心脏停跳复苏犬大脑组织内皮素-1含量和Na+-K+ ATP酶活性的变化
作者：金修才 杨兴易 赵良 许永华 景炳文 王永进
单位：上海第二军医大学附属长征医院急救科，200003
关键词：心脏停跳；复苏；ET-1；Na+-K++ATP酶
中国急救医学000803 [摘 要] 目的 研究犬心脏停跳及复苏后脑组织内皮素-1(Endothelin,ET-1)含量、Na+-K+ ATP酶活性的变化，探讨ET-1在复苏后脑损伤中的可能作用机制。方法 采用犬室颤心跳呼吸骤停模型，进行标准心肺复苏，分别观察室颤前、心脏停跳10 min及复苏后30 min、2 h和4 h的脑组织ET-1含量和Na+-K+ ATP酶活性变化及两者之间的关系。结果 心脏停跳及复苏后脑组织ET-1含量明显升高，Na+-K+ ATP酶活性降低，两者呈显著负相关。结论 心脏停跳及复苏后脑组织ET-1含量升高引起脑组织损伤，其可能的作用机制之一是抑制了Na+-K+ ATP酶的活性。
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[中图分类号] R 541.7；R 605.974 [文献标识码] A [文章编号] 1002-1949(2000)08-0451-02
Changes of endothelin-1 content and Na+-K+ ATPase activity in brain tissue in resuscitated dogs after cardiac arrest
JIN Xiucai,YANG Xing-yi,ZHAO Liang
(Emergency Department, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
[Abstract] Objective To investigate the possible mechanism of ET-1 in brain injury after cardiac arrest(CA)and postresuscitation.Methods The dogs with CA model of ventricular fibrillation were used to be resuscitated with standerd cardiopulmonary resuscitation.We observed the changes of ET-1 content and Na+-K+ ATPase activity in brain tissue before ventricular fibrillation,after ten minutes of CA and postresuscitation 30 min,2 h,4 h respectively.Results ET-1 content was increased signifcantly and Na+-K+ ATPase activity was decreased after ten minutes of CA and postresuscitation.There was a negative correlation between them.Conclusion ET-1 played a crucial role in brain tissue injury postresuscitation,one of the possible mechanism was associated with inhibition of Na+-K+ ATPase activity.
, 百拇医药
[Key words] Cardiac arrest； Resuscitation； ET-1 Na+-K+ ATPase
目前在复苏后脑组织损伤机理的研究中，ET-1引起了人们较多的重视。ET-1是一种强烈的血管收缩剂[1]，通过收缩血管，引起微循环紊乱，造成缺血缺氧而引起损伤，形成恶性循环。Arika[2]在心肺复苏犬的矢状窦静脉血中发现ET-1含量上升。血管平滑肌细胞和肾内髓质集合管细胞的研究发现，血管收缩物质(如ET-1)可抑制Na+-K+ ATP酶活性[3]。心肺复苏犬脑组织中ET-1含量变化及ET-1对脑组织Na+-K+ ATP酶的作用尚不清楚。本实验通过检测犬心脏停跳及复苏后脑组织中ET-1含量及Na+-K+ ATP酶活性变化和两者之间的相关关系，探讨复苏后ET-1对脑组织损伤的可能的作用机制。
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1 材料与方法
1.1 动物处理与心脏停跳复苏犬模型的制备
犬在氯胺酮10 mg/kg诱导麻醉后，以3%戊巴比妥30 mg/kg进行麻醉，并行气管插管，呼吸机辅助呼吸(SIMV)(潮气量约为15 ml/kg，频率约为20次/min)。同时行心电监护，并行股动脉、股静脉插管，监测中心静脉压、动脉压等指标(sirecust960)。颅顶正中钻孔开窗1.5 cm×1.5 cm，不损及硬脑膜，备取脑组织标本用。利用pittsburg标准室颤模型[4]，体外经胸壁以60～70 V直流电持续5 s电休克，直至心电图出现室颤，动脉压降为0，必要时可重复，停止机械辅助呼吸。10分钟后开始复苏，采用开胸标准心肺复苏法，同时应用肾上腺素、碳酸氢钠等药物，以机械控制通气(潮气量与频率同室颤前)使犬恢复自主循环。
1.2 动物分组
, 百拇医药
选取体重10～15 kg健康杂种犬32条，随机分为8组，每组4条，正常对照组：动物麻醉后立即取标本进行检测；三个假手术组：麻醉后不致颤，分别于手术后30 min、2 h和4 h取标本进行检测；心脏停跳组：动物致颤10 min后立即取标本，不复苏；三个复苏组：分别于复苏后30 min、2 h和4 h取标本进行检测。
1.3 标本采集及处理
取左顶叶脑组织，匀浆离心后取上清-20℃保存，待批量测定。
1.4 脑组织ET-1含量及Na+-K+ ATP酶活性的测定
脑组织ET-1含量测定试剂盒由北京东亚免疫技术研究所提供，Na+-K+ ATP酶活性测定试剂盒由南京建成生物工程公司提供，按说明书进行检测。组织蛋白定量按Lowry法[5]。
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1.5 统计学处理
数据以均数±标准差显示，以完全随机设计资料的方差分析作F检验，以P<0.05为相差显著，P<0.01为相差非常显著。
2 结果
脑组织ET-1含量及Na+-K+ ATP酶活性正常对照组与假手术组无明显差别，从心脏停跳组开始，脑组织ET-1含量有明显上升，随复苏后时间的延长而进行性上升，Na+-K+ ATP酶活性则呈进行性降低(见附表)。相关回归分析发现脑组织ET-1含量与Na+-K+ ATP酶活性之间呈显著负相关(r=-0.5683，P<0.05)。
附表 各组脑组织ET-1及Na+-K+ ATP酶活性变化
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脑组织Na+-K+ ATP酶
活性(μmolPi/mg蛋白/h)
脑组织ET-1含量
(pg/mg蛋白)
正常对照组
9.38±0.71
1.50±0.24
假手术组(30 min)
9.63±0.94
1.48±0.36
假手术组(2 h)
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9.42±0.46
1.47±0.45
假手术组(4 h)
9.41±0.54
1.49±0.19
心脏停跳组
8.34±0.58*
1.86±0.32*
复苏组(30 min)
8.40±0.39*
1.96±0.17*
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复苏组(2 h)
7.20±0.53+
2.15±0.43+
复苏组(4 h)
6.92±0.71+
2.20±0.25+
*：P<0.01(与正常对照组比较)；+：P<0.01(与心脏停跳组比较)
3 讨论
内皮素是从培养的血管内皮细胞上清液中提取的一组强烈的血管收缩因子[1]，目前发现的ET有三种，ET-1，2，3，中枢神经系统内以ET-1，3为主，主要由血管内皮细胞、星型胶质细胞和神经元分泌产生[6]。内皮素作用于血管平滑肌细胞，使其细胞内Ca++增加，导致血管痉挛。但体内内皮细胞也能降解内皮素，维持其低浓度；另一方面，内皮素又能刺激正常内皮细胞产生内源性血管舒缓因子和前列环素，以拮抗内皮素的缩血管作用，因此生理情况下不产生病理效应。但当内皮细胞受到物理、化学刺激，内皮细胞受损，内皮素产生增加，降解减弱，从而引起病理效应，表现为血管收缩，加重脑缺血缺氧，形成恶性循环[7]。
, 百拇医药
Na+-K+ ATP酶能够逆浓度梯度转运Na+、K+，从而维持细胞的正常生理功能，当该酶活性降低，细胞内水钠潴留，发生肿胀，并导致突触膜对兴奋性氨基酸的摄取减弱，使细胞内Ca++超载，产生一系列病理改变。
本实验发现，心脏停跳及复苏后脑组织ET-1含量上升，其来源尚不清楚。卞留贯认为脑组织缺血后，换算成相同单位，脑组织内皮素含量明显高于脑血管血中的内皮素含量，即使是血脑屏障破坏，也不大可能是从血中渗透而来[8]。Takahashi证实脑皮质神经元和星型胶质细胞内存在ET-mRNA，在缺血缺氧条件下，表达增加[6]。因此ET-1含量上升可能与神经元和星型胶质细胞分泌增加有关。
本实验发现脑皮质ET-1含量与脑组织Na+-K+ ATP酶活性成显著的负相关(r=-0.5683，P<0.05)，提示ET-1可能抑制脑组织的Na+-K+ ATP酶活性，其机理尚不清楚。
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Zeidel在肾内髓质集合管细胞中发现ET-1降低该细胞的氧耗，应用Quabain(Na+-K+ ATP酶的特异性抑制剂)后ET-1对之没有影响，ET-1抑制肾内髓质集合管细胞对86 Rb+(该物质的摄取依赖于Na+-K+ ATP酶活性)的摄取。该作者还进一步发现ET-1对氧耗和86 Rb+摄取的抑制作用是通过肾内髓质集合管细胞的前列腺素E2(PGE2)来实现的。作者认为ET-1对内髓质集合管细胞的Na+-K+ ATP酶活性有抑制作用，该作用与刺激PGE2合成有关[3]。脑复苏后ET-1产生增加，激活磷脂酶A2，使膜磷脂分解释放花生四烯酸，花生四烯酸在环氧化酶的作用下形成前列腺素类物质，包括前列腺素E2[9]。因此认为脑复苏后ET-1对Na+-K+ ATP酶活性的抑制作用可能与ET-1刺激PGE2的合成有关。
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本实验发现心脏停跳及复苏后脑组织ET-1含量明显升高，Na+-K+ ATP酶活性降低，两者呈显著负相关，ET-1可能是通过抑制Na+-K+ ATP酶的活性参与心脏停跳及复苏后脑组织损伤的。
[参考文献]
[1]Yanagisawa M,Kurihara HA.Novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells[J].Nature(London),1988,332:411-415.
[2]Arika Takasu,Kei-ichi Yagi,Yoshiaki Okada.Role of endothelin-1 in the failure of cerebral circulation after complete global cerebral ischemia[J].Resuscitation,1995,30:69-73.
, 百拇医药
[3]Zeidel ML,Brady MR,Kone BE,et al.Endothelin,a peptide inhibitor of Na+-K+ ATPase in intact tubular epithelial cells[J].Am J Physiol,1989,257(26):C1101.
[4]Vaagenes P,Cantadere R,Safar P,et al.Amelioration of brain damadge by lidoflazaine after prolonged ventricular fibrillation cardiac arrest in dogs[J].Crit Care Med,1984,12:846.
[5]Lowry OH,Resebrough NJ.Protein measurement with the following phenoil reagent[J].J Biol Chem,1951,193:265.
, 百拇医药
[6]Hsli E, Hsli L.Autoradiographaic evidence for endothelin receptors on astrocytes in cultures of rat cerebellum,brainstem and spinal cord[J].Neurosci Lett, 1991,129:55-58.
[7]卞留贯.内皮素与脑血管痉挛[J].上海第二医科大学学报，1993，13：258.
[8]Liu-Guan Bian,Tian-Xie Zhang,Wei-guo Zhao,et al.Increased endothelin-1 in the rabbit model of middle cerebral artery occlusion[J]. Neurosci Lett,1994,174:47-50.
[9]Uemura Y,Miller JM.Action of PLA2,C on free fatty acid release during complete ischemia in rat neocortex[J].J Neurosurg,1992,74:648.
[收稿：2000-05-27，修回：2000-07-10], 百拇医药
单位：上海第二军医大学附属长征医院急救科，200003
关键词：心脏停跳；复苏；ET-1；Na+-K++ATP酶
中国急救医学000803 [摘 要] 目的 研究犬心脏停跳及复苏后脑组织内皮素-1(Endothelin,ET-1)含量、Na+-K+ ATP酶活性的变化，探讨ET-1在复苏后脑损伤中的可能作用机制。方法 采用犬室颤心跳呼吸骤停模型，进行标准心肺复苏，分别观察室颤前、心脏停跳10 min及复苏后30 min、2 h和4 h的脑组织ET-1含量和Na+-K+ ATP酶活性变化及两者之间的关系。结果 心脏停跳及复苏后脑组织ET-1含量明显升高，Na+-K+ ATP酶活性降低，两者呈显著负相关。结论 心脏停跳及复苏后脑组织ET-1含量升高引起脑组织损伤，其可能的作用机制之一是抑制了Na+-K+ ATP酶的活性。
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[中图分类号] R 541.7；R 605.974 [文献标识码] A [文章编号] 1002-1949(2000)08-0451-02
Changes of endothelin-1 content and Na+-K+ ATPase activity in brain tissue in resuscitated dogs after cardiac arrest
JIN Xiucai,YANG Xing-yi,ZHAO Liang
(Emergency Department, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
[Abstract] Objective To investigate the possible mechanism of ET-1 in brain injury after cardiac arrest(CA)and postresuscitation.Methods The dogs with CA model of ventricular fibrillation were used to be resuscitated with standerd cardiopulmonary resuscitation.We observed the changes of ET-1 content and Na+-K+ ATPase activity in brain tissue before ventricular fibrillation,after ten minutes of CA and postresuscitation 30 min,2 h,4 h respectively.Results ET-1 content was increased signifcantly and Na+-K+ ATPase activity was decreased after ten minutes of CA and postresuscitation.There was a negative correlation between them.Conclusion ET-1 played a crucial role in brain tissue injury postresuscitation,one of the possible mechanism was associated with inhibition of Na+-K+ ATPase activity.
, 百拇医药
[Key words] Cardiac arrest； Resuscitation； ET-1 Na+-K+ ATPase
目前在复苏后脑组织损伤机理的研究中，ET-1引起了人们较多的重视。ET-1是一种强烈的血管收缩剂[1]，通过收缩血管，引起微循环紊乱，造成缺血缺氧而引起损伤，形成恶性循环。Arika[2]在心肺复苏犬的矢状窦静脉血中发现ET-1含量上升。血管平滑肌细胞和肾内髓质集合管细胞的研究发现，血管收缩物质(如ET-1)可抑制Na+-K+ ATP酶活性[3]。心肺复苏犬脑组织中ET-1含量变化及ET-1对脑组织Na+-K+ ATP酶的作用尚不清楚。本实验通过检测犬心脏停跳及复苏后脑组织中ET-1含量及Na+-K+ ATP酶活性变化和两者之间的相关关系，探讨复苏后ET-1对脑组织损伤的可能的作用机制。
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1 材料与方法
1.1 动物处理与心脏停跳复苏犬模型的制备
犬在氯胺酮10 mg/kg诱导麻醉后，以3%戊巴比妥30 mg/kg进行麻醉，并行气管插管，呼吸机辅助呼吸(SIMV)(潮气量约为15 ml/kg，频率约为20次/min)。同时行心电监护，并行股动脉、股静脉插管，监测中心静脉压、动脉压等指标(sirecust960)。颅顶正中钻孔开窗1.5 cm×1.5 cm，不损及硬脑膜，备取脑组织标本用。利用pittsburg标准室颤模型[4]，体外经胸壁以60～70 V直流电持续5 s电休克，直至心电图出现室颤，动脉压降为0，必要时可重复，停止机械辅助呼吸。10分钟后开始复苏，采用开胸标准心肺复苏法，同时应用肾上腺素、碳酸氢钠等药物，以机械控制通气(潮气量与频率同室颤前)使犬恢复自主循环。
1.2 动物分组
, 百拇医药
选取体重10～15 kg健康杂种犬32条，随机分为8组，每组4条，正常对照组：动物麻醉后立即取标本进行检测；三个假手术组：麻醉后不致颤，分别于手术后30 min、2 h和4 h取标本进行检测；心脏停跳组：动物致颤10 min后立即取标本，不复苏；三个复苏组：分别于复苏后30 min、2 h和4 h取标本进行检测。
1.3 标本采集及处理
取左顶叶脑组织，匀浆离心后取上清-20℃保存，待批量测定。
1.4 脑组织ET-1含量及Na+-K+ ATP酶活性的测定
脑组织ET-1含量测定试剂盒由北京东亚免疫技术研究所提供，Na+-K+ ATP酶活性测定试剂盒由南京建成生物工程公司提供，按说明书进行检测。组织蛋白定量按Lowry法[5]。
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1.5 统计学处理
数据以均数±标准差显示，以完全随机设计资料的方差分析作F检验，以P<0.05为相差显著，P<0.01为相差非常显著。
2 结果
脑组织ET-1含量及Na+-K+ ATP酶活性正常对照组与假手术组无明显差别，从心脏停跳组开始，脑组织ET-1含量有明显上升，随复苏后时间的延长而进行性上升，Na+-K+ ATP酶活性则呈进行性降低(见附表)。相关回归分析发现脑组织ET-1含量与Na+-K+ ATP酶活性之间呈显著负相关(r=-0.5683，P<0.05)。
附表 各组脑组织ET-1及Na+-K+ ATP酶活性变化
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脑组织Na+-K+ ATP酶
活性(μmolPi/mg蛋白/h)
脑组织ET-1含量
(pg/mg蛋白)
正常对照组
9.38±0.71
1.50±0.24
假手术组(30 min)
9.63±0.94
1.48±0.36
假手术组(2 h)
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9.42±0.46
1.47±0.45
假手术组(4 h)
9.41±0.54
1.49±0.19
心脏停跳组
8.34±0.58*
1.86±0.32*
复苏组(30 min)
8.40±0.39*
1.96±0.17*
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复苏组(2 h)
7.20±0.53+
2.15±0.43+
复苏组(4 h)
6.92±0.71+
2.20±0.25+
*：P<0.01(与正常对照组比较)；+：P<0.01(与心脏停跳组比较)
3 讨论
内皮素是从培养的血管内皮细胞上清液中提取的一组强烈的血管收缩因子[1]，目前发现的ET有三种，ET-1，2，3，中枢神经系统内以ET-1，3为主，主要由血管内皮细胞、星型胶质细胞和神经元分泌产生[6]。内皮素作用于血管平滑肌细胞，使其细胞内Ca++增加，导致血管痉挛。但体内内皮细胞也能降解内皮素，维持其低浓度；另一方面，内皮素又能刺激正常内皮细胞产生内源性血管舒缓因子和前列环素，以拮抗内皮素的缩血管作用，因此生理情况下不产生病理效应。但当内皮细胞受到物理、化学刺激，内皮细胞受损，内皮素产生增加，降解减弱，从而引起病理效应，表现为血管收缩，加重脑缺血缺氧，形成恶性循环[7]。
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Na+-K+ ATP酶能够逆浓度梯度转运Na+、K+，从而维持细胞的正常生理功能，当该酶活性降低，细胞内水钠潴留，发生肿胀，并导致突触膜对兴奋性氨基酸的摄取减弱，使细胞内Ca++超载，产生一系列病理改变。
本实验发现，心脏停跳及复苏后脑组织ET-1含量上升，其来源尚不清楚。卞留贯认为脑组织缺血后，换算成相同单位，脑组织内皮素含量明显高于脑血管血中的内皮素含量，即使是血脑屏障破坏，也不大可能是从血中渗透而来[8]。Takahashi证实脑皮质神经元和星型胶质细胞内存在ET-mRNA，在缺血缺氧条件下，表达增加[6]。因此ET-1含量上升可能与神经元和星型胶质细胞分泌增加有关。
本实验发现脑皮质ET-1含量与脑组织Na+-K+ ATP酶活性成显著的负相关(r=-0.5683，P<0.05)，提示ET-1可能抑制脑组织的Na+-K+ ATP酶活性，其机理尚不清楚。
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Zeidel在肾内髓质集合管细胞中发现ET-1降低该细胞的氧耗，应用Quabain(Na+-K+ ATP酶的特异性抑制剂)后ET-1对之没有影响，ET-1抑制肾内髓质集合管细胞对86 Rb+(该物质的摄取依赖于Na+-K+ ATP酶活性)的摄取。该作者还进一步发现ET-1对氧耗和86 Rb+摄取的抑制作用是通过肾内髓质集合管细胞的前列腺素E2(PGE2)来实现的。作者认为ET-1对内髓质集合管细胞的Na+-K+ ATP酶活性有抑制作用，该作用与刺激PGE2合成有关[3]。脑复苏后ET-1产生增加，激活磷脂酶A2，使膜磷脂分解释放花生四烯酸，花生四烯酸在环氧化酶的作用下形成前列腺素类物质，包括前列腺素E2[9]。因此认为脑复苏后ET-1对Na+-K+ ATP酶活性的抑制作用可能与ET-1刺激PGE2的合成有关。
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本实验发现心脏停跳及复苏后脑组织ET-1含量明显升高，Na+-K+ ATP酶活性降低，两者呈显著负相关，ET-1可能是通过抑制Na+-K+ ATP酶的活性参与心脏停跳及复苏后脑组织损伤的。
[参考文献]
[1]Yanagisawa M,Kurihara HA.Novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells[J].Nature(London),1988,332:411-415.
[2]Arika Takasu,Kei-ichi Yagi,Yoshiaki Okada.Role of endothelin-1 in the failure of cerebral circulation after complete global cerebral ischemia[J].Resuscitation,1995,30:69-73.
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[3]Zeidel ML,Brady MR,Kone BE,et al.Endothelin,a peptide inhibitor of Na+-K+ ATPase in intact tubular epithelial cells[J].Am J Physiol,1989,257(26):C1101.
[4]Vaagenes P,Cantadere R,Safar P,et al.Amelioration of brain damadge by lidoflazaine after prolonged ventricular fibrillation cardiac arrest in dogs[J].Crit Care Med,1984,12:846.
[5]Lowry OH,Resebrough NJ.Protein measurement with the following phenoil reagent[J].J Biol Chem,1951,193:265.
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[6]Hsli E, Hsli L.Autoradiographaic evidence for endothelin receptors on astrocytes in cultures of rat cerebellum,brainstem and spinal cord[J].Neurosci Lett, 1991,129:55-58.
[7]卞留贯.内皮素与脑血管痉挛[J].上海第二医科大学学报，1993，13：258.
[8]Liu-Guan Bian,Tian-Xie Zhang,Wei-guo Zhao,et al.Increased endothelin-1 in the rabbit model of middle cerebral artery occlusion[J]. Neurosci Lett,1994,174:47-50.
[9]Uemura Y,Miller JM.Action of PLA2,C on free fatty acid release during complete ischemia in rat neocortex[J].J Neurosurg,1992,74:648.
[收稿：2000-05-27，修回：2000-07-10], 百拇医药