不同浓度米力农对心肌细胞内钙离子浓度的影响
作者：韩松 杭燕南 高玉瑛 孙大金
单位：韩松(现在上海铁道大学医学院附属甘泉医院 200065)；杭燕南 高玉瑛 孙大金(上海第二医科大学附属仁济医院)
关键词：米力农；心肌细胞；钙离子
临床麻醉学杂志000811
摘要 目的：研究不同浓度米力农对培养乳鼠心肌 细胞钙离子的影响。方法：乳鼠心肌细胞 分离培养7天后，随机分为四组：Ⅰ组为空白对照组；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别加入米力农0.2 μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml，孵育10分钟后进行钙离子测定。结 果：不同浓度的米力农均使细胞内钙离子浓度升高(P<0.05)，但程度不同。低 浓度 时，细胞内钙离子升高较少，而高浓度时，细胞内钙离子浓度急剧升高(P<0.01 )。 结论：适当浓度米力农可增加心肌细胞内钙离子浓度。高浓度的米力农则可能引起心肌细胞 内钙离子浓度急聚升高。
, 百拇医药
Effect of Different Concentration of Mil rinone on the Production of Ca2+ in Cultured Rat Cardiac Myocy tes
Han Song，Hang Yannan，Gao Yuying，et al
(Department of Anesthesiology，Ganquan Hos pital，Shang hai Railway University， Shan g hai 200065)
Abstract Objective：To compare the ef fect s of different concentrations of milrino ne on the production of Ca2+ in cultu red rat neonatal cardaic myocytes.Methods：2 0 bottles of cultured rat neuron cardiac myocytes were seperated into 4 groups：milrinone 0.2μg/ml group，m i lrinone 0.4μg/ml group and milrinone 0.8 μg/ml group.Results：Ca2+ increased in th ree milrinone groups，especially when mil rinone 0.8μg/ml was used(P<0.01).Concl ution：A proper dose of milrinone can inc rease Ca2+ concentration in cultured primary rat cardiac myocytes，but large d ose of it may increase the Ca2+ conce ntration vigorously.
, 百拇医药
Key words Milrinone Cardiac myo cytes Calcium
米力农属于磷酸二酯酶抑制剂，通过提高心肌细胞内cAMP 浓度，增加细胞膜钙离子通道 的通透性，使心肌收缩力增强。本研究拟观察不同浓度的米力农对分离培养的乳鼠心肌细胞 内游离钙离子浓度的影响。
材料与方法
细胞分离培养[1] 取出生2～3天的乳鼠，局部消毒后，从剑突沿胸骨 剪开胸腔，剪 取心室肌部分，置于Hank′平衡液中，冲洗2～3次，剪碎至1mm×1mm×1mm 大小的碎块，在0.15%胰蛋白酶中恒温(37℃)消化10分钟，消化液移入盛有培养 液的烧瓶中，再加入胰蛋白酶消化液，反复消化5～6次，培养液移入离心管中，离心(1000转/分)10分钟，弃上清液，加入培养液，移入培养瓶中，在培养箱中贴壁 分离培 养90分钟，培养细胞计数，校正至1×106/ml，接种于6孔培养板，隔天更换培 养液，培养7天后用于实验。
, 百拇医药
实验分组 Ⅰ组为空白对照组，Ⅱ组加入米力农0.2μg/ml，Ⅲ组 加入米力农0.4 μg/ml，Ⅳ组加入米力农0.8μg/ml，孵化10分钟后进行钙离子测定。
钙离子测定 用吸管吸掉培养液，以HEPES缓冲液(NaCl 1、K Cl 5.4、CaCl2 1.2、HEPES 10、葡萄糖5mmol/L)浸洗两 次，然后置于含有Fura-2/AM 5umol/L的缓冲液中37℃孵育30分钟， 孵育后，吸掉Fura-2/AM液，玻片再用HEPES液冲洗两次后，置于荧光显微镜 的玻璃小槽中，以波长340nm和380nm的紫外线激发获得荧光图像，细胞图像经计 算 机图像处理系统处理后，以R340/380代表细胞内Ca2+荧光强度，该荧光 强度与钙离子浓度成正比。
统计分析 所有指标均用
±s表示，检验方法为单因素方 差分析，P<0.05为差异有显著意义，P<0.01为差异有极显著意义。
, 百拇医药
结果
与对照组比较，应用不同浓度的米力农后，细胞内游离钙离子浓度均有显著性升高(表1) 。
不同浓度米力农使细胞内钙离子浓度升高的浓度不同，低浓度时，细胞内钙离 子浓度升高较少，而高浓度时，细胞内钙离子浓度急剧升高。
表1 不同浓度米力农对心肌细胞内钙离子浓度的影响 组别
细胞内Ca2+(R340/380)
Ⅰ
0.5298±0.0600
Ⅱ
0.6105±0.0960*
, 百拇医药
Ⅲ
0.6346±0.1790*
Ⅳ
0.8246±0.0577**
与Ⅰ组比较，*P<0.05 **P<0.01
讨论
在心脏收缩舒张过程中，钙离子浓度的变化起着及其关键的作用。当心肌细胞内钙离子浓度 升高时，钙离子与心肌肌节收缩调节蛋白复合物TnC结合，引起心肌细胞的收缩，而心肌 细胞内钙离子浓度下降时，钙离子与TnC分离，心肌舒张。
心肌细胞内钙离子浓度调节主要依赖于细胞内cAMP，cAMP升高时可促进心肌细胞膜 钙离子通道的磷酸化，钙离子通道通透性增加，在心肌细胞动作电位平台期使心肌细胞内钙 离子浓度增高。而在舒张期，则促进心肌细胞膜肌浆网钙泵蛋白磷酸化，加快钙离子的摄取 ，同时促进心肌肌丝蛋白复合物的磷酸化，使钙离子与解离，加快其舒张过程[2] 。
, 百拇医药
心肌收缩力降低是心脏手术病人术中及术后常见的并发症。米力农抑制磷酸二酯酶，抑制c AMP水解，提高心肌细胞内的含量，发挥其正性肌力作用。在动物实验和临床应用中，表 明其具有增强心肌收缩力和扩张外周血管的作用[3～5]。
本实验表明0.2μg/ml、0.4μg/ml浓度的米力农均可增强心肌细胞内游离钙 离子浓度，发挥正性肌力作用。同时，我们发现，0.8μg/ml浓度的米力农可使细胞 内钙离子浓度显著上升，说明米力农剂量增加到一定程度时，可能会使细胞外钙离子通过激 活的电压依赖性通道大量进入细胞内，而文献[6]报道，细胞内钙离子浓度升高到 一定程 度时，导致细胞内线粒体功能钙离子摄入障碍，从而引起细胞损伤。因而，我们认为，适当 剂量米力农可以促进心肌细胞的收缩，而较大剂量时，反可引起心肌细胞损害，造成不良后果。
参考文献
1，鄂征，主编.组织培养技术.北京：人民卫生出版社，1989.1-120 .
, 百拇医药
2，Brown JH.Phosphoinositide-generated se cond messangers in cardiac signal transd uction.Trends′Cardiacvascular Medcine，19 92，4∶209-217.
3，Fischer TA.Current status of phosphoin ositide inhibtors in the treatmant of co ngestive heart failure.Drugs，1992，44∶928 -936.
4，Hardy JF，Searal N，perraul T，et al.Milr inone in combination with norpinephine i s an effective first-line drug for difficu lt seperation from cardiacpulmonary bypass .Cannadian Journal of Anesthesia，1993， 40(Suppl)∶495-501.
, 百拇医药
5，Pieske B，Schlothauer K，Schattman J，et al.Ca2+-Dependent and Ca2+-indepen dent r egulation of contractility in isolated h uman myocardium.Basic Research in Cardio logy，1997，40∶75-86.
6，Fenech RO.Effects of variable dose mil rinone in patients with low cardiac outp ut after cardiac surgery.American Journa l of Heart，1991，122∶1995-1999.
(收稿：1999-07-05 修回：2000-02-13), http://www.100md.com
单位：韩松(现在上海铁道大学医学院附属甘泉医院 200065)；杭燕南 高玉瑛 孙大金(上海第二医科大学附属仁济医院)
关键词：米力农；心肌细胞；钙离子
临床麻醉学杂志000811
摘要 目的：研究不同浓度米力农对培养乳鼠心肌 细胞钙离子的影响。方法：乳鼠心肌细胞 分离培养7天后，随机分为四组：Ⅰ组为空白对照组；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别加入米力农0.2 μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml，孵育10分钟后进行钙离子测定。结 果：不同浓度的米力农均使细胞内钙离子浓度升高(P<0.05)，但程度不同。低 浓度 时，细胞内钙离子升高较少，而高浓度时，细胞内钙离子浓度急剧升高(P<0.01 )。 结论：适当浓度米力农可增加心肌细胞内钙离子浓度。高浓度的米力农则可能引起心肌细胞 内钙离子浓度急聚升高。
, 百拇医药
Effect of Different Concentration of Mil rinone on the Production of Ca2+ in Cultured Rat Cardiac Myocy tes
Han Song，Hang Yannan，Gao Yuying，et al
(Department of Anesthesiology，Ganquan Hos pital，Shang hai Railway University， Shan g hai 200065)
Abstract Objective：To compare the ef fect s of different concentrations of milrino ne on the production of Ca2+ in cultu red rat neonatal cardaic myocytes.Methods：2 0 bottles of cultured rat neuron cardiac myocytes were seperated into 4 groups：milrinone 0.2μg/ml group，m i lrinone 0.4μg/ml group and milrinone 0.8 μg/ml group.Results：Ca2+ increased in th ree milrinone groups，especially when mil rinone 0.8μg/ml was used(P<0.01).Concl ution：A proper dose of milrinone can inc rease Ca2+ concentration in cultured primary rat cardiac myocytes，but large d ose of it may increase the Ca2+ conce ntration vigorously.
, 百拇医药
Key words Milrinone Cardiac myo cytes Calcium
米力农属于磷酸二酯酶抑制剂，通过提高心肌细胞内cAMP 浓度，增加细胞膜钙离子通道 的通透性，使心肌收缩力增强。本研究拟观察不同浓度的米力农对分离培养的乳鼠心肌细胞 内游离钙离子浓度的影响。
材料与方法
细胞分离培养[1] 取出生2～3天的乳鼠，局部消毒后，从剑突沿胸骨 剪开胸腔，剪 取心室肌部分，置于Hank′平衡液中，冲洗2～3次，剪碎至1mm×1mm×1mm 大小的碎块，在0.15%胰蛋白酶中恒温(37℃)消化10分钟，消化液移入盛有培养 液的烧瓶中，再加入胰蛋白酶消化液，反复消化5～6次，培养液移入离心管中，离心(1000转/分)10分钟，弃上清液，加入培养液，移入培养瓶中，在培养箱中贴壁 分离培 养90分钟，培养细胞计数，校正至1×106/ml，接种于6孔培养板，隔天更换培 养液，培养7天后用于实验。
, 百拇医药
实验分组 Ⅰ组为空白对照组，Ⅱ组加入米力农0.2μg/ml，Ⅲ组 加入米力农0.4 μg/ml，Ⅳ组加入米力农0.8μg/ml，孵化10分钟后进行钙离子测定。
钙离子测定 用吸管吸掉培养液，以HEPES缓冲液(NaCl 1、K Cl 5.4、CaCl2 1.2、HEPES 10、葡萄糖5mmol/L)浸洗两 次，然后置于含有Fura-2/AM 5umol/L的缓冲液中37℃孵育30分钟， 孵育后，吸掉Fura-2/AM液，玻片再用HEPES液冲洗两次后，置于荧光显微镜 的玻璃小槽中，以波长340nm和380nm的紫外线激发获得荧光图像，细胞图像经计 算 机图像处理系统处理后，以R340/380代表细胞内Ca2+荧光强度，该荧光 强度与钙离子浓度成正比。
统计分析 所有指标均用
±s表示，检验方法为单因素方 差分析，P<0.05为差异有显著意义，P<0.01为差异有极显著意义。, 百拇医药
结果
与对照组比较，应用不同浓度的米力农后，细胞内游离钙离子浓度均有显著性升高(表1) 。
不同浓度米力农使细胞内钙离子浓度升高的浓度不同，低浓度时，细胞内钙离 子浓度升高较少，而高浓度时，细胞内钙离子浓度急剧升高。
表1 不同浓度米力农对心肌细胞内钙离子浓度的影响 组别
细胞内Ca2+(R340/380)
Ⅰ
0.5298±0.0600
Ⅱ
0.6105±0.0960*
, 百拇医药
Ⅲ
0.6346±0.1790*
Ⅳ
0.8246±0.0577**
与Ⅰ组比较，*P<0.05 **P<0.01
讨论
在心脏收缩舒张过程中，钙离子浓度的变化起着及其关键的作用。当心肌细胞内钙离子浓度 升高时，钙离子与心肌肌节收缩调节蛋白复合物TnC结合，引起心肌细胞的收缩，而心肌 细胞内钙离子浓度下降时，钙离子与TnC分离，心肌舒张。
心肌细胞内钙离子浓度调节主要依赖于细胞内cAMP，cAMP升高时可促进心肌细胞膜 钙离子通道的磷酸化，钙离子通道通透性增加，在心肌细胞动作电位平台期使心肌细胞内钙 离子浓度增高。而在舒张期，则促进心肌细胞膜肌浆网钙泵蛋白磷酸化，加快钙离子的摄取 ，同时促进心肌肌丝蛋白复合物的磷酸化，使钙离子与解离，加快其舒张过程[2] 。
, 百拇医药
心肌收缩力降低是心脏手术病人术中及术后常见的并发症。米力农抑制磷酸二酯酶，抑制c AMP水解，提高心肌细胞内的含量，发挥其正性肌力作用。在动物实验和临床应用中，表 明其具有增强心肌收缩力和扩张外周血管的作用[3～5]。
本实验表明0.2μg/ml、0.4μg/ml浓度的米力农均可增强心肌细胞内游离钙 离子浓度，发挥正性肌力作用。同时，我们发现，0.8μg/ml浓度的米力农可使细胞 内钙离子浓度显著上升，说明米力农剂量增加到一定程度时，可能会使细胞外钙离子通过激 活的电压依赖性通道大量进入细胞内，而文献[6]报道，细胞内钙离子浓度升高到 一定程 度时，导致细胞内线粒体功能钙离子摄入障碍，从而引起细胞损伤。因而，我们认为，适当 剂量米力农可以促进心肌细胞的收缩，而较大剂量时，反可引起心肌细胞损害，造成不良后果。
参考文献
1，鄂征，主编.组织培养技术.北京：人民卫生出版社，1989.1-120 .
, 百拇医药
2，Brown JH.Phosphoinositide-generated se cond messangers in cardiac signal transd uction.Trends′Cardiacvascular Medcine，19 92，4∶209-217.
3，Fischer TA.Current status of phosphoin ositide inhibtors in the treatmant of co ngestive heart failure.Drugs，1992，44∶928 -936.
4，Hardy JF，Searal N，perraul T，et al.Milr inone in combination with norpinephine i s an effective first-line drug for difficu lt seperation from cardiacpulmonary bypass .Cannadian Journal of Anesthesia，1993， 40(Suppl)∶495-501.
, 百拇医药
5，Pieske B，Schlothauer K，Schattman J，et al.Ca2+-Dependent and Ca2+-indepen dent r egulation of contractility in isolated h uman myocardium.Basic Research in Cardio logy，1997，40∶75-86.
6，Fenech RO.Effects of variable dose mil rinone in patients with low cardiac outp ut after cardiac surgery.American Journa l of Heart，1991，122∶1995-1999.
(收稿：1999-07-05 修回：2000-02-13), http://www.100md.com