BMP-4基因在成纤维细胞内的表达
作者：孟国林 胡蕴玉 谭祖键 杨柳 吕荣 白建平
单位：第四军医大学西京医院全军骨科研究所，西安710032
关键词：骨形态发生蛋白；成纤维细胞；基因治疗
中国矫形外科杂志000817 摘 要 目的：构建mBMP-4真核表达载体并转染成纤维细胞， 观测外源基因在靶细胞内的表达及对细胞表现型的影响。方法：利用基因重组技术构建mBMP -4基因真核表达载体pCR 3.1uni-mBMP-4；利用基因转染技术体外转染mBMP-4基因至成 纤维 细胞NIH3T3，转染的细胞用G418筛选，利用斑点杂交和免疫组化检测转染4周后外源基因表达 的情况。结果：琼脂糖电泳证明mBMP-4真核表达载体pCR 3.1uni-mBMP-4构建成功。细胞 转染后第4周，斑点杂交和免疫组化均显示为阳性，阳性细胞碱性磷酸酶表达升高。结论：外 源BMP-4基因可在成纤维细胞内获得表达并可影响靶细胞的表现型。
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中图分类号 R329 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2000)08-0783-03
Expression of BMP-4 Gene in Fibroblasts
MENG Guo-lin, H U Yun-yu,TAN Zu-jian， et al
(Department of Orthopaedics,Xijing Hospital,Xi'an ，710032)
Abstract Objective: To construct the eukaryonic expres sion vector of mBMP-4,transfes the eukaryonic expression vector pCR 3.1uni-mBM P-4 into the fibroblast and observe the expression of the transferred gene in the c ells.Method:Using the gene recombine technology to construct the eukaryonic expr ession vector pCR 3.1uni-mBMP4.With the help of lipofectamine and using the g ene transferring technology,we transferred the expression vector into the fibroblast NIH3T3.The transferred cells were filtered by G418.The exprexssion of mBMP-4 w a s evaluated by stain-hybrization and immuno-histochemistry technology 4 weeks af ter the transfer.Result:Agarose electrophoresis proved the success of the constr uction of the eukaryonic expression vector of mBMP-4.Through stain-hybrization a nd immuno-histochemistry,we proved that the transferred cells had expressed mBM P -4 at mRNA and protein levels after 4 weeks of filteration with G418.The expres s ion of ALP of the positive cells had also increased.Conclusion:Heterogenous mBMP -4 gene could be expressed in the target cell fibroblast.The expression of the gene could also affect the phenotype of the target cells.
, 百拇医药
Key words Bone morphogenetic protein Fibroblast Gene th erapy
将外源性基因转入细胞内并有效表达从而达到治疗目的是目前转基因技术的主要策略， 目前通过转基因技术治疗骨科疾病已经进入了探索阶段。实验证明，成纤维细胞具有向成骨 细胞方向转化的能力[1]，也即它具有潜在成骨能力，是属于诱导性骨祖细胞(ind ucible osteogenic precursor cell,IOPC)范畴的细胞，目前已经被认为是组织工程中成骨 细胞来源之一的种子细胞。在诱导因子作用下，它可向成骨细胞方向发生不可逆转化，并进 而形成新骨。BMP是一种具有诱导IOPC类细胞向成骨细胞方向转化并形成新骨的蛋白。成纤 维细胞来源丰富，取材方便，且容易培养，随着转基因技术的发展，也发现它是一种良好的 外源基因受体细胞[2]。本实验的目的既是通过将构建的BMP-4的真核表达载体转 入成纤维细胞内，并使之在该细胞内表达，为 骨折等疾病的基因治疗及骨组织工程学研究 奠定一定的实验基础。
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1 材料与方法
1.1 试剂和仪器 质粒pCR 3.1uni和PUC19-mBMP-4均由吕振华博士馈赠，EcoRⅠ和Hind Ⅲ、 T4DNA 连接酶、溴化乙锭(EB)、RNAase、牛胰蛋白酶均购自华美公司，普通琼脂糖、脂质体 (lipofectamin)、DMEM等均购自Gibco公司，G418购自Geneclone公司，胎牛血清购自Hyclone公司，BMP多克隆抗体购自第四军医大学口腔医院病理学教研室；另需CO2孵箱，CO2培 养箱，低温冷冻高速离心机，空气恒温摇床，水平电泳仪等。
1.2 成纤维细胞的培养 NIH3T3细胞(本实验室细胞库冻存)在37℃、5%CO2、饱和湿度 下 连续传代培养(牛胰蛋白酶浓度0.25%)，使用培养基为DMEM(内含10%胎牛血清)；使用不同浓 度梯度的G418对成纤维细胞进行最大耐受浓度的筛选。
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1.3 真核表达载体pCR 3.1uni-mBMP-4的构建和鉴定 采用氯化钙法将PUC19-mBMP-4 质粒转 化大肠杆菌感受态细胞HB101，转化后的大肠杆菌在琼脂糖平板上培养，经氨苄青霉素筛选 鉴定后挑选阳性菌落扩增，行mBMP-4质粒小量提取和酶切(EcoRⅠ和HindⅢ酶切)，鉴定后 试 剂盒(博大科技公司)回收mBMP-4片断；采用相同的酶(EcoRⅠ和HindⅢ)酶切pCR 3.1uni质 粒 并回收线性质粒片段；采用T4DNA连接酶将mBMP-4定向克隆到真核表达载体pCR 3.1uni中 ；将 构建好的载体转化到大肠杆菌HB101中并大量扩增、回收、纯化新构建的质粒；采用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切新构建的质粒，行1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
1.4 真核表达载体pCR 3.1uni-mBMP-4转染成纤维细胞及其表达的检测 采用脂质体(li pofe ctamine)转染法将真核表达载体pCR 3.1uni-mBMP-4转入成纤维细胞内，转染后的细胞采 用G 418进行筛选；同样的方法转染pCR 3.1uni空白载体到成纤维细胞，作为空白对照。提取培 养 的实验组和对照组细胞总RNA，采用Northern斑点杂交技术检测mBMP-4在mRNA水平的表达， 采用免疫组化的方法检测mBMP-4在蛋白水平的表达。钙钴法(Gomori-Takamatsu法)检测转 染前后成纤维细胞内碱性磷酸酶的表达。
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2 结果
2.1 成纤维细胞的培养 NIH3T3细胞生长良好，平均5～7d传代一次。G418梯度筛选显示其 成纤维细胞的最大耐受浓度为350μg/ml。
2.2 真核表达载体pCR 3.1uni-mBMP-4的酶切鉴定 采用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pCR 3. 1uni-mBMP-4质粒，将切下的片段和λDNA/HindⅢ Marker在1.5%琼脂糖凝胶中一起电泳， 溴化乙 锭 显色，凝胶电泳成像分析系统检测，可见有1.2和5.3kb两个电泳条带，其中前者代表mBMP- 4DNA片段，后者代表pCR 3.1uni片段，符合物理图谱，说明载体构建成功。(见图1)
图1 pcDNA3-BMP-4真核表达载体酶切图谱
, 百拇医药 2.3 mBMP-4在成纤维细胞内的表达 转染真核表达载体pCR 3.1uni-mBMP-4的成纤维细 胞在 G418筛选早期表现为大量细胞死亡，仅少量细胞生存，为转染阳性细胞；阳性细胞经克隆化 生长，大约在转染后第20d在培养瓶内生长到指数生长期末期，传代后的细胞继续经G418筛 选培养，在传代后7d达到指数生长期末期，继续传代，以后每代均为5～7d传代一次。斑点 杂交显示转染真核表达载体的实验组细胞中可检测到明显BMP-4mRNA表达，而转染空白载体 的对照组则未检测到BMP-4mRNA表达(见图2)。BMP免疫组化染色显示为实验组NIH3T3细胞内 出现大量黄色颗粒，颗粒大小和颜色代表BMP-4蛋白的多少，而对照组细胞则染色为阴性( 见 图3)。碱性磷酸酶钙钴法(Gomori-Takamastsu法)染色见被转染细胞胞浆内有黑色碱性磷酸 酶颗粒，颗粒粗大、染色较深， 而对照组细胞胞浆内未见明显的黑色染色的碱性磷酸酶 颗粒出现(见图4)。
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图2 BMP-4转染与未转染细胞mRNA斑点杂交，转染组为阳性，未转染组为阴性。
图3a BMP-4转染NIH3T3细胞第四周免疫组化见细胞内黄色阳性颗粒×400
图3b 未转染NIH3T3细胞第四周免疫组化见细胞内无黄色颗料×160。
图4a BMP-4转染NIH3T3细胞第四周ALP染色可见细胞内黑色颗粒较多。
图4b 未转染NIH3T3细胞第四周周ALP染色阴性
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3 讨论
转基因技术最早是用来将外源性基因转入靶细胞内以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗 目的。但是，随着转基因技术的发展，它已经不再局限于用于补充机体内因基因缺陷而导致 的某种蛋白的不足；一些疾病，比如肿瘤，也可通过该种方法进行治疗，并已经获得了良好 的效果。在骨科领域，目前已经在类风湿性关节炎[3]和骨肿瘤中得到了初步进展 [4]。近年来在骨折愈合的治疗中也开始了基因治疗的实验性探索研究。实验证明 ，外源性BMP基因在靶细胞内是可以表达成功的[5]。
成纤维细胞广泛存在于全身结缔组织中，是软组织损伤修复必不可少的成分。在正常情况下 ，皮肤从来是不会形成骨的，可是从皮肤所获得的成纤维细胞却可在体外培养条件下形成新 骨[1]。实验同时证明，成纤维细胞成骨过程中基质合成、分泌和钙盐沉积的过程 与成骨细胞成骨基本上是一致的，符合骨组织形成的过程，因此，皮肤成纤维细胞培养可作 为成骨细胞的种子细胞应用在骨组织工程中。
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骨形态发生蛋白是一族独特的蛋白，是目前发现的唯一具有诱导IOPC类细胞向成骨细胞方向 转化的蛋白质[6]。BMP-4作为该家族成员中的一名，也具有骨诱导作用。实验证 明 ，在正常组织及其周围组织中均无BMP-4表达，但在骨折早期就有BMP-4表达，BMP-4基因 主 要在骨折早期血肿内细胞及骨折周围软组织内新出现的间充质细胞内表达[7]，说 明它参与了机体骨折后的正常愈合过程。将BMP-4单独使用时也可诱导新骨形成[8] 。在本实验中，将mBMP-4基因转入成纤维细胞中，通过斑点杂交和免疫组化实验证明， 在 RNA水平和蛋白水平均有BMP-4的表达，即转入的mBMP-4基因不但转录出了mBMP-4的mRNA ，同 时该mRNA也翻译出了BMP-4蛋白。证明成纤维细胞可作为外源基因的受体细胞。同时，成纤 维细胞碱性磷酸酶表达的增加也说明，在成纤维细胞的细胞膜上有BMP-4的受体，成纤维细 胞表达的BMP-4通过自分泌作用而促进细胞表现型的表达。
成骨细胞是一种具有增殖能力的细胞。骨膜中的成骨细胞在骨折愈合的过程中发挥着重要作 用。1995年，有人[9]将克隆有荧光蛋白酶基因的BMP-2表达载体转染入兔成骨细 胞，经验测发现有荧光素蛋白酶的表达，但表达的BMP-2水平较低，未发现有细胞表现型的 改变。成骨细胞虽然可作为外源基因的靶细胞，但取材复杂。皮肤成纤维细胞具有培养方法 简单，且非常容易培养、传代速度快等良好特点。同时，皮肤成纤维细胞取材简单，容易获 取，对患者的身体和心理上的影响较小，其增殖速度快的特点使得可在短时间内获得大量的 细胞，从而满足在短时间内的大量需要，对组织工程和基因治疗方法治疗骨折和骨不连等疾 病具有独特的优点。
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转基因技术尚在起步阶段，目前仍存在许多问题等待解决。比如，转染效率低下；转入的外 源基因在整合过程中有可能激活癌基因；外源基因在靶细胞内的表达较低等。在本实验中， 尽管成纤维细胞表达出了BMP-4，但长期表达效果如何，表达出的BMP-4可否最终促进成纤 维 细胞转化为成骨细胞，目前尚不清楚，有待进一步研究。但随着研究的深入，我们相信，在 不久的将来，通过转基因技术来治疗一些疑难骨科疾病将成为可能。
本课题为国家自然科学基金资助项目，(项目编号：39870792)
作者简介：孟国林(1971-)，男，山东省东平县人，主 治医生，医学博士。研究方向：创伤与骨折愈合，骨组织工程。
参考文献：
〔1〕 饶寒敏，徐荣辉，朱雅萍.成纤维细胞成骨潜能的体外培养研究[J].中华骨科杂志，1995，12：845～848.
, 百拇医药
〔2〕 Anderson WF.Gene therapy for genetic diseases[J].Hum Gen e Ther,1994,5:281～282.
〔3〕 Bandara G,Mueller GM,Galea-lauri J.Intraarticular expressi on of biologically atice interleukin-1-receptor-antagonist protein by exvivo gene transfer[J].Proc Natl Acad Sci VSA,1993,90:10 764～10 768.
〔4〕 Skotzko M,Wu L,Anderson WF.Retroviral vector-mediated gene transfer of antisense cyclin G1(CYCG1)inhibits proliferation of human osteogeni c sarcoma cells[J].Cancer Res.1995,55:5 493～5 498.
, 百拇医药
〔5〕 Lou J,Xu F,Merkel K.Gene therapy:adenovirus-mediated human bone morphogenetic protein-2 gene transfer induces messenchymal progenitor cel l proliferation and differentiation in vitro and bone formation in vivo[J].J Orthop Res.1999,17:43～50.
〔6〕 胡蕴玉.骨诱导及骨愈合分子生物学研究进展[J].中华骨科杂志 ，1997，1：17～19.
〔7〕 马真胜，胡蕴玉，王臻.骨形态发生蛋白-4(BMP-4)基因表达在骨 折愈合过程中的定位[J].中华骨科杂志，1997，17：517～519.
〔8〕 Yamaguchi A,Ishizuya T,Kintou N.Effects of BMP-2,BMP-4 an d BMP-6 on osteoblastic differentiation of bone marrow-derived stromal cell li nes,ST2 and MC3T3-G2/PA6[J].Bioche Biophy Res Comm.1996,220:366～371.
〔9〕 王宏训，朱盛修，乔健.骨膜成骨细胞分离培养及其BMP-2cDNA基因 转染的初步研究[J].中华显微外科杂志，1996，273～275.
(收稿：2000-02-01 修回：2000-04-14), 百拇医药
单位：第四军医大学西京医院全军骨科研究所，西安710032
关键词：骨形态发生蛋白；成纤维细胞；基因治疗
中国矫形外科杂志000817 摘 要 目的：构建mBMP-4真核表达载体并转染成纤维细胞， 观测外源基因在靶细胞内的表达及对细胞表现型的影响。方法：利用基因重组技术构建mBMP -4基因真核表达载体pCR 3.1uni-mBMP-4；利用基因转染技术体外转染mBMP-4基因至成 纤维 细胞NIH3T3，转染的细胞用G418筛选，利用斑点杂交和免疫组化检测转染4周后外源基因表达 的情况。结果：琼脂糖电泳证明mBMP-4真核表达载体pCR 3.1uni-mBMP-4构建成功。细胞 转染后第4周，斑点杂交和免疫组化均显示为阳性，阳性细胞碱性磷酸酶表达升高。结论：外 源BMP-4基因可在成纤维细胞内获得表达并可影响靶细胞的表现型。
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中图分类号 R329 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2000)08-0783-03
Expression of BMP-4 Gene in Fibroblasts
MENG Guo-lin, H U Yun-yu,TAN Zu-jian， et al
(Department of Orthopaedics,Xijing Hospital,Xi'an ，710032)
Abstract Objective: To construct the eukaryonic expres sion vector of mBMP-4,transfes the eukaryonic expression vector pCR 3.1uni-mBM P-4 into the fibroblast and observe the expression of the transferred gene in the c ells.Method:Using the gene recombine technology to construct the eukaryonic expr ession vector pCR 3.1uni-mBMP4.With the help of lipofectamine and using the g ene transferring technology,we transferred the expression vector into the fibroblast NIH3T3.The transferred cells were filtered by G418.The exprexssion of mBMP-4 w a s evaluated by stain-hybrization and immuno-histochemistry technology 4 weeks af ter the transfer.Result:Agarose electrophoresis proved the success of the constr uction of the eukaryonic expression vector of mBMP-4.Through stain-hybrization a nd immuno-histochemistry,we proved that the transferred cells had expressed mBM P -4 at mRNA and protein levels after 4 weeks of filteration with G418.The expres s ion of ALP of the positive cells had also increased.Conclusion:Heterogenous mBMP -4 gene could be expressed in the target cell fibroblast.The expression of the gene could also affect the phenotype of the target cells.
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Key words Bone morphogenetic protein Fibroblast Gene th erapy
将外源性基因转入细胞内并有效表达从而达到治疗目的是目前转基因技术的主要策略， 目前通过转基因技术治疗骨科疾病已经进入了探索阶段。实验证明，成纤维细胞具有向成骨 细胞方向转化的能力[1]，也即它具有潜在成骨能力，是属于诱导性骨祖细胞(ind ucible osteogenic precursor cell,IOPC)范畴的细胞，目前已经被认为是组织工程中成骨 细胞来源之一的种子细胞。在诱导因子作用下，它可向成骨细胞方向发生不可逆转化，并进 而形成新骨。BMP是一种具有诱导IOPC类细胞向成骨细胞方向转化并形成新骨的蛋白。成纤 维细胞来源丰富，取材方便，且容易培养，随着转基因技术的发展，也发现它是一种良好的 外源基因受体细胞[2]。本实验的目的既是通过将构建的BMP-4的真核表达载体转 入成纤维细胞内，并使之在该细胞内表达，为 骨折等疾病的基因治疗及骨组织工程学研究 奠定一定的实验基础。
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1 材料与方法
1.1 试剂和仪器 质粒pCR 3.1uni和PUC19-mBMP-4均由吕振华博士馈赠，EcoRⅠ和Hind Ⅲ、 T4DNA 连接酶、溴化乙锭(EB)、RNAase、牛胰蛋白酶均购自华美公司，普通琼脂糖、脂质体 (lipofectamin)、DMEM等均购自Gibco公司，G418购自Geneclone公司，胎牛血清购自Hyclone公司，BMP多克隆抗体购自第四军医大学口腔医院病理学教研室；另需CO2孵箱，CO2培 养箱，低温冷冻高速离心机，空气恒温摇床，水平电泳仪等。
1.2 成纤维细胞的培养 NIH3T3细胞(本实验室细胞库冻存)在37℃、5%CO2、饱和湿度 下 连续传代培养(牛胰蛋白酶浓度0.25%)，使用培养基为DMEM(内含10%胎牛血清)；使用不同浓 度梯度的G418对成纤维细胞进行最大耐受浓度的筛选。
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1.3 真核表达载体pCR 3.1uni-mBMP-4的构建和鉴定 采用氯化钙法将PUC19-mBMP-4 质粒转 化大肠杆菌感受态细胞HB101，转化后的大肠杆菌在琼脂糖平板上培养，经氨苄青霉素筛选 鉴定后挑选阳性菌落扩增，行mBMP-4质粒小量提取和酶切(EcoRⅠ和HindⅢ酶切)，鉴定后 试 剂盒(博大科技公司)回收mBMP-4片断；采用相同的酶(EcoRⅠ和HindⅢ)酶切pCR 3.1uni质 粒 并回收线性质粒片段；采用T4DNA连接酶将mBMP-4定向克隆到真核表达载体pCR 3.1uni中 ；将 构建好的载体转化到大肠杆菌HB101中并大量扩增、回收、纯化新构建的质粒；采用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切新构建的质粒，行1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
1.4 真核表达载体pCR 3.1uni-mBMP-4转染成纤维细胞及其表达的检测 采用脂质体(li pofe ctamine)转染法将真核表达载体pCR 3.1uni-mBMP-4转入成纤维细胞内，转染后的细胞采 用G 418进行筛选；同样的方法转染pCR 3.1uni空白载体到成纤维细胞，作为空白对照。提取培 养 的实验组和对照组细胞总RNA，采用Northern斑点杂交技术检测mBMP-4在mRNA水平的表达， 采用免疫组化的方法检测mBMP-4在蛋白水平的表达。钙钴法(Gomori-Takamatsu法)检测转 染前后成纤维细胞内碱性磷酸酶的表达。
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2 结果
2.1 成纤维细胞的培养 NIH3T3细胞生长良好，平均5～7d传代一次。G418梯度筛选显示其 成纤维细胞的最大耐受浓度为350μg/ml。
2.2 真核表达载体pCR 3.1uni-mBMP-4的酶切鉴定 采用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pCR 3. 1uni-mBMP-4质粒，将切下的片段和λDNA/HindⅢ Marker在1.5%琼脂糖凝胶中一起电泳， 溴化乙 锭 显色，凝胶电泳成像分析系统检测，可见有1.2和5.3kb两个电泳条带，其中前者代表mBMP- 4DNA片段，后者代表pCR 3.1uni片段，符合物理图谱，说明载体构建成功。(见图1)
图1 pcDNA3-BMP-4真核表达载体酶切图谱
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图2 BMP-4转染与未转染细胞mRNA斑点杂交，转染组为阳性，未转染组为阴性。
图3a BMP-4转染NIH3T3细胞第四周免疫组化见细胞内黄色阳性颗粒×400
图3b 未转染NIH3T3细胞第四周免疫组化见细胞内无黄色颗料×160。
图4a BMP-4转染NIH3T3细胞第四周ALP染色可见细胞内黑色颗粒较多。
图4b 未转染NIH3T3细胞第四周周ALP染色阴性
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3 讨论
转基因技术最早是用来将外源性基因转入靶细胞内以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗 目的。但是，随着转基因技术的发展，它已经不再局限于用于补充机体内因基因缺陷而导致 的某种蛋白的不足；一些疾病，比如肿瘤，也可通过该种方法进行治疗，并已经获得了良好 的效果。在骨科领域，目前已经在类风湿性关节炎[3]和骨肿瘤中得到了初步进展 [4]。近年来在骨折愈合的治疗中也开始了基因治疗的实验性探索研究。实验证明 ，外源性BMP基因在靶细胞内是可以表达成功的[5]。
成纤维细胞广泛存在于全身结缔组织中，是软组织损伤修复必不可少的成分。在正常情况下 ，皮肤从来是不会形成骨的，可是从皮肤所获得的成纤维细胞却可在体外培养条件下形成新 骨[1]。实验同时证明，成纤维细胞成骨过程中基质合成、分泌和钙盐沉积的过程 与成骨细胞成骨基本上是一致的，符合骨组织形成的过程，因此，皮肤成纤维细胞培养可作 为成骨细胞的种子细胞应用在骨组织工程中。
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骨形态发生蛋白是一族独特的蛋白，是目前发现的唯一具有诱导IOPC类细胞向成骨细胞方向 转化的蛋白质[6]。BMP-4作为该家族成员中的一名，也具有骨诱导作用。实验证 明 ，在正常组织及其周围组织中均无BMP-4表达，但在骨折早期就有BMP-4表达，BMP-4基因 主 要在骨折早期血肿内细胞及骨折周围软组织内新出现的间充质细胞内表达[7]，说 明它参与了机体骨折后的正常愈合过程。将BMP-4单独使用时也可诱导新骨形成[8] 。在本实验中，将mBMP-4基因转入成纤维细胞中，通过斑点杂交和免疫组化实验证明， 在 RNA水平和蛋白水平均有BMP-4的表达，即转入的mBMP-4基因不但转录出了mBMP-4的mRNA ，同 时该mRNA也翻译出了BMP-4蛋白。证明成纤维细胞可作为外源基因的受体细胞。同时，成纤 维细胞碱性磷酸酶表达的增加也说明，在成纤维细胞的细胞膜上有BMP-4的受体，成纤维细 胞表达的BMP-4通过自分泌作用而促进细胞表现型的表达。
成骨细胞是一种具有增殖能力的细胞。骨膜中的成骨细胞在骨折愈合的过程中发挥着重要作 用。1995年，有人[9]将克隆有荧光蛋白酶基因的BMP-2表达载体转染入兔成骨细 胞，经验测发现有荧光素蛋白酶的表达，但表达的BMP-2水平较低，未发现有细胞表现型的 改变。成骨细胞虽然可作为外源基因的靶细胞，但取材复杂。皮肤成纤维细胞具有培养方法 简单，且非常容易培养、传代速度快等良好特点。同时，皮肤成纤维细胞取材简单，容易获 取，对患者的身体和心理上的影响较小，其增殖速度快的特点使得可在短时间内获得大量的 细胞，从而满足在短时间内的大量需要，对组织工程和基因治疗方法治疗骨折和骨不连等疾 病具有独特的优点。
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转基因技术尚在起步阶段，目前仍存在许多问题等待解决。比如，转染效率低下；转入的外 源基因在整合过程中有可能激活癌基因；外源基因在靶细胞内的表达较低等。在本实验中， 尽管成纤维细胞表达出了BMP-4，但长期表达效果如何，表达出的BMP-4可否最终促进成纤 维 细胞转化为成骨细胞，目前尚不清楚，有待进一步研究。但随着研究的深入，我们相信，在 不久的将来，通过转基因技术来治疗一些疑难骨科疾病将成为可能。
本课题为国家自然科学基金资助项目，(项目编号：39870792)
作者简介：孟国林(1971-)，男，山东省东平县人，主 治医生，医学博士。研究方向：创伤与骨折愈合，骨组织工程。
参考文献：
〔1〕 饶寒敏，徐荣辉，朱雅萍.成纤维细胞成骨潜能的体外培养研究[J].中华骨科杂志，1995，12：845～848.
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〔2〕 Anderson WF.Gene therapy for genetic diseases[J].Hum Gen e Ther,1994,5:281～282.
〔3〕 Bandara G,Mueller GM,Galea-lauri J.Intraarticular expressi on of biologically atice interleukin-1-receptor-antagonist protein by exvivo gene transfer[J].Proc Natl Acad Sci VSA,1993,90:10 764～10 768.
〔4〕 Skotzko M,Wu L,Anderson WF.Retroviral vector-mediated gene transfer of antisense cyclin G1(CYCG1)inhibits proliferation of human osteogeni c sarcoma cells[J].Cancer Res.1995,55:5 493～5 498.
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〔5〕 Lou J,Xu F,Merkel K.Gene therapy:adenovirus-mediated human bone morphogenetic protein-2 gene transfer induces messenchymal progenitor cel l proliferation and differentiation in vitro and bone formation in vivo[J].J Orthop Res.1999,17:43～50.
〔6〕 胡蕴玉.骨诱导及骨愈合分子生物学研究进展[J].中华骨科杂志 ，1997，1：17～19.
〔7〕 马真胜，胡蕴玉，王臻.骨形态发生蛋白-4(BMP-4)基因表达在骨 折愈合过程中的定位[J].中华骨科杂志，1997，17：517～519.
〔8〕 Yamaguchi A,Ishizuya T,Kintou N.Effects of BMP-2,BMP-4 an d BMP-6 on osteoblastic differentiation of bone marrow-derived stromal cell li nes,ST2 and MC3T3-G2/PA6[J].Bioche Biophy Res Comm.1996,220:366～371.
〔9〕 王宏训，朱盛修，乔健.骨膜成骨细胞分离培养及其BMP-2cDNA基因 转染的初步研究[J].中华显微外科杂志，1996，273～275.
(收稿：2000-02-01 修回：2000-04-14), 百拇医药