中药DNA分子标识鉴定研究进展
作者：肖小河 刘峰群 袁海龙 贺承山 史成和
单位：肖小河 刘峰群 袁海龙 贺承山(中国人民解放军302医院药学部 北京 100039)；史成和(海军总医院药剂科)
关键词：生药学；DNA分子遗传标记；分子生物学技术
中草药000801摘 要 分子生物学技术在生药学中应用研究方兴未艾。综述了DNA分子遗传标记技术在近缘易混淆生药鉴定、药材道地性研究、中药质量标准化、中医药古迹考证、药材种子种苗检测等方面的研究进展，并提出一些值得注意的问题以及今后可能的发展方向。
An Outlook on the Authentication of Traditional Chinese Drug (TCD) by DNA Molecular Markers
Xiao Xiaohe
, http://www.100md.com
(Department of Pharmacy, No.302 Hospital of PLA Beijing 100039)
Liu Fengqun
(Department of Pharmacy, No.302 Hospital of PLA Beijing 100039)
Yuan Hailong
(Department of Pharmacy, No.302 Hospital of PLA Beijing 100039)
He Chengshan
(Department of Pharmacy, No.302 Hospital of PLA Beijing 100039)
, 百拇医药
Shi Chenghe
Department of Pharmacy, General Hospital of Navy
Abstract In view of the ever advancing molecular biology, the prospect to solve some problems on the identification of easily confusable species, the tracing of geo-herbal origin, the standardization of quality control criteria, the archaeological research of ancient remains and the examination of medicinal plant seeds and seedlings of TCD by DNA molecular markers were presented briefly.
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Key words pharmacognosy DNA molecular markers molecular biological technique
当今生命科学不断取得重大突破，分子生物学和基因工程技术日趋成熟，从遗传物质DNA分子水平检测生物遗传多样性并进行分类与鉴定已成为可能。DNA分子遗传标记原理比较简单。依据多态性的检测手段，分子标记可分为三大类：a.基于传统Southern杂交技术的分子标记如限制性内切酶片段长度多态技术(RFLP)；b.基于多聚酶链反应(PCR)的分子标记(PAPD)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任意引物PCR(AP-PCR)、DNA扩增产物指纹(DAF)等；c.PCR-RFLP技术的结合即AFLP技术。依据在基因组中出现的频率，又可将分子标记分为低拷贝序列和重复序列，重复序列包括串联重复和散布重复。DNA分子遗传标记技术具有快速、微量、特异性强的特点，且不受生长发育阶段、供试部位、环境条件的影响，已在中药鉴定学研究中展示了良好的应用前景，并保持强劲的发展势头。笔者综述了DNA分子遗传标记技术在中药鉴定学中的应用发展。
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1 鉴定近缘生药品种
近几年RFLP、PCR、PAPD、AP-PCR、AFLP等DNA分子遗传标记技术已广泛应用于近缘生药品种的整理研究。如Wen等[1]对人参属12 种植物的ITS区和5.8 S-rRNA基因进行了序列分析，结果表明美洲东北部2 个种西洋参Panax quinquefolius与三叶人参P. trifolius中，西洋参与东亚种人参、竹节参P. japonicus、三七P. notoginseng具有更近的亲缘关系，而且ITS序列证明人参、西洋参和三七不是一个单系群(monophyly)。Shaw等[2]用RAPD标记法对人参属3 个品种(人参Panax genseng、西洋参P. quinquefolius、三七P. notogenseng)和4 种伪品(桔梗Platycodon grandiflorum、紫茉莉Mirabilis jalapa、栌兰Talinum paniculatum、商陆Phytolacca acinosa)进行了有效鉴别。Ngan等[3]以保守的植物序列作引物，对核糖体ITS1-5，8S-ITS2的DNA序列进行了扩增，并藉以鉴定人参属6 种药用植物(Panax ginseng, P.quinquefolius, P.notoginseng P.japonicus, P.trifolius, P.major)以及2 种常见的人参伪品(紫茉莉和商陆)；利用RFLP标记技术对上述品种亦可进行有效的区分或鉴别。曹晖等[4～6]利用18～24个碱基的6 种引物进行AP-PCR和用10 个碱基的OPC-6引物进行RAPD扩增，获得了菊科地胆草属2 种植物地胆草Elephantopus scaber、白花地胆草E.mollis和假地胆草属1 种植物假地胆草Pseudoelephantopus spicatus以及4 种商品苦地胆药材DNA指纹图谱，同时测算了其DNA指纹图谱的相似系数，据此可区别中药苦地胆及其混淆品白花地胆草和假地胆草。Yamazaki等[7～9]利用OPD-2和OPE-2引物进行RAPD扩增，获取甘草属4 种药用植物光果甘草Glycyrrhiza glabra、甘草G. uralensis、刺甘草G. echinata和刺果甘草G. pallidiflora的DNA指纹图；以Bam H1、Dral、Eco12091、HinfⅠ和HcoⅠ酶解后与水稻rDNA基因pRR217进行分子杂交和RFLP指纹图分析，建立其亲缘关系树，结果发现富含甘草甜素(glycyrrhizin)的品种光果甘草和甘草之间遗传关系非常相近，这两者与不含甘草甜素或含量极低的刺甘草和刺果甘草的遗传关系则较远，与传统植物分类研究结果吻合。国内外学者运用RAPD、RFLP、AFLP等分子标记法对淫羊藿属Epimedium[11]、黄芪属Astragalus[12，13]、木蓝属Indigoferae[14]、黄连属Coptis[15，16]、山麦冬属Liriope[17，18]、贝母属Fritillaria、栝楼属Trichosanthes、铁线莲属Climatis[19]、香茶菜属Isodon[20]、姜黄属Curcuma[21]、苍术属Atractylodes[22～24]、大麻属Cannabis[25～27]、沙参属Adenophora[28]、紫苏属Perilla[29]、天南星属Arisaema[30]、百合属Lilium[10]、澳茄属Duboisia[31]、莴苣属Lactuca[32]、柑橘属Citrus[33]等药用植物进行了较为系统的研究。
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2 鉴定名贵易混淆生药品种
珍稀名贵中药是祖国传统医药宝库的精粹之一，同时亦是生药品种混乱及伪劣药材的高频区。不少珍稀品种如冬虫夏草、番红花、金钗石斛、囊鞘麝香、穿山甲、犀角、虎骨、天然牛黄、天然熊胆、蛤士蚂、海马、玳瑁等来源有限，采用NDA分子遗传标记技术鉴定，取样量少，避免了贵重样品的损耗，即使从动植物生物标本上直接取样也不会造成标本整体的破坏，因而具有独到的优势。Fushimi等[34]通过变异等位基因扩增技术(MASA)对mat K基因片段测序发现，人参P. ginseng与西洋参P. quinquefolius、竹节参P. japonicus间的mat K基因片段上第102号核苷酸序列不同，以此来鉴别人参、西洋参，结果非常可靠。陈月琴等[35]采用末端终止法对杜仲大分子rRNA基因(25SrDNA)5′端基因进行测序，根据序列中核苷酸的变化可有效地鉴别杜仲与其它相关类群。
3 鉴定动物类生药品种
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DNA分子遗传标记技术不仅能对有形的动物药整体及破碎部分器官组织进行准确的鉴定，而且对以动物粉末、体液、分泌物和排泄物入药的生药及制剂进行有效的真伪鉴定、纯度检查与质量评价，如龟鳖胶囊、纯蛇粉、鹿血粉、犀角粉、水牛角粉和麝香等。
近年来国内动物药的DNA分子鉴定报道较多。如王亚胆等[36]从保存9 年以上的药材龟板和鳖甲中提取出DNA，并用细胞色素b基因片段的通用引物对(引物间距500 bp)，通过PCR扩增到了长约500 bp的DNA片段，成功地对龟板和鳖甲进行了DNA指纹鉴定，为分子标记技术引进到中药鉴定提供了基础资料。王建云等[37]利用陈旧皮革的DNA提取技术从鸡内金、鸭内金提取DNA，通过PCR技术，以线粒体DNA细胞素b(cyt-b)通用引物中的L14841和H15149为引物扩增片段，将扩增后的DNA用双脱氧链终止法测定其序列，表明鸡内金与鸭内金的DNA序列有明显差异，以此能准确鉴别鸡内金和鸭内金。王建云等[38]采用微量DNA提取技术，在梅花鹿血、毛，鹿鞭，鹿茸，牛鞭，驴鞭中提取DNA，以线粒体DNA细胞色素b通用引物L14841和H15149扩增约307 bp DNA片段，扩增产物纯化后采用双脱氧链终止法测定其序列，结果证明梅花鹿毛、血和鹿鞭的DNA序列完全一样，而所谓的“鹿茸”则与其有较大的差异。王义权等[39]将RAPD标记技术用于蛇类动物的分类学研究和鉴定，结果表明RAPD标记技术不仅能够用于蛇类动物种间系统演化、种内个体间遗传多样性，并且可以用于蛇类药材的鉴定。吴平等[18]应用RAPD分析能有效地鉴定海马类药材。熊丽娟等[40]用DNA序列分析法鉴别中药紫河车获得成功。
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4 鉴定药材道地性
在中医药长期医疗实践中，道地药材一直是评价药材品质的独特的综合性标准。道地药材与非道地药材物种来源一致或十分相近，在形态、生药性状及化学成分等特征上具有高度相似性，因而道地药材的鉴别往往不容易，具有很大的主观性。
作为现代分子生物学技术重要的手段的DNA分子遣传标记方法，将使从居群和分子水平上阐明药材道地性的生物学实质成为可能。陈永久等[41]利用RAPD技术研究了冬虫夏草Cordyceps sinensis的不同地理群体间的遗传分化现象，结果表明：来自同一地方的样品遗传差异甚微，同一区域不同地方的样品间遗传差异较大，不同区域的样品间遗传差异最大，这为冬虫夏草的药材道地性研究提供了分子水平的支持依据。肖小河[21]研究表明，RAPD技术不仅能正确鉴别姜黄属不同种间群体，而且对种内等级亦能进行有效的刻划，可作为姜黄属药用植物的分类鉴定与道地性评价的新手段。陈林娇等[20]应用RAPD技术发现2 个不同产地的狭基线纹香茶菜居群的扩增产物并不完全一致，如D-20引物广东瑶坪产的比广州产的多出一条1263 bp带，这为揭示道地药材的生物学本质提供了一些线索。Mizukami等[42]在对日本5 个产地的北沙参Gleh-nia littoralis进行RFLP分析，发现其地理遗传多样性小，用rDNA作探针难以检测彼此间的差异，结果为药材道地性的研究提供新的启示。
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5 鉴定野生与家种(养)生药
由于生态环境改变和人们生产活动的影响，生物的遗传特性及其生药品质在一定程度上产生了变化。产地和栽培对生药品质及药性产生巨大影响。在人类回归自然的呼声日益高涨的今天，人们普遍认为野生品比栽培品质更好，同时由于经济利益的驱使，以栽培品冒充野生品的现象时有发生，给临床使用及商品流通造成混乱。栽培品和野生品都来自同一个物种，植物形态、药材性状、化学成分、生物活性等往往无明显差异。DNA分子遗传标记技术因不受药材的生境条件等因素的影响，在野生药材与其栽培品的比较研究方面具有良好的应用前景，如野山参Panax ginseng与园参和园参的DNA分子标识鉴别、栽培姜黄Curcuma longa与野生姜黄的鉴别、野生天麻Gastrodia elata与栽培天麻等。
6 鉴定特殊药材
当今人们从自然界获取药物的来源越来越多，而且来源越来越复杂，生药不再局限于传统生药的形式，如人工发酵产品(如冬虫夏草和灵芝菌丝体等)、海洋湖泊生物(鱼类、海藻类、螺旋藻类、软体动物类等)、土壤微生物类等已成为新一轮天然药物研究与开发的热点，将大大丰富祖国医药宝库；与此同时，生药新人工代用品(如塞龙骨代虎骨、水牛角代犀牛角等)以及新生掺伪品不断涌现，给生药鉴定带来新的问题。采用DNA分子遗传标记技术能够在分子水平对任何来源的生药样品进行分析鉴定，且不受形态、来源等因素的影响，对来源于生物工程的样品同样可以进行分析鉴定。
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7 生药质量标准化的DNA分子刻划
生药质量标准化目前多局限于化学成分的考察，但是品种的标准化应是质量标准化的前提和关键，特别是当今新资源不断出现、栽培品种不断退化，品种标准化尤为迫切。品种标准化应包括主流品种及其种下等级筛选和优化，传统生药学和药用植物栽培学难以进行快速准确的评价。此外，对相当多数的生药欲建立基于化学分析的质控方法和标准目前尚难以实现，但DNA分子遗传标记可从分子水平定性定量刻划生药主流品种及其种下等级的遗传背景差异，为生药品种标准化提供先进可行的技术和稳定可靠的标准。
在日本，茅苍术Atractylodes lancea和北苍术A. chinensis作苍术用，关苍术A. japonica和白术A. macrocephala作白术用，挥发油化学分析发现，苍术类主要含苍术素(atractylodin)，而白术类主要含苍术酮(atractylon)。《日本药局方》以此成分的差异作为白术与苍术的理化鉴别依据。然而日本市售苍术商品药材中含有白术类植物杂交的结果。Kohiyouma等[22]采用RAPD方法对日本和中国野生或栽培的术类进行分析，发现日本栽培的茅苍术与中国产的RAPD指纹几乎一致，并Mizukami等[45]的RFLP分析结构相吻合。虽然存在含较高苍术酮的茅苍术，但未显示出茅苍术与白术或关苍术的杂交谱带，表明茅苍术存在种内变异。Gillan等[27]对来源于3个组17 份大麻Cannabis sativa样品同时应用RAPD与HPLC法鉴别，其中2 组样品以HPLC法难以区分，但RAPD技术可有效地鉴别所有3 组样品。Yamazaki等[8]根据RFLP分析结果，建立了黄羽扇豆属Lupinus植物的分子系统发育树，并探讨了其与所含生物碱成分类型的相关性，在利用DNA分子遗传标记寻找和扩大生药资源方面进行了一些开拓性的工作。
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8 鉴定中药原粉制剂
绝大部分中成药是经过化学提取而制成的不含原生药的中药制剂。但传统剂型如散剂、丸剂及现代剂型袋泡茶、片剂、胶囊等中成药仍含部分或微量生药如玉屏风散、大活络丸等，有的甚至为全原生药，如龟鳖胶囊、纯蛇粉、鹿血粉等。由于中成药的组成及成分复杂性，干扰因素多、用传统生药学方法鉴定上述含生药中药制剂或鉴定全原生药制剂的真伪及纯度存有较大的难度，DNA分子遗传标记不仅能准确地鉴别中成药中的微量生药成分，而且有效地检测全原生药制剂纯度及质量。因而DNA分子遗传标记技术在中成药鉴别与质量研究方面具有良好的应用前景。
RAPD标记技术首次用于复方中药制剂的研究是对玉屏风散中黄芪、白术、防风3 味生药的检查[16]，作者首先从400 个寡核苷酸随机引物中筛选RAPD引物OPP-10，含有3 组分的制剂总DNA分子以OPP-10为引物的RAPD扩增产物能够分别标记这3 个组分，200 bp DNA，440 bp DNA，500 bp DNA分子标记分别是黄芪、白术、防风3 组分的特殊DNA片段，由此3 个组分得以检出。Hakamatsuka等[43]运用定量PCR技术与灵敏度极高的反转录PCR(RT-PCR)方法对复方中黄连建立了DNA分子定量分析标准。上述研究证明，DNA分析技术完全可以用于含有生物粉末的中成药中的组分鉴定。
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9 中医药古迹的DNA分子辅助考证
人类使用中草药的历史已有几千年，前人为我们留下了浩如烟海的本草资料。如何从中获取到真实可靠的医药知识，对今天的天然药物的开发利用有极为重要的意义。中医药实物古迹(包括寺庙或博物馆珍藏标本、出土生药、生药化石等)是中医药文化和本草考证最有力的依据之一。DNA分子遗传标记能对微量或高度降解的DNA样品进行分析，取样不损坏标本，对干燥、变形、变质的生药样品甚至动植物的化石进行有效的鉴定。因此，充分利用有限的中医药古迹实物，采用包括DNA分子遣传标记在内的鉴定技术，系统地考察中药材品种延续和变迁及其规律和实质，将是今后本草考证的重要方向。
现代分子遗传标记技术用于古生物学及本草考证已取得进展。如Golenberg等[44]从中新世木兰属植物Magnolia latahensis的叶片化石中成功地提取了cpDNA，并运用PCR技术扩增出了820 个碱基的rbcL基因片段，其中对759个碱基进行了测序，发现与现在的M.macrophylla的rbcL基因片段有97%的同源性。1958年在北京西郊太舟村挖掘到大量乌黑、坚硬的古莲子，取名为“太子莲”，经C14测定，太子莲的寿命距今已久(580±70年)，采用传统方法不能将它们与现代莲进行比较研究。采用RAPD及微卫星(SSR)DNA多态性检测了“太子连”与中国红花莲Nelumbo nucifera遗传多样性及莲的生物学特性、地理分布的关系[46]，结果表明：太子莲与河北、哈尔滨、湖南、江西等地的红花莲拥有共同的祖先，但仍有遗传差异，由此结合本草记述的莲的形态，可对古代医家所用莲子与现代所用的莲子进行科学的比较研究，从而得到准确的考证结果。
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10 鉴定药用植物种子种苗纯度及雌雄
药用植物种子的纯度和雌雄的鉴定一般多采用田间种植试验，周期长，花费大。RAPD作为一种在分子水平上的遗传标记，能够依据基因组DNA多态性进行种子纯度和雌雄检测，从而取得对栽培种子纯度和雌雄及质量的准确评价，防止劣质种子的流入及劣质药材的产生，减少经济损失。生药种子的纯度还直接影响品种的标准化，利用RAPD技术检测生药种子的纯度和雌雄及其相关质量是十分必要和完全可能的。
11 结语
DNA分子遗传标记技术在中药鉴定及其相关研究方面具有独到的优势和广阔的应用前景，但目前尚处于探索阶段。各种DNA分子遗传技术均存在一定的局限性，有待进一步规范和完善。中药分子鉴定实验有几个值得注意的问题：1)目的基因的真实性与DNA同源性；2)DNA分子标记技术的稳定性；3)分子生物的研究成本等。
, http://www.100md.com 现代分子生物学技术在中药学研究中方兴未艾。但目前DNA分子遗传标记技术应用主要表现在中药鉴定方面，在中药学研究深度和广度方面尚存在很大的局限性。此外，目前常用于中药鉴定的DNA分子遗传标记技术有RFLP、RAPD、AP-PCR、AFLP等，但与已出现的几十种分子遗传标记技术相比，只是其中的一小部分。随着分子生物学的发展，新的分子标记技术还将不断问世。
利用DNA分子遗传标记技术，开展有关药用动物遗传背景与化学成分相关性的研究，实现中药品种——质量标准化、基因工程生产天然活性成分及寻找和扩大新药源；开展中药重要性状包括品质、产量和抗性的分子标记，实现中药材分子育种及品质人工调控，将是中药分子鉴定学既富挑战又具现实意义的大课题。
肖小河 男，1963年生。中国人民解放军第三○二医院药学部副主任、副研究员、药学博士 、 硕士生导师。1985年湖南中医学院中药本科毕业，1988年于成都中医药大学获硕士学位，19 98年于第二军医大学获博士学位。从事生药学特别是中药资源与道地药材研究多年。自1999 年以 来主要从事天然药物研究开发、中药药性理论与药效物质基础研究、军事本草药物调查整理 等工作。负责和主研军内外科研项目约20余项，在全国核心刊物上发表学术论文60余篇。
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1 鉴定近缘生药品种
近几年RFLP、PCR、PAPD、AP-PCR、AFLP等DNA分子遗传标记技术已广泛应用于近缘生药品种的整理研究。如Wen等[1]对人参属12 种植物的ITS区和5.8 S-rRNA基因进行了序列分析，结果表明美洲东北部2 个种西洋参Panax quinquefolius与三叶人参P. trifolius中，西洋参与东亚种人参、竹节参P. japonicus、三七P. notoginseng具有更近的亲缘关系，而且ITS序列证明人参、西洋参和三七不是一个单系群(monophyly)。Shaw等[2]用RAPD标记法对人参属3 个品种(人参Panax genseng、西洋参P. quinquefolius、三七P. notogenseng)和4 种伪品(桔梗Platycodon grandiflorum、紫茉莉Mirabilis jalapa、栌兰Talinum paniculatum、商陆Phytolacca acinosa)进行了有效鉴别。Ngan等[3]以保守的植物序列作引物，对核糖体ITS1-5，8S-ITS2的DNA序列进行了扩增，并藉以鉴定人参属6 种药用植物(Panax ginseng, P.quinquefolius, P.notoginseng P.japonicus, P.trifolius, P.major)以及2 种常见的人参伪品(紫茉莉和商陆)；利用RFLP标记技术对上述品种亦可进行有效的区分或鉴别。曹晖等[4～6]利用18～24个碱基的6 种引物进行AP-PCR和用10 个碱基的OPC-6引物进行RAPD扩增，获得了菊科地胆草属2 种植物地胆草Elephantopus scaber、白花地胆草E.mollis和假地胆草属1 种植物假地胆草Pseudoelephantopus spicatus以及4 种商品苦地胆药材DNA指纹图谱，同时测算了其DNA指纹图谱的相似系数，据此可区别中药苦地胆及其混淆品白花地胆草和假地胆草。Yamazaki等[7～9]利用OPD-2和OPE-2引物进行RAPD扩增，获取甘草属4 种药用植物光果甘草Glycyrrhiza glabra、甘草G. uralensis、刺甘草G. echinata和刺果甘草G. pallidiflora的DNA指纹图；以Bam H1、Dral、Eco12091、HinfⅠ和HcoⅠ酶解后与水稻rDNA基因pRR217进行分子杂交和RFLP指纹图分析，建立其亲缘关系树，结果发现富含甘草甜素(glycyrrhizin)的品种光果甘草和甘草之间遗传关系非常相近，这两者与不含甘草甜素或含量极低的刺甘草和刺果甘草的遗传关系则较远，与传统植物分类研究结果吻合。国内外学者运用RAPD、RFLP、AFLP等分子标记法对淫羊藿属Epimedium[11]、黄芪属Astragalus[12，13]、木蓝属Indigoferae[14]、黄连属Coptis[15，16]、山麦冬属Liriope[17，18]、贝母属Fritillaria、栝楼属Trichosanthes、铁线莲属Climatis[19]、香茶菜属Isodon[20]、姜黄属Curcuma[21]、苍术属Atractylodes[22～24]、大麻属Cannabis[25～27]、沙参属Adenophora[28]、紫苏属Perilla[29]、天南星属Arisaema[30]、百合属Lilium[10]、澳茄属Duboisia[31]、莴苣属Lactuca[32]、柑橘属Citrus[33]等药用植物进行了较为系统的研究。
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2 鉴定名贵易混淆生药品种
珍稀名贵中药是祖国传统医药宝库的精粹之一，同时亦是生药品种混乱及伪劣药材的高频区。不少珍稀品种如冬虫夏草、番红花、金钗石斛、囊鞘麝香、穿山甲、犀角、虎骨、天然牛黄、天然熊胆、蛤士蚂、海马、玳瑁等来源有限，采用NDA分子遗传标记技术鉴定，取样量少，避免了贵重样品的损耗，即使从动植物生物标本上直接取样也不会造成标本整体的破坏，因而具有独到的优势。Fushimi等[34]通过变异等位基因扩增技术(MASA)对mat K基因片段测序发现，人参P. ginseng与西洋参P. quinquefolius、竹节参P. japonicus间的mat K基因片段上第102号核苷酸序列不同，以此来鉴别人参、西洋参，结果非常可靠。陈月琴等[35]采用末端终止法对杜仲大分子rRNA基因(25SrDNA)5′端基因进行测序，根据序列中核苷酸的变化可有效地鉴别杜仲与其它相关类群。
3 鉴定动物类生药品种
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DNA分子遗传标记技术不仅能对有形的动物药整体及破碎部分器官组织进行准确的鉴定，而且对以动物粉末、体液、分泌物和排泄物入药的生药及制剂进行有效的真伪鉴定、纯度检查与质量评价，如龟鳖胶囊、纯蛇粉、鹿血粉、犀角粉、水牛角粉和麝香等。
近年来国内动物药的DNA分子鉴定报道较多。如王亚胆等[36]从保存9 年以上的药材龟板和鳖甲中提取出DNA，并用细胞色素b基因片段的通用引物对(引物间距500 bp)，通过PCR扩增到了长约500 bp的DNA片段，成功地对龟板和鳖甲进行了DNA指纹鉴定，为分子标记技术引进到中药鉴定提供了基础资料。王建云等[37]利用陈旧皮革的DNA提取技术从鸡内金、鸭内金提取DNA，通过PCR技术，以线粒体DNA细胞素b(cyt-b)通用引物中的L14841和H15149为引物扩增片段，将扩增后的DNA用双脱氧链终止法测定其序列，表明鸡内金与鸭内金的DNA序列有明显差异，以此能准确鉴别鸡内金和鸭内金。王建云等[38]采用微量DNA提取技术，在梅花鹿血、毛，鹿鞭，鹿茸，牛鞭，驴鞭中提取DNA，以线粒体DNA细胞色素b通用引物L14841和H15149扩增约307 bp DNA片段，扩增产物纯化后采用双脱氧链终止法测定其序列，结果证明梅花鹿毛、血和鹿鞭的DNA序列完全一样，而所谓的“鹿茸”则与其有较大的差异。王义权等[39]将RAPD标记技术用于蛇类动物的分类学研究和鉴定，结果表明RAPD标记技术不仅能够用于蛇类动物种间系统演化、种内个体间遗传多样性，并且可以用于蛇类药材的鉴定。吴平等[18]应用RAPD分析能有效地鉴定海马类药材。熊丽娟等[40]用DNA序列分析法鉴别中药紫河车获得成功。
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4 鉴定药材道地性
在中医药长期医疗实践中，道地药材一直是评价药材品质的独特的综合性标准。道地药材与非道地药材物种来源一致或十分相近，在形态、生药性状及化学成分等特征上具有高度相似性，因而道地药材的鉴别往往不容易，具有很大的主观性。
作为现代分子生物学技术重要的手段的DNA分子遣传标记方法，将使从居群和分子水平上阐明药材道地性的生物学实质成为可能。陈永久等[41]利用RAPD技术研究了冬虫夏草Cordyceps sinensis的不同地理群体间的遗传分化现象，结果表明：来自同一地方的样品遗传差异甚微，同一区域不同地方的样品间遗传差异较大，不同区域的样品间遗传差异最大，这为冬虫夏草的药材道地性研究提供了分子水平的支持依据。肖小河[21]研究表明，RAPD技术不仅能正确鉴别姜黄属不同种间群体，而且对种内等级亦能进行有效的刻划，可作为姜黄属药用植物的分类鉴定与道地性评价的新手段。陈林娇等[20]应用RAPD技术发现2 个不同产地的狭基线纹香茶菜居群的扩增产物并不完全一致，如D-20引物广东瑶坪产的比广州产的多出一条1263 bp带，这为揭示道地药材的生物学本质提供了一些线索。Mizukami等[42]在对日本5 个产地的北沙参Gleh-nia littoralis进行RFLP分析，发现其地理遗传多样性小，用rDNA作探针难以检测彼此间的差异，结果为药材道地性的研究提供新的启示。
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5 鉴定野生与家种(养)生药
由于生态环境改变和人们生产活动的影响，生物的遗传特性及其生药品质在一定程度上产生了变化。产地和栽培对生药品质及药性产生巨大影响。在人类回归自然的呼声日益高涨的今天，人们普遍认为野生品比栽培品质更好，同时由于经济利益的驱使，以栽培品冒充野生品的现象时有发生，给临床使用及商品流通造成混乱。栽培品和野生品都来自同一个物种，植物形态、药材性状、化学成分、生物活性等往往无明显差异。DNA分子遗传标记技术因不受药材的生境条件等因素的影响，在野生药材与其栽培品的比较研究方面具有良好的应用前景，如野山参Panax ginseng与园参和园参的DNA分子标识鉴别、栽培姜黄Curcuma longa与野生姜黄的鉴别、野生天麻Gastrodia elata与栽培天麻等。
6 鉴定特殊药材
当今人们从自然界获取药物的来源越来越多，而且来源越来越复杂，生药不再局限于传统生药的形式，如人工发酵产品(如冬虫夏草和灵芝菌丝体等)、海洋湖泊生物(鱼类、海藻类、螺旋藻类、软体动物类等)、土壤微生物类等已成为新一轮天然药物研究与开发的热点，将大大丰富祖国医药宝库；与此同时，生药新人工代用品(如塞龙骨代虎骨、水牛角代犀牛角等)以及新生掺伪品不断涌现，给生药鉴定带来新的问题。采用DNA分子遗传标记技术能够在分子水平对任何来源的生药样品进行分析鉴定，且不受形态、来源等因素的影响，对来源于生物工程的样品同样可以进行分析鉴定。
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7 生药质量标准化的DNA分子刻划
生药质量标准化目前多局限于化学成分的考察，但是品种的标准化应是质量标准化的前提和关键，特别是当今新资源不断出现、栽培品种不断退化，品种标准化尤为迫切。品种标准化应包括主流品种及其种下等级筛选和优化，传统生药学和药用植物栽培学难以进行快速准确的评价。此外，对相当多数的生药欲建立基于化学分析的质控方法和标准目前尚难以实现，但DNA分子遗传标记可从分子水平定性定量刻划生药主流品种及其种下等级的遗传背景差异，为生药品种标准化提供先进可行的技术和稳定可靠的标准。
在日本，茅苍术Atractylodes lancea和北苍术A. chinensis作苍术用，关苍术A. japonica和白术A. macrocephala作白术用，挥发油化学分析发现，苍术类主要含苍术素(atractylodin)，而白术类主要含苍术酮(atractylon)。《日本药局方》以此成分的差异作为白术与苍术的理化鉴别依据。然而日本市售苍术商品药材中含有白术类植物杂交的结果。Kohiyouma等[22]采用RAPD方法对日本和中国野生或栽培的术类进行分析，发现日本栽培的茅苍术与中国产的RAPD指纹几乎一致，并Mizukami等[45]的RFLP分析结构相吻合。虽然存在含较高苍术酮的茅苍术，但未显示出茅苍术与白术或关苍术的杂交谱带，表明茅苍术存在种内变异。Gillan等[27]对来源于3个组17 份大麻Cannabis sativa样品同时应用RAPD与HPLC法鉴别，其中2 组样品以HPLC法难以区分，但RAPD技术可有效地鉴别所有3 组样品。Yamazaki等[8]根据RFLP分析结果，建立了黄羽扇豆属Lupinus植物的分子系统发育树，并探讨了其与所含生物碱成分类型的相关性，在利用DNA分子遗传标记寻找和扩大生药资源方面进行了一些开拓性的工作。
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8 鉴定中药原粉制剂
绝大部分中成药是经过化学提取而制成的不含原生药的中药制剂。但传统剂型如散剂、丸剂及现代剂型袋泡茶、片剂、胶囊等中成药仍含部分或微量生药如玉屏风散、大活络丸等，有的甚至为全原生药，如龟鳖胶囊、纯蛇粉、鹿血粉等。由于中成药的组成及成分复杂性，干扰因素多、用传统生药学方法鉴定上述含生药中药制剂或鉴定全原生药制剂的真伪及纯度存有较大的难度，DNA分子遗传标记不仅能准确地鉴别中成药中的微量生药成分，而且有效地检测全原生药制剂纯度及质量。因而DNA分子遗传标记技术在中成药鉴别与质量研究方面具有良好的应用前景。
RAPD标记技术首次用于复方中药制剂的研究是对玉屏风散中黄芪、白术、防风3 味生药的检查[16]，作者首先从400 个寡核苷酸随机引物中筛选RAPD引物OPP-10，含有3 组分的制剂总DNA分子以OPP-10为引物的RAPD扩增产物能够分别标记这3 个组分，200 bp DNA，440 bp DNA，500 bp DNA分子标记分别是黄芪、白术、防风3 组分的特殊DNA片段，由此3 个组分得以检出。Hakamatsuka等[43]运用定量PCR技术与灵敏度极高的反转录PCR(RT-PCR)方法对复方中黄连建立了DNA分子定量分析标准。上述研究证明，DNA分析技术完全可以用于含有生物粉末的中成药中的组分鉴定。
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9 中医药古迹的DNA分子辅助考证
人类使用中草药的历史已有几千年，前人为我们留下了浩如烟海的本草资料。如何从中获取到真实可靠的医药知识，对今天的天然药物的开发利用有极为重要的意义。中医药实物古迹(包括寺庙或博物馆珍藏标本、出土生药、生药化石等)是中医药文化和本草考证最有力的依据之一。DNA分子遗传标记能对微量或高度降解的DNA样品进行分析，取样不损坏标本，对干燥、变形、变质的生药样品甚至动植物的化石进行有效的鉴定。因此，充分利用有限的中医药古迹实物，采用包括DNA分子遣传标记在内的鉴定技术，系统地考察中药材品种延续和变迁及其规律和实质，将是今后本草考证的重要方向。
现代分子遗传标记技术用于古生物学及本草考证已取得进展。如Golenberg等[44]从中新世木兰属植物Magnolia latahensis的叶片化石中成功地提取了cpDNA，并运用PCR技术扩增出了820 个碱基的rbcL基因片段，其中对759个碱基进行了测序，发现与现在的M.macrophylla的rbcL基因片段有97%的同源性。1958年在北京西郊太舟村挖掘到大量乌黑、坚硬的古莲子，取名为“太子莲”，经C14测定，太子莲的寿命距今已久(580±70年)，采用传统方法不能将它们与现代莲进行比较研究。采用RAPD及微卫星(SSR)DNA多态性检测了“太子连”与中国红花莲Nelumbo nucifera遗传多样性及莲的生物学特性、地理分布的关系[46]，结果表明：太子莲与河北、哈尔滨、湖南、江西等地的红花莲拥有共同的祖先，但仍有遗传差异，由此结合本草记述的莲的形态，可对古代医家所用莲子与现代所用的莲子进行科学的比较研究，从而得到准确的考证结果。
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10 鉴定药用植物种子种苗纯度及雌雄
药用植物种子的纯度和雌雄的鉴定一般多采用田间种植试验，周期长，花费大。RAPD作为一种在分子水平上的遗传标记，能够依据基因组DNA多态性进行种子纯度和雌雄检测，从而取得对栽培种子纯度和雌雄及质量的准确评价，防止劣质种子的流入及劣质药材的产生，减少经济损失。生药种子的纯度还直接影响品种的标准化，利用RAPD技术检测生药种子的纯度和雌雄及其相关质量是十分必要和完全可能的。
11 结语
DNA分子遗传标记技术在中药鉴定及其相关研究方面具有独到的优势和广阔的应用前景，但目前尚处于探索阶段。各种DNA分子遗传技术均存在一定的局限性，有待进一步规范和完善。中药分子鉴定实验有几个值得注意的问题：1)目的基因的真实性与DNA同源性；2)DNA分子标记技术的稳定性；3)分子生物的研究成本等。
, http://www.100md.com 现代分子生物学技术在中药学研究中方兴未艾。但目前DNA分子遗传标记技术应用主要表现在中药鉴定方面，在中药学研究深度和广度方面尚存在很大的局限性。此外，目前常用于中药鉴定的DNA分子遗传标记技术有RFLP、RAPD、AP-PCR、AFLP等，但与已出现的几十种分子遗传标记技术相比，只是其中的一小部分。随着分子生物学的发展，新的分子标记技术还将不断问世。
利用DNA分子遗传标记技术，开展有关药用动物遗传背景与化学成分相关性的研究，实现中药品种——质量标准化、基因工程生产天然活性成分及寻找和扩大新药源；开展中药重要性状包括品质、产量和抗性的分子标记，实现中药材分子育种及品质人工调控，将是中药分子鉴定学既富挑战又具现实意义的大课题。
肖小河 男，1963年生。中国人民解放军第三○二医院药学部副主任、副研究员、药学博士 、 硕士生导师。1985年湖南中医学院中药本科毕业，1988年于成都中医药大学获硕士学位，19 98年于第二军医大学获博士学位。从事生药学特别是中药资源与道地药材研究多年。自1999 年以 来主要从事天然药物研究开发、中药药性理论与药效物质基础研究、军事本草药物调查整理 等工作。负责和主研军内外科研项目约20余项，在全国核心刊物上发表学术论文60余篇。
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(1999-10-12收稿), 百拇医药