单羧酸转运泵基因反义真核表达载体的构建
作者：成党校 钱桂生 黄桂君
单位：成党校(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；钱桂生(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；黄桂君(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)
关键词：单羧酸转运泵基因；RT-PCR；反义载体构建
第三军医大学学报000829
提 要： 目的 构建单羧酸转运泵基因反义逆转录病毒真核表达载体。方法 应用RT-PCR方法扩增带有双酶切位点的单羧酸转运泵目的基因片段，与带有相同酶切位点的pLXSN逆转录病毒真核表达载体粘末端进行反向基因插入连接，构建具有反义表达的逆转录病毒载体。结果 构建载体进行双酶切电泳分析及插入片段基因序列分析，证明反义载体构建成功。结论 应用RT-PCR方法扩增插入DNA片段，简单、灵活、快捷。双酶切定向连接构建反义表达载体可实现构建一步到位，免去正反向筛选的麻烦。
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中图法分类号： R394-3 文献标识码： B
文章编号：1000-5404(2000)08-0807-03
Construction of monocarboxylate transporter gene antisense eukaryotic cell expression vector
单羧酸转运泵(Monocarboxylate transporter，MCT)在细胞内外的乳酸转运及H+调节方面具有重要作用[1，2]。本实验应用反义真核表达载体构建技术，构建MCT1反义真核表达载体，对进一步应用反义技术研究肿瘤细胞MCT1基因表达、调控对肿瘤细胞内酸碱及生长代谢的影响具有重要意义。
1 材料与方法
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1.1 细胞与试剂
A549人肺腺癌细胞株及pLXSN逆转录病毒真核表达载体分别为我所保存的细胞株及真核表达载体；1640培养基及小牛血清为Hyclone产品；RNA提取试剂Tripue、RT及PCR试剂盒分别购自德国宝灵曼及美国Promega公司;核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4 DNA连接酶购自MBI公司。
1.2 细胞培养及总RNA提取
A549细胞的培养与传代参照文献[3]进行。RNA提取方法按照Tripue试剂说明书中的操作步骤进行。RNA沉淀经测定后用灭RNA酶三蒸水稀释至2μg/μl。
1.3 RT-PCR产生反向插入基因片段
逆转录步骤根据宝灵曼试剂盒说明书略加修改进行。PCR引物设计根据Genebank中人心肌细胞MCT1cDNA序列应用我所引物设计软件进行设计,同时根据pLXSN真核表达载体多克隆位点中的EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位点的5′～3′方向，在设计的上游引物5′端引入BamHⅠ酶切序列及两个保护碱基,在设计的下游引物5′端引入EcoRⅠ酶切序列及两个保护碱基。其具体序列如下：上游引物(96～117bp)5′ttGGATCCttccatcggcttctcttatgc3′;下游引物(735～715bp)5′gcGAATTCctcttgtttagggtgtcttcc3′。PCR操作步骤按照Promega试剂盒操作说明进行。PCR反应条件为：95°C预变性3min；94°C、40s，59°C、50s，72°C、1min，35个循环后，72°C、10min。
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1.4 表达载体和插入基因片段的酶切与质粒构建
真核表达载体pLXSN的扩增及大量提取，按文献[4]进行。提取的质粒分别进行电泳、紫外分光光度仪检测(A260/A280)，了解所提质粒的大小、纯度及含量。RT-PCR扩增产物和经上述检测合格的质粒分别进行EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切，酶切操作方法、步骤按两酶的操作说明进行。所得的酶切片段分别进行1%琼脂糖凝胶电泳及“V”型槽电泳回收，具体操作按卢圣栋[5]的方法进行。经酶切回收的线状质粒DNA与插入片段DNA按1∶3质量比进行混合，在T4DNA连接酶的作用下进行反向定向连接，见图1。连接反应操作步骤按连接酶操作说明进行。取5μl连接产物进行电泳，根据电泳结果分析，初步判断连接效果。然后取2μl(500ng)连接产物进行电穿孔基因转染，电穿孔条件为：1.25kV,25μF,200Ω,穿孔后细菌在氨苄青霉素LB培养板上进行筛选培养。
1.5 重组载体的筛选与鉴定
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用接种环挑取上述在抗菌素LB培养基上生长的细菌菌落分别接种于不同标签的LB培养基试管中进行细菌扩增及质粒小量提取，提取的质粒分别进行电泳及酶切后电泳，若重组质粒大小与线状质粒DNA及目的插入片段DNA之和相同，且在双酶切后能产生与原线状质粒DNA及插入DNA大小相同的两个电泳条带，则说明此重组质粒为目的质粒。扩增此重组质粒并进行插入片段测序，测序结果与MCT1相应目的序列进行比较，进一步证明插入反义基因的正确性。
图1 质粒构建策略图
Ⅰ：用于构建的真核表达载体；Ⅱ：构建策略图
2 结果
2.1 总RNA提取结果
应用10%小牛血清1640培养基培养的A549人肺腺癌细胞株生长旺盛。应用Tripue核酸提取试剂一步法提取的RNA其A260/A280比值为2.0，RNA纯度高。长满10ml瓶底的两瓶细胞可提取的总RNA约为60～100μg。
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2.2 RT-PCR结果
应用我所引物合成软件设计的带有酶切位点的引物经RT-PCR后产生一长约640bp的DNA片段。见图2中泳道3。
2.3 PCR产物、质粒双酶切及连接结果
PCR扩增产物及质粒经双酶切、T4DNA连接酶连接后，1%琼脂糖凝胶电泳证明酶切及连接成功，见图2，可见酶切PCR产物单体、二聚体、三聚体分别位于Maker的564～831bp、947～1375bp、1548～1904bp之间。位于5148bp之后的两条较亮的条带为连接成功的新载体质粒。因加入了插入片段，其比5道的双酶切质粒DNA电泳迁移速度略慢而位于其后。
2.4 重组载体鉴定结果
连接成功的质粒经电穿孔基因转染法在氨苄青霉素的LB琼脂培养板上获得数个阳性转染菌落。此菌落经扩增培养、质粒大量提取、质粒EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切及1%琼脂糖凝胶电泳，同一泳道可见约5.9kb及640bp两条带，与pLXSN酶切片段及插入DNA片段电泳位置相同，证明质粒构建成功，见图3。构建质粒经纯化回收及插入片段测序，测序结果证明插入的基因序列与Genebank中的人心肌细胞的MCT1cDNA中的96～735bp之间的DNA序列相同，证明反义真核表达载体构建成功。
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图2 酶切PCR插入片段、酶切质粒经T4 DNA 连接
酶作用后的电泳结果
1道：大分子量Marker(λDNA+EcoRⅠ+HandⅢ)；2、4道：酶切质粒、酶切PCR产物经T4 DNA连接酶作用后的电泳结果；3道：PCR产物；5道：pLXSN+EcoRⅠ+BamHⅠ；6道：pLXSN质粒
图3 构建质粒双酶切电泳结果
1道：大分子量Marker(λDNA+EcoRⅠ+HindⅢ)；2道：经双酶切(EcoRⅠ+BamHⅠ)的构建质粒；3道：构建的质粒；4道：双酶切pLXSN质粒；5道：双酶切插入片段
3 讨论
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由于肿瘤细胞糖代谢酶谱的改变，以及实体肿瘤组织的特点是肿瘤细胞的生长速度远大于毛细血管的生长速度，因此肿瘤细胞是在一种相对缺氧环境下生长的。显而易见，无氧糖酵解成为肿瘤细胞获取能量的一种主要方式，这种代谢方式导致了肿瘤细胞内乳酸等单羧酸产物大量产生，并可能引起肿瘤细胞胞内酸化和凋零。目前已证明Na+/H+离子交换泵(Na+/H+ exchanger-1,NHE-1)在肿瘤细胞胞内外的氢离子浓度调节方面发挥有一定作用[6]。但此Na+/H+泵并不能转运乳酸等无氧代谢产物，而乳酸等底物的蓄积将反馈抑制糖酵解。因此有理由相信MCT可能在肿瘤细胞的能量代谢及细胞内pH值调节方面发挥重要作用。本研究应用RT-PCR方法直接克隆MCT1基因片段并将其插入真核表达的反转录病毒载体pLXSN中，为进一步细胞水平研究MCT1对肿瘤细胞的作用奠定了基础。应用RT-PCR扩增插入基因片段较质粒扩增、酶切等方法产生插入基因片段简单、灵活、快捷。而且可通过在上下游引物中引入不同的酶切序列，可实现插入片段的正向或反向插入。在应用PCR进行插入基因片段的引物设计过程中，引入不同的内切酶序列时应注意不同的内切酶所需加的保护碱基数目不同。如果在引物酶切序列前所加的保护碱基数目不够，则扩增出的插入片段有可能不被相应的内切酶作用，无法形成粘性末断插入片段。此可能是造成应用此法构建质粒失败的主要原因。
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基金项目： 国家自然科学基金资助项目(39900067)
作者简介： 成党校(1965-)，男，陕西省西安市人，博士研究生，主治医师，讲师，主要从事单羧酸转运泵基因在人肺癌细胞中的表达、pH调节及功能方面的研究，发表论文5篇。电话：(023)68755320
参考文献：
[1] Broer S, Schneider H P, Broer A, et al. Characterization of the monocarboxylate transporter 1 expressed in Xenopus laevis oocytes by changes in cytosolic pH[J]. Biochem J,1998,333(1):167-174.
[2] Price N T, Jackson V N, Halestrap A P, et al. Cloning and sequencing of four new mammalian monocarboxylate transporter (MCT) homologues confirms the existence of a transporter family with an ancient past[J]. Biochem J,1998,329( Pt2):321-328.
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[3] 司徒镇强,吴军正 主编.细胞培养[M].西安：世界图书出版社西安分公司出版，1996.127-135.
[4] 金冬雁，黎孟枫，等译著.分子克隆实验指南[M].第2版.北京：科学出版社，1992.24-25.
[5] 卢圣栋 主编.现代分子生物学实验技术[M].北京：高等教育出版社，1993.128-129.
[6] 黄桂君, 钱桂生. NHE-1基因表达在人肺癌细胞pHi调节及凋亡调控中的作用[J].科学，1998,242(10):64-65.
收稿日期： 1999-12-24；修回日期： 2000-04-02, http://www.100md.com
单位：成党校(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；钱桂生(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；黄桂君(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)
关键词：单羧酸转运泵基因；RT-PCR；反义载体构建
第三军医大学学报000829
提 要： 目的 构建单羧酸转运泵基因反义逆转录病毒真核表达载体。方法 应用RT-PCR方法扩增带有双酶切位点的单羧酸转运泵目的基因片段，与带有相同酶切位点的pLXSN逆转录病毒真核表达载体粘末端进行反向基因插入连接，构建具有反义表达的逆转录病毒载体。结果 构建载体进行双酶切电泳分析及插入片段基因序列分析，证明反义载体构建成功。结论 应用RT-PCR方法扩增插入DNA片段，简单、灵活、快捷。双酶切定向连接构建反义表达载体可实现构建一步到位，免去正反向筛选的麻烦。
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中图法分类号： R394-3 文献标识码： B
文章编号：1000-5404(2000)08-0807-03
Construction of monocarboxylate transporter gene antisense eukaryotic cell expression vector
单羧酸转运泵(Monocarboxylate transporter，MCT)在细胞内外的乳酸转运及H+调节方面具有重要作用[1，2]。本实验应用反义真核表达载体构建技术，构建MCT1反义真核表达载体，对进一步应用反义技术研究肿瘤细胞MCT1基因表达、调控对肿瘤细胞内酸碱及生长代谢的影响具有重要意义。
1 材料与方法
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1.1 细胞与试剂
A549人肺腺癌细胞株及pLXSN逆转录病毒真核表达载体分别为我所保存的细胞株及真核表达载体；1640培养基及小牛血清为Hyclone产品；RNA提取试剂Tripue、RT及PCR试剂盒分别购自德国宝灵曼及美国Promega公司;核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4 DNA连接酶购自MBI公司。
1.2 细胞培养及总RNA提取
A549细胞的培养与传代参照文献[3]进行。RNA提取方法按照Tripue试剂说明书中的操作步骤进行。RNA沉淀经测定后用灭RNA酶三蒸水稀释至2μg/μl。
1.3 RT-PCR产生反向插入基因片段
逆转录步骤根据宝灵曼试剂盒说明书略加修改进行。PCR引物设计根据Genebank中人心肌细胞MCT1cDNA序列应用我所引物设计软件进行设计,同时根据pLXSN真核表达载体多克隆位点中的EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位点的5′～3′方向，在设计的上游引物5′端引入BamHⅠ酶切序列及两个保护碱基,在设计的下游引物5′端引入EcoRⅠ酶切序列及两个保护碱基。其具体序列如下：上游引物(96～117bp)5′ttGGATCCttccatcggcttctcttatgc3′;下游引物(735～715bp)5′gcGAATTCctcttgtttagggtgtcttcc3′。PCR操作步骤按照Promega试剂盒操作说明进行。PCR反应条件为：95°C预变性3min；94°C、40s，59°C、50s，72°C、1min，35个循环后，72°C、10min。
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1.4 表达载体和插入基因片段的酶切与质粒构建
真核表达载体pLXSN的扩增及大量提取，按文献[4]进行。提取的质粒分别进行电泳、紫外分光光度仪检测(A260/A280)，了解所提质粒的大小、纯度及含量。RT-PCR扩增产物和经上述检测合格的质粒分别进行EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切，酶切操作方法、步骤按两酶的操作说明进行。所得的酶切片段分别进行1%琼脂糖凝胶电泳及“V”型槽电泳回收，具体操作按卢圣栋[5]的方法进行。经酶切回收的线状质粒DNA与插入片段DNA按1∶3质量比进行混合，在T4DNA连接酶的作用下进行反向定向连接，见图1。连接反应操作步骤按连接酶操作说明进行。取5μl连接产物进行电泳，根据电泳结果分析，初步判断连接效果。然后取2μl(500ng)连接产物进行电穿孔基因转染，电穿孔条件为：1.25kV,25μF,200Ω,穿孔后细菌在氨苄青霉素LB培养板上进行筛选培养。
1.5 重组载体的筛选与鉴定
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用接种环挑取上述在抗菌素LB培养基上生长的细菌菌落分别接种于不同标签的LB培养基试管中进行细菌扩增及质粒小量提取，提取的质粒分别进行电泳及酶切后电泳，若重组质粒大小与线状质粒DNA及目的插入片段DNA之和相同，且在双酶切后能产生与原线状质粒DNA及插入DNA大小相同的两个电泳条带，则说明此重组质粒为目的质粒。扩增此重组质粒并进行插入片段测序，测序结果与MCT1相应目的序列进行比较，进一步证明插入反义基因的正确性。
图1 质粒构建策略图
Ⅰ：用于构建的真核表达载体；Ⅱ：构建策略图
2 结果
2.1 总RNA提取结果
应用10%小牛血清1640培养基培养的A549人肺腺癌细胞株生长旺盛。应用Tripue核酸提取试剂一步法提取的RNA其A260/A280比值为2.0，RNA纯度高。长满10ml瓶底的两瓶细胞可提取的总RNA约为60～100μg。
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2.2 RT-PCR结果
应用我所引物合成软件设计的带有酶切位点的引物经RT-PCR后产生一长约640bp的DNA片段。见图2中泳道3。
2.3 PCR产物、质粒双酶切及连接结果
PCR扩增产物及质粒经双酶切、T4DNA连接酶连接后，1%琼脂糖凝胶电泳证明酶切及连接成功，见图2，可见酶切PCR产物单体、二聚体、三聚体分别位于Maker的564～831bp、947～1375bp、1548～1904bp之间。位于5148bp之后的两条较亮的条带为连接成功的新载体质粒。因加入了插入片段，其比5道的双酶切质粒DNA电泳迁移速度略慢而位于其后。
2.4 重组载体鉴定结果
连接成功的质粒经电穿孔基因转染法在氨苄青霉素的LB琼脂培养板上获得数个阳性转染菌落。此菌落经扩增培养、质粒大量提取、质粒EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切及1%琼脂糖凝胶电泳，同一泳道可见约5.9kb及640bp两条带，与pLXSN酶切片段及插入DNA片段电泳位置相同，证明质粒构建成功，见图3。构建质粒经纯化回收及插入片段测序，测序结果证明插入的基因序列与Genebank中的人心肌细胞的MCT1cDNA中的96～735bp之间的DNA序列相同，证明反义真核表达载体构建成功。
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图2 酶切PCR插入片段、酶切质粒经T4 DNA 连接
酶作用后的电泳结果
1道：大分子量Marker(λDNA+EcoRⅠ+HandⅢ)；2、4道：酶切质粒、酶切PCR产物经T4 DNA连接酶作用后的电泳结果；3道：PCR产物；5道：pLXSN+EcoRⅠ+BamHⅠ；6道：pLXSN质粒
图3 构建质粒双酶切电泳结果
1道：大分子量Marker(λDNA+EcoRⅠ+HindⅢ)；2道：经双酶切(EcoRⅠ+BamHⅠ)的构建质粒；3道：构建的质粒；4道：双酶切pLXSN质粒；5道：双酶切插入片段
3 讨论
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由于肿瘤细胞糖代谢酶谱的改变，以及实体肿瘤组织的特点是肿瘤细胞的生长速度远大于毛细血管的生长速度，因此肿瘤细胞是在一种相对缺氧环境下生长的。显而易见，无氧糖酵解成为肿瘤细胞获取能量的一种主要方式，这种代谢方式导致了肿瘤细胞内乳酸等单羧酸产物大量产生，并可能引起肿瘤细胞胞内酸化和凋零。目前已证明Na+/H+离子交换泵(Na+/H+ exchanger-1,NHE-1)在肿瘤细胞胞内外的氢离子浓度调节方面发挥有一定作用[6]。但此Na+/H+泵并不能转运乳酸等无氧代谢产物，而乳酸等底物的蓄积将反馈抑制糖酵解。因此有理由相信MCT可能在肿瘤细胞的能量代谢及细胞内pH值调节方面发挥重要作用。本研究应用RT-PCR方法直接克隆MCT1基因片段并将其插入真核表达的反转录病毒载体pLXSN中，为进一步细胞水平研究MCT1对肿瘤细胞的作用奠定了基础。应用RT-PCR扩增插入基因片段较质粒扩增、酶切等方法产生插入基因片段简单、灵活、快捷。而且可通过在上下游引物中引入不同的酶切序列，可实现插入片段的正向或反向插入。在应用PCR进行插入基因片段的引物设计过程中，引入不同的内切酶序列时应注意不同的内切酶所需加的保护碱基数目不同。如果在引物酶切序列前所加的保护碱基数目不够，则扩增出的插入片段有可能不被相应的内切酶作用，无法形成粘性末断插入片段。此可能是造成应用此法构建质粒失败的主要原因。
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基金项目： 国家自然科学基金资助项目(39900067)
作者简介： 成党校(1965-)，男，陕西省西安市人，博士研究生，主治医师，讲师，主要从事单羧酸转运泵基因在人肺癌细胞中的表达、pH调节及功能方面的研究，发表论文5篇。电话：(023)68755320
参考文献：
[1] Broer S, Schneider H P, Broer A, et al. Characterization of the monocarboxylate transporter 1 expressed in Xenopus laevis oocytes by changes in cytosolic pH[J]. Biochem J,1998,333(1):167-174.
[2] Price N T, Jackson V N, Halestrap A P, et al. Cloning and sequencing of four new mammalian monocarboxylate transporter (MCT) homologues confirms the existence of a transporter family with an ancient past[J]. Biochem J,1998,329( Pt2):321-328.
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[3] 司徒镇强,吴军正 主编.细胞培养[M].西安：世界图书出版社西安分公司出版，1996.127-135.
[4] 金冬雁，黎孟枫，等译著.分子克隆实验指南[M].第2版.北京：科学出版社，1992.24-25.
[5] 卢圣栋 主编.现代分子生物学实验技术[M].北京：高等教育出版社，1993.128-129.
[6] 黄桂君, 钱桂生. NHE-1基因表达在人肺癌细胞pHi调节及凋亡调控中的作用[J].科学，1998,242(10):64-65.
收稿日期： 1999-12-24；修回日期： 2000-04-02, http://www.100md.com