白首乌甾体总苷的体外抗肿瘤作用
作者：张如松 叶益萍 刘雪莉
单位：浙江省医学科学院 杭州 310013
关键词：白首乌；白首乌甾体总苷；细胞毒活性
中草药000824摘 要 体外用细胞生长曲线法、MTT 试验、蛋白质含量测定法及形态学观察研究了白首乌甾体总苷 (CG) 的抗肿瘤作用。结果表明：CG 对 Hce-8693、PC3、Hela、PAA 4 种实体瘤细胞均有较强的体外细胞毒作用，且呈浓度依赖性。CG 作用于 Hela 细胞 4 d，形态观察表现为细胞膜皱缩、细胞核固缩、浓聚。
Studies on in vitro Antitumor Activity of Total Steroidal Glycoside from the Root of Cynanchum auriculatum
, http://www.100md.com
Zhang Rusong
(Institute of Materia Medica, Zhejiang Academy of Medical Sciences Hangzhou 310013)
Ye Yiping
(Institute of Materia Medica, Zhejiang Academy of Medical Sciences Hangzhou 310013)
Liu Xueli
(Institute of Materia Medica, Zhejiang Academy of Medical Sciences Hangzhou 310013)
Abstract In vitro cytotoxicity of total steroidal glycoside (CG) from the root of Cynanchum auriculatum Royle ex Wight was studied on Hce-8693, PC3， Hela and PAA solid tumor cells by determining cell growth curve, MTT test, protein content assay and morphological observation. The results showed that CG exhibited potent cytotoxic effect on all four solid tumor cells lines in a concentration-dependent manner. After 4 d of treatment with CG, Hela cells proliferation distinctly declined with dramatic morphologic alteration, including some cell membrane shrinkage and nuclei pyknosis.
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Key words the root of Cynanchum auriculatum Royle ex Wight total steroidal glucoside from the root of Cynanchum auriculatum (CG) cytotoxic activity
白首乌系萝科鹅绒藤属植物耳叶牛皮消 Cynanchum auriculatum Royle ex Wight 的干燥块根，为著名传统中药，具有补血益精、延年益寿的功效[1]，在民间用于滋补药膳，是一有前途的抗衰老药物。现代研究表明白首乌中含有磷脂类、氨基酸、C21甾体苷、维生素、无机盐及 30 多种微量元素等成分。药理实验研究发现白首乌甾体总苷具有抗肿瘤和免疫增强作用[2，3]，但从未有人对白首乌甾体总苷活性成分进行过系统的研究。我们在以体外抗肿瘤试验为导向，对白首乌甾体总苷进行系统的化学成分研究中发现白首乌甾体总苷对 Hce-8693、PC3、Hela、PAA 4 种实体瘤细胞具有明显的体外抗肿瘤作用。
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1 实验材料
1.1 药物：白首乌甾体总苷为白首乌块根经甲醇回流提取，提取物回收甲醇后用氯仿提取，氯仿可溶部分回收溶剂后投入正己烷中，正己烷不溶部分即白首乌甾体总苷(简称CG)。
1.2 细胞系及培养条件：人前列腺癌细胞 PC3，购自中国科学院上海细胞研究所细胞库 (ATCC 引进)；人大肠癌细胞 Hce-8693，由浙江省肿瘤医院赠送，为浙江省医学科学院病理研究室传代细胞株；人肺癌细胞 PAA，人宫颈癌细胞 Hela，购自浙江医科大学第二附属医院肿瘤研究所。各细胞系均接种于含 10% 小牛血清、4 U/mL 庆大霉素的 DMEM 培养基中，置 37 ℃、含5% CO2 饱和湿度的培养箱中培养。
1.3 试剂：DMEM 培养基，Gibco 公司产品；MTT (噻唑蓝四氮唑)，Sigma 公司产品；胰酶，Gibco 公司产品；考马斯亮蓝 G-250，英国进口分装，新生小牛血清，杭州四季青生物材料公司产品。
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2 方法
2.1 PAA 细胞生长曲线的测定[4]，在 24 孔细胞培养板上加入对数生长期 PAA 细胞混悬液 (细胞密度为 5×104个/毫升) 每孔 1.0 mL；培养 1 d 后加入不同浓度的药物每孔 1.0 mL，均设 3 复孔。于加药同时及加药后不同时间，用 0.25 % 的胰酶液消化，收集细胞，于细胞计数板上计数，以每毫升细胞数为纵坐标、时间为横坐标画出细胞生长曲线。
2.2 MTT 显色法测定 CG 对肿瘤细胞的抑制率[5]：在96 孔细胞培养板上加一定密度的细胞混悬液每孔100 μL，培养 1 d (细胞贴壁) 后加入不同浓度的药物每孔 100 μL，均设复孔，另设对照孔(只加细胞，不加药物)和调零孔(只加培养液，不含细胞和药物)。在 37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养 4 d，取出，加入 1.0 mg/mL 的 MTT 每孔 100 μL；继续培养 2 h 后，倾去各孔内液体，再加入 0.04 mol/L 盐酸异丙醇每孔 150 μL，于 37 ℃放置 1 h 后，以酶标仪在 570 nm 处测各孔吸光度。
, 百拇医药
2.3 考马斯亮蓝蛋白质含量测定法测定 CG 对 Hela 细胞的影响[6]：在 24 孔 细胞培养板上加入一定密度的细胞混悬液每孔 1.0 mL;培养 1 d后，加入不同浓度的药物，于培养箱中培养 4 d后，倾去各孔内液体，经 0.25% 胰酶消化，PBS 冲洗，离心收集细胞，加 0.3 mol/L NaOH 0.5 mL，于 100 ℃水浴加热 30 min后(裂解细胞)，取 0.2 mL 加 2 mL 考马斯亮蓝溶液，摇匀，以 754 分光光度计在 595 nm 处测吸光度。
2.4 形态学观察 CG 对 Hela 细胞的影响[7]：将 Hela 细胞接种于盖玻片上，给药组同时加入 CG 80 μg/mL,培养 4 d 后取出盖玻片以 HE 染色法染色，在光镜下观察并拍照。
3 结果
3.1 CG 对 PAA 细胞生长的影响：用不同浓度的 CG 处理 PAA 细胞，可见 PAA 细胞的生长均受到抑制，且呈浓度和时间依赖性。由图1看出 150 μg/mL 的 CG 对 PAA 细胞具有明显的细胞毒作用。
, 百拇医药
图1 CG对PAA细胞生长抑制作用(n=3)
3.2 CG 对体外培养的肿瘤细胞的影响：用 MTT 法观察了 CG 对体外培养的人大肠癌 Hce-8693、人前列腺癌细胞 PC3、人肺癌细胞 PAA 和人宫颈癌细胞 Hela 4种实体瘤细胞的影响，如图2所示，CG 对肿瘤细胞有较强的细胞毒作用。考马斯亮蓝蛋白质含量测定结果也表明：CG 对 Hela 细胞有抑制作用，如表1所示，且呈明显的浓度依赖性。
图2 CG对肿瘤细胞的细胞毒作用(n=3)
表1 CG 对 Hela 细胞蛋白含量的影响 浓度(μg/mL)
蛋白减少率(%)
, 百拇医药 37.5
5.46±3.06
75
20.79±1.36
150
46.10±2.58
3.3 CG 对 Hela 细胞形态的影响：细胞形态学观察表明，对照组细胞生长旺盛，呈多边形。给药组细胞生长明显受抑，细胞变圆，核固缩、浓聚，图3所示。
图3 Hela细胞形态
4 讨论
从植物中寻找抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物，在国内外均为抗肿瘤药物研究的重要组成部分。据文献报道白首乌甾体总苷对 EAC、S-180、Lewis 肺癌等瘤株在体内外均有明显的抑制作用[8]。本实验发现白首乌甾体总苷还对 Hce-8693、PC3、Hela、PAA 4种实体瘤细胞有较强的细胞毒作用，可见白首乌甾体总苷具有广谱抗肿瘤作用。此外，白首乌甾体总苷还有增强机体免疫功能的作用[3]。因此对白首乌甾体总苷的抗癌作用及其机制值得进一步深入研究。
, http://www.100md.com
浙江省自然科学基金资助 No 396484
张如松 副研究员，硕士生导师，浙江省跨世纪学术和技术带头人培养人员。1977年毕业于 浙江医科大学药学系，1992年获日本大阪大学药学博士。主要从事天然药物活性成分的研究 ，特别对萝科植物含有C21甾体类成分有较深入的研究，已分离确定了9种新的C21甾体类成分。近3年来，主持浙江自然科学基金项目2项及其它基 金项目多项。在国内外杂志发表论文20余篇。
参考文献
1，中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴(第三册).北京：科学出版社，1974：473
2，顾立刚，龚树生，陶君娣，等.中国医药学报，1987，2(5)：25
3，赵 瑾，韩进红，王少军，等.中国药理学通报，1990，6(2)：126
, 百拇医药
4，鄂 怔.组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1995：87
5，周建军，乐秀芳，韩家娴，等.中国医药工业杂志，1993，24(10)：455
6，Marion M. Anal Biochem,1976,72:248
7，司徒镇强，吴军正.细胞培养.北京：世界图书出版公司，1996：198
8，赵 瑾，韩进红，王少军.中国医药学报，1988，3(2)：29
(1999-12-01收稿), http://www.100md.com
单位：浙江省医学科学院 杭州 310013
关键词：白首乌；白首乌甾体总苷；细胞毒活性
中草药000824摘 要 体外用细胞生长曲线法、MTT 试验、蛋白质含量测定法及形态学观察研究了白首乌甾体总苷 (CG) 的抗肿瘤作用。结果表明：CG 对 Hce-8693、PC3、Hela、PAA 4 种实体瘤细胞均有较强的体外细胞毒作用，且呈浓度依赖性。CG 作用于 Hela 细胞 4 d，形态观察表现为细胞膜皱缩、细胞核固缩、浓聚。
Studies on in vitro Antitumor Activity of Total Steroidal Glycoside from the Root of Cynanchum auriculatum
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Zhang Rusong
(Institute of Materia Medica, Zhejiang Academy of Medical Sciences Hangzhou 310013)
Ye Yiping
(Institute of Materia Medica, Zhejiang Academy of Medical Sciences Hangzhou 310013)
Liu Xueli
(Institute of Materia Medica, Zhejiang Academy of Medical Sciences Hangzhou 310013)
Abstract In vitro cytotoxicity of total steroidal glycoside (CG) from the root of Cynanchum auriculatum Royle ex Wight was studied on Hce-8693, PC3， Hela and PAA solid tumor cells by determining cell growth curve, MTT test, protein content assay and morphological observation. The results showed that CG exhibited potent cytotoxic effect on all four solid tumor cells lines in a concentration-dependent manner. After 4 d of treatment with CG, Hela cells proliferation distinctly declined with dramatic morphologic alteration, including some cell membrane shrinkage and nuclei pyknosis.
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Key words the root of Cynanchum auriculatum Royle ex Wight total steroidal glucoside from the root of Cynanchum auriculatum (CG) cytotoxic activity
白首乌系萝科鹅绒藤属植物耳叶牛皮消 Cynanchum auriculatum Royle ex Wight 的干燥块根，为著名传统中药，具有补血益精、延年益寿的功效[1]，在民间用于滋补药膳，是一有前途的抗衰老药物。现代研究表明白首乌中含有磷脂类、氨基酸、C21甾体苷、维生素、无机盐及 30 多种微量元素等成分。药理实验研究发现白首乌甾体总苷具有抗肿瘤和免疫增强作用[2，3]，但从未有人对白首乌甾体总苷活性成分进行过系统的研究。我们在以体外抗肿瘤试验为导向，对白首乌甾体总苷进行系统的化学成分研究中发现白首乌甾体总苷对 Hce-8693、PC3、Hela、PAA 4 种实体瘤细胞具有明显的体外抗肿瘤作用。
, http://www.100md.com
1 实验材料
1.1 药物：白首乌甾体总苷为白首乌块根经甲醇回流提取，提取物回收甲醇后用氯仿提取，氯仿可溶部分回收溶剂后投入正己烷中，正己烷不溶部分即白首乌甾体总苷(简称CG)。
1.2 细胞系及培养条件：人前列腺癌细胞 PC3，购自中国科学院上海细胞研究所细胞库 (ATCC 引进)；人大肠癌细胞 Hce-8693，由浙江省肿瘤医院赠送，为浙江省医学科学院病理研究室传代细胞株；人肺癌细胞 PAA，人宫颈癌细胞 Hela，购自浙江医科大学第二附属医院肿瘤研究所。各细胞系均接种于含 10% 小牛血清、4 U/mL 庆大霉素的 DMEM 培养基中，置 37 ℃、含5% CO2 饱和湿度的培养箱中培养。
1.3 试剂：DMEM 培养基，Gibco 公司产品；MTT (噻唑蓝四氮唑)，Sigma 公司产品；胰酶，Gibco 公司产品；考马斯亮蓝 G-250，英国进口分装，新生小牛血清，杭州四季青生物材料公司产品。
, http://www.100md.com
2 方法
2.1 PAA 细胞生长曲线的测定[4]，在 24 孔细胞培养板上加入对数生长期 PAA 细胞混悬液 (细胞密度为 5×104个/毫升) 每孔 1.0 mL；培养 1 d 后加入不同浓度的药物每孔 1.0 mL，均设 3 复孔。于加药同时及加药后不同时间，用 0.25 % 的胰酶液消化，收集细胞，于细胞计数板上计数，以每毫升细胞数为纵坐标、时间为横坐标画出细胞生长曲线。
2.2 MTT 显色法测定 CG 对肿瘤细胞的抑制率[5]：在96 孔细胞培养板上加一定密度的细胞混悬液每孔100 μL，培养 1 d (细胞贴壁) 后加入不同浓度的药物每孔 100 μL，均设复孔，另设对照孔(只加细胞，不加药物)和调零孔(只加培养液，不含细胞和药物)。在 37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养 4 d，取出，加入 1.0 mg/mL 的 MTT 每孔 100 μL；继续培养 2 h 后，倾去各孔内液体，再加入 0.04 mol/L 盐酸异丙醇每孔 150 μL，于 37 ℃放置 1 h 后，以酶标仪在 570 nm 处测各孔吸光度。
, 百拇医药
2.3 考马斯亮蓝蛋白质含量测定法测定 CG 对 Hela 细胞的影响[6]：在 24 孔 细胞培养板上加入一定密度的细胞混悬液每孔 1.0 mL;培养 1 d后，加入不同浓度的药物，于培养箱中培养 4 d后，倾去各孔内液体，经 0.25% 胰酶消化，PBS 冲洗，离心收集细胞，加 0.3 mol/L NaOH 0.5 mL，于 100 ℃水浴加热 30 min后(裂解细胞)，取 0.2 mL 加 2 mL 考马斯亮蓝溶液，摇匀，以 754 分光光度计在 595 nm 处测吸光度。
2.4 形态学观察 CG 对 Hela 细胞的影响[7]：将 Hela 细胞接种于盖玻片上，给药组同时加入 CG 80 μg/mL,培养 4 d 后取出盖玻片以 HE 染色法染色，在光镜下观察并拍照。
3 结果
3.1 CG 对 PAA 细胞生长的影响：用不同浓度的 CG 处理 PAA 细胞，可见 PAA 细胞的生长均受到抑制，且呈浓度和时间依赖性。由图1看出 150 μg/mL 的 CG 对 PAA 细胞具有明显的细胞毒作用。
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图1 CG对PAA细胞生长抑制作用(n=3)
3.2 CG 对体外培养的肿瘤细胞的影响：用 MTT 法观察了 CG 对体外培养的人大肠癌 Hce-8693、人前列腺癌细胞 PC3、人肺癌细胞 PAA 和人宫颈癌细胞 Hela 4种实体瘤细胞的影响，如图2所示，CG 对肿瘤细胞有较强的细胞毒作用。考马斯亮蓝蛋白质含量测定结果也表明：CG 对 Hela 细胞有抑制作用，如表1所示，且呈明显的浓度依赖性。
图2 CG对肿瘤细胞的细胞毒作用(n=3)
表1 CG 对 Hela 细胞蛋白含量的影响 浓度(μg/mL)
蛋白减少率(%)
, 百拇医药 37.5
5.46±3.06
75
20.79±1.36
150
46.10±2.58
3.3 CG 对 Hela 细胞形态的影响：细胞形态学观察表明，对照组细胞生长旺盛，呈多边形。给药组细胞生长明显受抑，细胞变圆，核固缩、浓聚，图3所示。
图3 Hela细胞形态
4 讨论
从植物中寻找抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物，在国内外均为抗肿瘤药物研究的重要组成部分。据文献报道白首乌甾体总苷对 EAC、S-180、Lewis 肺癌等瘤株在体内外均有明显的抑制作用[8]。本实验发现白首乌甾体总苷还对 Hce-8693、PC3、Hela、PAA 4种实体瘤细胞有较强的细胞毒作用，可见白首乌甾体总苷具有广谱抗肿瘤作用。此外，白首乌甾体总苷还有增强机体免疫功能的作用[3]。因此对白首乌甾体总苷的抗癌作用及其机制值得进一步深入研究。
, http://www.100md.com
浙江省自然科学基金资助 No 396484
张如松 副研究员，硕士生导师，浙江省跨世纪学术和技术带头人培养人员。1977年毕业于 浙江医科大学药学系，1992年获日本大阪大学药学博士。主要从事天然药物活性成分的研究 ，特别对萝科植物含有C21甾体类成分有较深入的研究，已分离确定了9种新的C21甾体类成分。近3年来，主持浙江自然科学基金项目2项及其它基 金项目多项。在国内外杂志发表论文20余篇。
参考文献
1，中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴(第三册).北京：科学出版社，1974：473
2，顾立刚，龚树生，陶君娣，等.中国医药学报，1987，2(5)：25
3，赵 瑾，韩进红，王少军，等.中国药理学通报，1990，6(2)：126
, 百拇医药
4，鄂 怔.组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1995：87
5，周建军，乐秀芳，韩家娴，等.中国医药工业杂志，1993，24(10)：455
6，Marion M. Anal Biochem,1976,72:248
7，司徒镇强，吴军正.细胞培养.北京：世界图书出版公司，1996：198
8，赵 瑾，韩进红，王少军.中国医药学报，1988，3(2)：29
(1999-12-01收稿), http://www.100md.com
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