、从而导致局部免疫功能紊乱。在伤后2、3 d，IL-6通过其受体在一定程度上抑制了细胞凋亡的发生,使凋亡细胞数量减少。
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作者简介：白晓东(1969-)，男，山西省太原市人，博士，主治医师，讲师，主要从事烧伤感染方面的研究，发表论文12篇。电话：(023)68754578
参考文献：
[1] 董家新，任蕴芳，沈倍奋.IL-6受体结构与功能的研究进展[J].生物化学与生物物理进展，1995，22(3)：194-197.
[2] Song C L, Yamte T, Taguchi Y, et al. Regulation of the gp80 and gp130 subunits of the IL-6 receptor by sex steroids in the murine bone marrow[J]. J Clin Invest，1995，100(6):1 980-1 990.
[3] Wang X J, Taga T, Yoshida K, et al. gp130, the cytokine common signal-transducer of IL-6 cytokine family, is downregulated in T cells in vivo by IL-6[J]. Blood，1998，91(9):3 308-3 314.
[4] Barak V, Schwartz A, Kalickman I, et al. Prevalence of hypophosphatemia in sepsis and infection: the role of cytokines[J]. Am J Med，1998，104(1):40-47.
收稿日期：1999-12-05；修回日期：2000-05-09, 百拇医药