芸香科植物飞龙掌血愈伤组织细胞培养物生物碱成分的研究
作者：司书毅 生田安喜良
单位：司书毅(中国医学科学院 中国协和医科大学 医药生物技术研究所 北京 100050)；生田安喜良(日本国东京理科大学综合研究所)
关键词：飞龙掌血；愈伤组织；细胞培养；生物碱
中草药000806 摘 要 目的：为研究芸香科各亚科及属之间的亲缘关系及化学分类基础。方法：对药用植物飞龙掌血(Toddalia asiatica)愈伤组织进行诱导生长和继代培养，收获培养7周的组织块，甲醇和乙酸乙酯提取物通过多次硅胶柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析等方法进行生物碱等化学成分的分离与结构鉴定。结果：为采用药用植物飞龙掌血愈伤组织细胞培养的方法制备喹啉呋喃类药用生物碱提供依据。
芸香科植物飞龙掌血为产于亚洲、非洲及澳洲等地的一种药用植物[1，2]，其有效成分主要为生物碱和香豆素等。本科植物中所含的生物碱已被用来作为化学分类的重要依据。利用愈伤组织进行培养，对于研究生物碱等成分的生物合成途径以及用简单培养方法获得有效成分都是很有意义的。
, 百拇医药
1 实验材料与仪器
愈伤组织的诱生与继代培养：将新采集的原植物的茎与叶无菌操作下用刀片切成小块，经10%次氯酸钠消毒后，植于含有生长激素NAA(3 mg/L)和Kin(0.1 mg/L)或2，4-D(3 mg/L)和Kin(0.1 mg/L)的MS培养基上，在26 ℃下无菌孵育诱生约4 周后，将新生愈伤组织转植于含有2，4-D(1 mg/L)和Kin(0.1 mg/L)的MS培养基上进行继代培养，经数次继代扩大培养后收获(每一代培养周期为6～7周)。
JEOL JMS-SX102A质谱仪；GSX-500核磁共振仪，CDCl3为溶液，TMS为内标。层析用硅胶(日本产，100～160 目和160～200 目)，纯化用Sephadex LH-20凝胶(瑞典Pharmacia公司)；薄层层析板(Merck产，Kieselgel 60 F254，Art. 5715)。显色剂：Dragendorff显色剂。
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2 提取与分离
将收获的愈伤组织块(湿重2.77 kg，干重约140 g)首先用冷甲醇4 000 mL浸泡一夜，去糖苷类成分，滤渣强力搅拌后依次用甲醇(4 000 mL×2)、甲醇-乙酸乙酯(1∶1)(4 000 mL×3)、乙酸乙酯(4 000 mL×2)加热回流提取，冷却后过滤，滤液经减压浓缩后得黄棕色油状物，油状物分别加氯仿和水各600 mL进行萃取，分层后，水层再用氯仿萃取3 次，合并氯仿中，减压浓缩至干得约6 g油状物。
将3.5 g提取物溶于10 mL氯仿中，上样于150 g硅胶柱(200 目)，分别用正己烷-乙酸乙酯(50∶1；20∶1；10∶1)、氯仿、氯仿-乙酸乙酯(5∶1)、氯仿-甲醇(20∶1；10∶1；1∶1)和甲醇等梯度洗脱。其中，氯仿-乙酸乙酯(5∶1)洗脱的第8组分和第9～12组分经薄层层析分析发现有生物碱成分存在。氯仿-乙酸乙酯(5∶1)洗脱的第8组分经两次Sephadex LH-20凝胶柱分离得到化合物Ⅰ纯品。氯仿-乙酸乙酯(5∶1)洗脱的第9～12组分经再一次硅胶柱层析，用苯-乙酸乙酯(20∶1；12∶1；10∶1)梯度洗脱，根据薄层层析分析结果，将苯-乙酸乙酯(20∶1)洗脱的第6组分和苯-乙酸乙酯(12∶1)洗脱的第1组分合并，再经1 次Sephadex LH-20凝胶柱层析纯化得到化合物Ⅱ纯品。
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3 鉴定
化合物Ⅰ：无色结晶，EI-MS：259(M+)，244(M-CH3)+，230。UV，λmax(MeOH)：218，316，319 (sh)，337 nm。1HNMR(CDCl3) δ：4.03(3H，s，-OCH3)，4.11(3H，s，-OCH3)，4.44(3H，s，-OCH3)，7.05(1H，d，J=3.0 Hz)，7.23(1H，d，J=9.0 Hz)，7.59(1H，d，J=3.0 Hz)，8.02(1H，d，J=9.0 Hz)。分析以上数据，将化合物Ⅰ鉴定为茵芋碱(skimmianine)。
化合物Ⅱ：白色结晶，229(M+)，214(M-CH3)+，200。1HNMR(CDCl3) δ：4.09(3H，s，-OCH3)，4.46(3H，s，-OCH3)，7.06(1H，dd，J=1.0，7.5 Hz)，7.09(1H，d，J=3.0 Hz)，7.36(1H，dd，J=8.5，7.5 Hz)，7.66(1H，d，J=3.0 Hz)，7.86(1H，dd，J=1.0，8.5 Hz)。根据以上数据，并与文献对照[3]，化合物Ⅱ鉴定为γ-崖椒碱(γ-fagarine)。
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4 结果与讨论
本文对芸香科植物飞龙掌血的愈伤组织进行了诱导生长和继代培养，对培养7周的组织块的主要成分进行了化学提取与结构鉴定研究，发现两个常见喹啉呋喃类生物碱茵芋碱和γ-崖椒碱。另外，还分离得到若干甾醇类化合物，而未能检测到香豆素类衍生物。这表明愈伤组织的培养物与原植物的主要化学成分是有区别的[1]。但从生物碱成分来讲，至少可以肯定飞龙掌血愈伤组织的培养，可以产生喹啉呋喃类生物碱。能否产生其他类型的生物碱，还需要做进一步的大量实验，以便为利用愈伤组织细胞培养物的生物碱成分作为原植物的化学分类依据奠定基础。
司书毅 男，1961年生，博士，副研究员，国家微生物新药筛选实验室(筹)副主任，主要从 事天然药物化学和微生物药物筛选工作。1982年1月毕业于南京药学院。1989年8月获得中国 协和医科大学生物及微生物药物学专业硕士学位。曾先后参加了亚胺硫霉素的研究、降胆固 醇新药F400的研究及云南土壤微生物资源前期开发等摪恕の鍞攻关项目，并获得过中国 医学科学院科技进步奖一、二等奖各一次。1995年6月至1998年5月曾留学日本，从事心血管 药物的筛选和药用植物化学等工作。
参考文献
1，石井永，小林纯一，石川宗一，等.药学杂志(日)，1991，111：365
2，《全国中草药汇编》编写组编写.全国中草药汇编.上册.北京：人民卫生出版社，1992：70
3，Narasimhan N S， Mali R S. Tetrahedron, 1974,30:4153
(1999-10-08收稿), 百拇医药
单位：司书毅(中国医学科学院 中国协和医科大学 医药生物技术研究所 北京 100050)；生田安喜良(日本国东京理科大学综合研究所)
关键词：飞龙掌血；愈伤组织；细胞培养；生物碱
中草药000806 摘 要 目的：为研究芸香科各亚科及属之间的亲缘关系及化学分类基础。方法：对药用植物飞龙掌血(Toddalia asiatica)愈伤组织进行诱导生长和继代培养，收获培养7周的组织块，甲醇和乙酸乙酯提取物通过多次硅胶柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析等方法进行生物碱等化学成分的分离与结构鉴定。结果：为采用药用植物飞龙掌血愈伤组织细胞培养的方法制备喹啉呋喃类药用生物碱提供依据。
芸香科植物飞龙掌血为产于亚洲、非洲及澳洲等地的一种药用植物[1，2]，其有效成分主要为生物碱和香豆素等。本科植物中所含的生物碱已被用来作为化学分类的重要依据。利用愈伤组织进行培养，对于研究生物碱等成分的生物合成途径以及用简单培养方法获得有效成分都是很有意义的。
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1 实验材料与仪器
愈伤组织的诱生与继代培养：将新采集的原植物的茎与叶无菌操作下用刀片切成小块，经10%次氯酸钠消毒后，植于含有生长激素NAA(3 mg/L)和Kin(0.1 mg/L)或2，4-D(3 mg/L)和Kin(0.1 mg/L)的MS培养基上，在26 ℃下无菌孵育诱生约4 周后，将新生愈伤组织转植于含有2，4-D(1 mg/L)和Kin(0.1 mg/L)的MS培养基上进行继代培养，经数次继代扩大培养后收获(每一代培养周期为6～7周)。
JEOL JMS-SX102A质谱仪；GSX-500核磁共振仪，CDCl3为溶液，TMS为内标。层析用硅胶(日本产，100～160 目和160～200 目)，纯化用Sephadex LH-20凝胶(瑞典Pharmacia公司)；薄层层析板(Merck产，Kieselgel 60 F254，Art. 5715)。显色剂：Dragendorff显色剂。
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2 提取与分离
将收获的愈伤组织块(湿重2.77 kg，干重约140 g)首先用冷甲醇4 000 mL浸泡一夜，去糖苷类成分，滤渣强力搅拌后依次用甲醇(4 000 mL×2)、甲醇-乙酸乙酯(1∶1)(4 000 mL×3)、乙酸乙酯(4 000 mL×2)加热回流提取，冷却后过滤，滤液经减压浓缩后得黄棕色油状物，油状物分别加氯仿和水各600 mL进行萃取，分层后，水层再用氯仿萃取3 次，合并氯仿中，减压浓缩至干得约6 g油状物。
将3.5 g提取物溶于10 mL氯仿中，上样于150 g硅胶柱(200 目)，分别用正己烷-乙酸乙酯(50∶1；20∶1；10∶1)、氯仿、氯仿-乙酸乙酯(5∶1)、氯仿-甲醇(20∶1；10∶1；1∶1)和甲醇等梯度洗脱。其中，氯仿-乙酸乙酯(5∶1)洗脱的第8组分和第9～12组分经薄层层析分析发现有生物碱成分存在。氯仿-乙酸乙酯(5∶1)洗脱的第8组分经两次Sephadex LH-20凝胶柱分离得到化合物Ⅰ纯品。氯仿-乙酸乙酯(5∶1)洗脱的第9～12组分经再一次硅胶柱层析，用苯-乙酸乙酯(20∶1；12∶1；10∶1)梯度洗脱，根据薄层层析分析结果，将苯-乙酸乙酯(20∶1)洗脱的第6组分和苯-乙酸乙酯(12∶1)洗脱的第1组分合并，再经1 次Sephadex LH-20凝胶柱层析纯化得到化合物Ⅱ纯品。
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3 鉴定
化合物Ⅰ：无色结晶，EI-MS：259(M+)，244(M-CH3)+，230。UV，λmax(MeOH)：218，316，319 (sh)，337 nm。1HNMR(CDCl3) δ：4.03(3H，s，-OCH3)，4.11(3H，s，-OCH3)，4.44(3H，s，-OCH3)，7.05(1H，d，J=3.0 Hz)，7.23(1H，d，J=9.0 Hz)，7.59(1H，d，J=3.0 Hz)，8.02(1H，d，J=9.0 Hz)。分析以上数据，将化合物Ⅰ鉴定为茵芋碱(skimmianine)。
化合物Ⅱ：白色结晶，229(M+)，214(M-CH3)+，200。1HNMR(CDCl3) δ：4.09(3H，s，-OCH3)，4.46(3H，s，-OCH3)，7.06(1H，dd，J=1.0，7.5 Hz)，7.09(1H，d，J=3.0 Hz)，7.36(1H，dd，J=8.5，7.5 Hz)，7.66(1H，d，J=3.0 Hz)，7.86(1H，dd，J=1.0，8.5 Hz)。根据以上数据，并与文献对照[3]，化合物Ⅱ鉴定为γ-崖椒碱(γ-fagarine)。
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4 结果与讨论
本文对芸香科植物飞龙掌血的愈伤组织进行了诱导生长和继代培养，对培养7周的组织块的主要成分进行了化学提取与结构鉴定研究，发现两个常见喹啉呋喃类生物碱茵芋碱和γ-崖椒碱。另外，还分离得到若干甾醇类化合物，而未能检测到香豆素类衍生物。这表明愈伤组织的培养物与原植物的主要化学成分是有区别的[1]。但从生物碱成分来讲，至少可以肯定飞龙掌血愈伤组织的培养，可以产生喹啉呋喃类生物碱。能否产生其他类型的生物碱，还需要做进一步的大量实验，以便为利用愈伤组织细胞培养物的生物碱成分作为原植物的化学分类依据奠定基础。
司书毅 男，1961年生，博士，副研究员，国家微生物新药筛选实验室(筹)副主任，主要从 事天然药物化学和微生物药物筛选工作。1982年1月毕业于南京药学院。1989年8月获得中国 协和医科大学生物及微生物药物学专业硕士学位。曾先后参加了亚胺硫霉素的研究、降胆固 醇新药F400的研究及云南土壤微生物资源前期开发等摪恕の鍞攻关项目，并获得过中国 医学科学院科技进步奖一、二等奖各一次。1995年6月至1998年5月曾留学日本，从事心血管 药物的筛选和药用植物化学等工作。
参考文献
1，石井永，小林纯一，石川宗一，等.药学杂志(日)，1991，111：365
2，《全国中草药汇编》编写组编写.全国中草药汇编.上册.北京：人民卫生出版社，1992：70
3，Narasimhan N S， Mali R S. Tetrahedron, 1974,30:4153
(1999-10-08收稿), 百拇医药
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