不同压力对兔动脉平滑肌细胞增殖的调控作用研究
作者：高歌 吕安林 贾国良 王小燕
单位：第四军医大学西京医院心血管内科 西安 710032
关键词：压力；主动脉平滑肌；调控作用；冠脉再狭窄
中国现代医学杂志000806 目的：探讨不同压力状态对动脉平滑肌增殖的调控作用，由此判断冠脉再狭窄过程中压力因素所起的作用。方法：用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液体外培养新西兰白兔的主动脉平滑肌细胞至3～7代，将含5%小牛血清的RPMI-1640培养液与动脉平滑肌细胞的混悬液100μl加入96孔培养板中培养。24h后按照实验分组分别在6.65kPa，13.3kPa，19.95kPa，26.6kPa压力状态下持续培养48h，采用四唑盐比色法和3H-TdR参入法检测平滑肌的生长状况。结果：13.3kPa压力状态对兔主动脉平滑肌细胞有显著的促增殖作用(P<0.05)；6.65kPa，19.95kPa，26.6kPa压力状态对兔主动脉平滑肌细胞无显著的促增殖作用(P>0.05)。结论：生理血压的1.5～2倍压力状态对兔动脉平滑肌细胞增殖有显著的促进作用。
, 百拇医药
分类号 R543.3
STUDYING ON THE ADJUSTING EFFECT OF DIFFERENT
PRESSURE STATE ON THE PROLIFERATION OF AORTIC
SMOOTH MUSCLE CELLS IN RABBITS
Gao Ge Lu Anlin Jia Guoliang Wang Xiaoyan
(Department of Cardiology, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
[Abstract] Objective: To investigate the adjusting effect of different pressure state on the proliferation of aortic smooth muscle (ASMCs), and observe if the pressure is one of etiological factors of coronary restenosis after percutaneous transluminal angioplasty (PTCA) and in-stent. Methods: New Zealand rabbit ASMCs were cultured in vitro with RPMI-1640 including 10 percent calf plasma. 100ul mixture of ASMCs and RPMI-1640 including 5 percent calf plasma was put in every cavity of 96-hole plate to culture for test according to the experimental groups, then ASMCs are cultured for 48 hours separately under 6.65Kpa, 13.3Kpa, 19.95Kpa and 26.6Kpa. The numbers of ASMCs proliferation was monitored by MTT method and 3H-TdR incorporation. Results: ASMCs proliferation was significantly enhanced under 13.3Kpa pressure state (P<0.05), but this phenomenon was not show in 6.65Kpa, 19.95Kpa and 26.6Kpa groups (P>0.05). Conclusions: 1.5～2 times pressure more than normal blood pressure can significantly enhance the proliferation of ASMCs, this may be one of etiological factors of coronary restenosis after PTCA and in-stent.
, 百拇医药
Key words: Pressure; Arterial Smooth Muscle Cells; Adjusting Effect; Coronary Restenosis
持续性高血压可以导致脂质代谢紊乱、血管内膜下脂质沉积和动脉硬化，但是血压长期维持在较高的水平是否能影响动脉血管平滑肌细胞(SMC)的增殖却未见报道。经皮腔内冠脉成形术(PTCA)及支架术后冠脉再狭窄(RS)的影响因素除与血管重构有关外还与冠脉新生内膜SMC的迁移、增生和基质改建有关[1]。引起冠脉新生内膜SMC增生的病人因中既有神经体液因素也有物理因素，有文献报道支架两端的的高切剪力是诱发RS的主要因素之一[2]。其实这种高切剪力就是局部压力改变的一种表现，因此研究不同压力状态下SMC的增生状况具有重要的临床意义。
1 材料与方法
压力培养箱：本实验室自制。CO2培养箱：MODEL2300(美国Sheldon制造公司生产)。酶联免疫检测仪：DG3022A型(华东电子管厂生产)。
, http://www.100md.com
ASMCs的体外培养：无菌取出新西兰白兔(体重1.5±0.5kg)主动脉段，刮除内膜后，剥脱中膜的平滑肌层，按照Ross贴片法用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液培养ASMCs，在CO2孵箱中静置培养7d后，可见细胞开始从组织块边缘爬出，待细胞生长到一定密度后即传代培养，取其3～7代作为实验用细胞。
1.1 ASMCs的鉴定：
相差显微镜：ASMCs呈梭形或长梭形，可重叠生长达多层，高低起伏呈“峰”“谷”状。
透射电镜：ASMCs的胞浆内有很多与细胞轴平行的肌丝及与其相联的致密体，部分细胞周围可见基膜。
α-肌动蛋白抗体染色：淡兰色的ASMCs胞核周围有淡棕色的阳性肌丝。
1.2 ASMCs增殖数量的检测：
, http://www.100md.com
四唑盐比色法(MTT)：将含5%小牛血清的RPMI-1640培养液与ASMCs的混悬液(细胞浓度为1×104/ml)100μl加入96孔培养板中培养24h后，按照实验分组，分别在6.65kPa，13.3kPa，19.95kPa，26.6kPa压力状态下持续培养48h，68h时每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，继续孵育4h后终止培养；吸弃上清液，每孔加入50μlDMSO，振荡10min，然后在酶联免疫检测仪上(波长：490mm)测定各孔光吸收值，结果以OD值和变化的百分数来表示。
1.3 3H-TdR参入实验
将1×104/ml细胞悬液置于96孔板中(100μl/孔)，并加入含10%小牛血清的RPMI-1640，静置培养24h后换成含5%小牛血清的RPMI-1640，并分别在6.65kPa，13.3kPa，19.95kPa，26.6kPa压力状态下持续培养48h。再培养42h后加入3H-TdR，继续培养6h后终止反应。用“9999”型纤维滤纸和ET-Ⅱ型微量细胞收集仪收集细胞，滤纸经红外线烤箱烘干后，分别置入闪烁瓶中加入PPO/POPOP二甲苯闪烁液，在液体闪烁计数器上测定cpm值，结果以cpm值表示。
, http://www.100md.com
1.4 实验分组
Ⅰ组：为对照组，常压力培养ASMCs;Ⅱ组：6.65kPa组压力环境中培养ASMCs;Ⅲ组：13.33kPa组压力环境中培养ASMCs;Ⅳ组：19.95kPa组压力环境中培养ASMCs;Ⅴ组：26.60kPa组压力环境中培养ASMCs。
1.5 统计方法
统计数据用均值±标准差(
±s)表示，数据处理采用显著性检验法。
2 结果
2.1 不同压力状态下对ASMCs增殖的影响程度
, 百拇医药 各实验组ASMCs增殖的统计数据见表1和表2。以Ⅰ组ASMCs增殖的OD值和cpm值为基数，在其它各压力实验组比较。由表1和表2知，压力对ASMCs的增殖均有不同程度的促进作用，统计检验结果表明，ASMCs增殖的OD值、cpm值和参入率Ⅰ组与Ⅲ组比较有高度显著性差异(P<0.05)，与Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ组比较无显著差异(P>0.05)。
表1 各压力实验组与对照组ASMCs增殖的OD值 (±s) 组别
n
0kPa
6.65kPa
13.33kPa
, 百拇医药
19.95kPa
26.60kPa
对照组
48
0.3948±0.0006
-
-
-
-
实验组
48
-
0.4092±0.0021
, http://www.100md.com
0.5444±0.0080
0.4108±0.0018
0.4152±0.0040
注：与对照级比较有显著性差异(P<0.05)表2 3H-TdR法检测的各压力实验组与对照组ASMCs增殖的cpm值 (±s) 组别
, 百拇医药
n
0kPa
6.65kPa
13.33kPa
19.95kPa
26.60kPa
对照组
48
1559±450
-
-
-
-
, 百拇医药
实验组
48
-
1609±676
2576±991
1759±396
1692±999
注：与对照级比较有显著性差异(P<0.05)
, 百拇医药
2.2 压力促ASMCs增殖的变化规律
根据表1和表2的数据可以看出压力对ASMCs的促增殖作用由6.65kPa开始随着压力的升高逐渐增强，达13.33kPa时到高峰，以后逐渐降低至19.95kPa时基本恢复至对照组状态，以后随着压力增加ASMCs的增殖作用并没有明显的增加，而是维持在相对稳定的状态。
3 讨论
在生理血压状态下动脉血管SMC的增殖和凋亡处于平衡状态，从而维持着动脉血管壁的正常结构。当压力变化超出生理变化范围时，SMC的增殖和凋亡处于失衡状态，SMC增殖的速度大于凋亡，则出现动脉管腔狭窄。血压持续过高的直接作用是对动脉血管SMC产生过大的挤压力，干扰了动脉血管SMC的正常代谢；在狭窄的血管可以产生高切剪力，并激活血小板，促进血小板的聚集和活化[2]。各种不同压力状态对动脉SMC的促增殖作用各不相同。本实验显示当培养压力为兔正常生理平均动脉压的1.5～2倍时(实验中检测新西兰白兔的正常平均动脉压约为5.32～7.98kPa)，压力因素对动脉SMC的促增作用达到高峰(P<0.05)。压力超过生理平均动脉压的3倍时对动脉SMC的促增作用不明显(P>0.05)。
, http://www.100md.com
发生这种变化的可能原因是：压力促增殖信号与SMC营养代谢平衡失调有关。当平均动脉压由6.65逐渐上升到13.3kPa时，压力增殖信号处于优势状态，这时SMC的新陈代谢速度同样加强，SMC处于过度增殖状态。当压力由13.3kPa进一步上升到19.95kPa时，SMC营养物质的代谢受过度高压的影响逐渐处于降低状态，SMC的增殖逐渐受到抑制。这可以解释为什么有些作者观察到高血压对冠脉再狭窄的发生无显著影响[3]，而有些作者观察到高血压对冠脉再狭窄的发生有显著的影响[4]，其原因可能与作者所观察患者的群体血压水平不同有关。在人类，早期高血压患者的动脉中度增厚，晚期高血压患者动脉内、中膜增厚，脂质沉着钙化等病理改变是否与我们的实验发现有关，还有待进一步的研究。
参 考 文 献
1，Farb A,Sangtorgi G,Gart AJ,et al.Pathology of acute and chronic coronry stenting in human.Circulation,1999;99(1):44
, http://www.100md.com
2，井阪直树.高剪切应力引起血小板聚集及抗血小板药物的效果.日本医学介绍，1999；20(4)：169
3，Bach R,Jung F,Kohseir I,et al.Factors rate after prcutaneous tanslaminal Coronary agioplasty.Thromb.Res,1994;74(1):55
4，Attebring MF,Hardford M,Holn G,et al.Risk indicators for recurrence among patients with coronary disease.Scand Cardiovasc J,1998;32(1):9
收稿：1999-11-12, http://www.100md.com
单位：第四军医大学西京医院心血管内科 西安 710032
关键词：压力；主动脉平滑肌；调控作用；冠脉再狭窄
中国现代医学杂志000806 目的：探讨不同压力状态对动脉平滑肌增殖的调控作用，由此判断冠脉再狭窄过程中压力因素所起的作用。方法：用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液体外培养新西兰白兔的主动脉平滑肌细胞至3～7代，将含5%小牛血清的RPMI-1640培养液与动脉平滑肌细胞的混悬液100μl加入96孔培养板中培养。24h后按照实验分组分别在6.65kPa，13.3kPa，19.95kPa，26.6kPa压力状态下持续培养48h，采用四唑盐比色法和3H-TdR参入法检测平滑肌的生长状况。结果：13.3kPa压力状态对兔主动脉平滑肌细胞有显著的促增殖作用(P<0.05)；6.65kPa，19.95kPa，26.6kPa压力状态对兔主动脉平滑肌细胞无显著的促增殖作用(P>0.05)。结论：生理血压的1.5～2倍压力状态对兔动脉平滑肌细胞增殖有显著的促进作用。
, 百拇医药
分类号 R543.3
STUDYING ON THE ADJUSTING EFFECT OF DIFFERENT
PRESSURE STATE ON THE PROLIFERATION OF AORTIC
SMOOTH MUSCLE CELLS IN RABBITS
Gao Ge Lu Anlin Jia Guoliang Wang Xiaoyan
(Department of Cardiology, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
[Abstract] Objective: To investigate the adjusting effect of different pressure state on the proliferation of aortic smooth muscle (ASMCs), and observe if the pressure is one of etiological factors of coronary restenosis after percutaneous transluminal angioplasty (PTCA) and in-stent. Methods: New Zealand rabbit ASMCs were cultured in vitro with RPMI-1640 including 10 percent calf plasma. 100ul mixture of ASMCs and RPMI-1640 including 5 percent calf plasma was put in every cavity of 96-hole plate to culture for test according to the experimental groups, then ASMCs are cultured for 48 hours separately under 6.65Kpa, 13.3Kpa, 19.95Kpa and 26.6Kpa. The numbers of ASMCs proliferation was monitored by MTT method and 3H-TdR incorporation. Results: ASMCs proliferation was significantly enhanced under 13.3Kpa pressure state (P<0.05), but this phenomenon was not show in 6.65Kpa, 19.95Kpa and 26.6Kpa groups (P>0.05). Conclusions: 1.5～2 times pressure more than normal blood pressure can significantly enhance the proliferation of ASMCs, this may be one of etiological factors of coronary restenosis after PTCA and in-stent.
, 百拇医药
Key words: Pressure; Arterial Smooth Muscle Cells; Adjusting Effect; Coronary Restenosis
持续性高血压可以导致脂质代谢紊乱、血管内膜下脂质沉积和动脉硬化，但是血压长期维持在较高的水平是否能影响动脉血管平滑肌细胞(SMC)的增殖却未见报道。经皮腔内冠脉成形术(PTCA)及支架术后冠脉再狭窄(RS)的影响因素除与血管重构有关外还与冠脉新生内膜SMC的迁移、增生和基质改建有关[1]。引起冠脉新生内膜SMC增生的病人因中既有神经体液因素也有物理因素，有文献报道支架两端的的高切剪力是诱发RS的主要因素之一[2]。其实这种高切剪力就是局部压力改变的一种表现，因此研究不同压力状态下SMC的增生状况具有重要的临床意义。
1 材料与方法
压力培养箱：本实验室自制。CO2培养箱：MODEL2300(美国Sheldon制造公司生产)。酶联免疫检测仪：DG3022A型(华东电子管厂生产)。
, http://www.100md.com
ASMCs的体外培养：无菌取出新西兰白兔(体重1.5±0.5kg)主动脉段，刮除内膜后，剥脱中膜的平滑肌层，按照Ross贴片法用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液培养ASMCs，在CO2孵箱中静置培养7d后，可见细胞开始从组织块边缘爬出，待细胞生长到一定密度后即传代培养，取其3～7代作为实验用细胞。
1.1 ASMCs的鉴定：
相差显微镜：ASMCs呈梭形或长梭形，可重叠生长达多层，高低起伏呈“峰”“谷”状。
透射电镜：ASMCs的胞浆内有很多与细胞轴平行的肌丝及与其相联的致密体，部分细胞周围可见基膜。
α-肌动蛋白抗体染色：淡兰色的ASMCs胞核周围有淡棕色的阳性肌丝。
1.2 ASMCs增殖数量的检测：
, http://www.100md.com
四唑盐比色法(MTT)：将含5%小牛血清的RPMI-1640培养液与ASMCs的混悬液(细胞浓度为1×104/ml)100μl加入96孔培养板中培养24h后，按照实验分组，分别在6.65kPa，13.3kPa，19.95kPa，26.6kPa压力状态下持续培养48h，68h时每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，继续孵育4h后终止培养；吸弃上清液，每孔加入50μlDMSO，振荡10min，然后在酶联免疫检测仪上(波长：490mm)测定各孔光吸收值，结果以OD值和变化的百分数来表示。
1.3 3H-TdR参入实验
将1×104/ml细胞悬液置于96孔板中(100μl/孔)，并加入含10%小牛血清的RPMI-1640，静置培养24h后换成含5%小牛血清的RPMI-1640，并分别在6.65kPa，13.3kPa，19.95kPa，26.6kPa压力状态下持续培养48h。再培养42h后加入3H-TdR，继续培养6h后终止反应。用“9999”型纤维滤纸和ET-Ⅱ型微量细胞收集仪收集细胞，滤纸经红外线烤箱烘干后，分别置入闪烁瓶中加入PPO/POPOP二甲苯闪烁液，在液体闪烁计数器上测定cpm值，结果以cpm值表示。
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1.4 实验分组
Ⅰ组：为对照组，常压力培养ASMCs;Ⅱ组：6.65kPa组压力环境中培养ASMCs;Ⅲ组：13.33kPa组压力环境中培养ASMCs;Ⅳ组：19.95kPa组压力环境中培养ASMCs;Ⅴ组：26.60kPa组压力环境中培养ASMCs。
1.5 统计方法
统计数据用均值±标准差(
±s)表示，数据处理采用显著性检验法。2 结果
2.1 不同压力状态下对ASMCs增殖的影响程度
, 百拇医药 各实验组ASMCs增殖的统计数据见表1和表2。以Ⅰ组ASMCs增殖的OD值和cpm值为基数，在其它各压力实验组比较。由表1和表2知，压力对ASMCs的增殖均有不同程度的促进作用，统计检验结果表明，ASMCs增殖的OD值、cpm值和参入率Ⅰ组与Ⅲ组比较有高度显著性差异(P<0.05)，与Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ组比较无显著差异(P>0.05)。
表1 各压力实验组与对照组ASMCs增殖的OD值 (
±s) 组别n
0kPa
6.65kPa
13.33kPa
, 百拇医药
19.95kPa
26.60kPa
对照组
48
0.3948±0.0006
-
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实验组
48
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0.4092±0.0021
, http://www.100md.com
0.5444±0.0080
0.4108±0.0018
0.4152±0.0040
注：
与对照级比较有显著性差异(P<0.05)表2 3H-TdR法检测的各压力实验组与对照组ASMCs增殖的cpm值 (±s) 组别, 百拇医药
n
0kPa
6.65kPa
13.33kPa
19.95kPa
26.60kPa
对照组
48
1559±450
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, 百拇医药
实验组
48
-
1609±676
2576±991
1759±396
1692±999
注：
与对照级比较有显著性差异(P<0.05), 百拇医药
2.2 压力促ASMCs增殖的变化规律
根据表1和表2的数据可以看出压力对ASMCs的促增殖作用由6.65kPa开始随着压力的升高逐渐增强，达13.33kPa时到高峰，以后逐渐降低至19.95kPa时基本恢复至对照组状态，以后随着压力增加ASMCs的增殖作用并没有明显的增加，而是维持在相对稳定的状态。
3 讨论
在生理血压状态下动脉血管SMC的增殖和凋亡处于平衡状态，从而维持着动脉血管壁的正常结构。当压力变化超出生理变化范围时，SMC的增殖和凋亡处于失衡状态，SMC增殖的速度大于凋亡，则出现动脉管腔狭窄。血压持续过高的直接作用是对动脉血管SMC产生过大的挤压力，干扰了动脉血管SMC的正常代谢；在狭窄的血管可以产生高切剪力，并激活血小板，促进血小板的聚集和活化[2]。各种不同压力状态对动脉SMC的促增殖作用各不相同。本实验显示当培养压力为兔正常生理平均动脉压的1.5～2倍时(实验中检测新西兰白兔的正常平均动脉压约为5.32～7.98kPa)，压力因素对动脉SMC的促增作用达到高峰(P<0.05)。压力超过生理平均动脉压的3倍时对动脉SMC的促增作用不明显(P>0.05)。
, http://www.100md.com
发生这种变化的可能原因是：压力促增殖信号与SMC营养代谢平衡失调有关。当平均动脉压由6.65逐渐上升到13.3kPa时，压力增殖信号处于优势状态，这时SMC的新陈代谢速度同样加强，SMC处于过度增殖状态。当压力由13.3kPa进一步上升到19.95kPa时，SMC营养物质的代谢受过度高压的影响逐渐处于降低状态，SMC的增殖逐渐受到抑制。这可以解释为什么有些作者观察到高血压对冠脉再狭窄的发生无显著影响[3]，而有些作者观察到高血压对冠脉再狭窄的发生有显著的影响[4]，其原因可能与作者所观察患者的群体血压水平不同有关。在人类，早期高血压患者的动脉中度增厚，晚期高血压患者动脉内、中膜增厚，脂质沉着钙化等病理改变是否与我们的实验发现有关，还有待进一步的研究。
参 考 文 献
1，Farb A,Sangtorgi G,Gart AJ,et al.Pathology of acute and chronic coronry stenting in human.Circulation,1999;99(1):44
, http://www.100md.com
2，井阪直树.高剪切应力引起血小板聚集及抗血小板药物的效果.日本医学介绍，1999；20(4)：169
3，Bach R,Jung F,Kohseir I,et al.Factors rate after prcutaneous tanslaminal Coronary agioplasty.Thromb.Res,1994;74(1):55
4，Attebring MF,Hardford M,Holn G,et al.Risk indicators for recurrence among patients with coronary disease.Scand Cardiovasc J,1998;32(1):9
收稿：1999-11-12, http://www.100md.com