人工关节磨损微粒对体外培养外周血单核细胞的影响
作者：王青 范卫民 陶松年 王道新
单位：南京医科大学第一附属医院骨科，南京 210029
关键词：人工关节；骨溶解；磨损微粒；肿瘤坏死因子
中国矫形外科杂志000814 摘 要 目的：研究人工关节磨损微粒诱发骨溶解的机理，探 讨不同微粒物质介导骨溶解能力的差异。方法：通过体外培养人外周血单核细胞对超高分子 聚乙烯微粒和钛合金(Ti6A14V)微粒反应，检测培养上清液中肿瘤坏死因子(TNF-α)含量。 结果：超高分子聚乙烯微粒和钛合金微粒均可刺激单核细胞，使之产生更多的TNF-α，与 对照组相比较差异有统计学意义(P<0.01)。但超高分子聚乙烯组与钛合金组的TNF-α 含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：由实验证实Ti6A14V微粒与超高分子聚乙 烯微粒一样都可以激活外周血单核巨噬细胞，使其释放更多的溶骨性因子(TNF-α)。
, 百拇医药
中图分类号 R687 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2000)08-0773-03
Human Monocyte Response to Wear Particles of Polyethylene and Titan ium Alloy in Vitro
WANG Qing, FAN Wei-min,TAO Song-nian, et al
(Department of Orthopaedics. The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical Un iversity, Nanjing,210029)
Abstract Objective: To study the mechanisms of osteolys is induced by wear particles, and to discuss the ability of different particulat es to stimulate monocytes for producing TNF-α. Methods: In vitro human monocyt es were cultured and stimulated by polyethylene particles or Ti6A14V particles. The levels of TNF-α of the supernats were measured by radioimmunoassay. Result s: The levels of TNF-α were significantly increased when the monocytes were ex posed to polyethylene particles or Ti6A14V particles (P<0.01). There was no significant difference of TNF-α level between the polyethylene group and th e Ti6A14V group (P<0.05). Conclusion:Both polyethylence particles and Ti6A1 4V particles can stimulate moncytes to produce more TNF-α.
, 百拇医药
Key words Prosthesis Osteolysis Wear particles TNF
现代人工关节置换技术日趋成熟，但人工关节的无菌性松动一直是困扰骨科医生的难题。Ch arnley早在七十年代就注意到在松动假体骨水泥-骨界面形成一层结缔组织界膜。大量的临 床研究表明，在发生无菌性松动的假体周围，出现了一层结缔组织界膜，这层界膜组织中存 在着大量的人工关节磨损微粒，这些微粒物质的存在可能激发机体反应，产生过多的溶骨性 介质，诱发假体周围骨溶解，使金属假体的支撑结构遭到破坏，从而导致假体松动[1，2]。
本研究通过体外细胞培养了解不同微粒物质(聚乙烯微粒和金属微粒)刺激单核巨噬细胞，使 其产生溶骨性因子的能力，验证微粒物质所产生的溶骨作用及其可能的溶骨机理。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 采取20例股骨颈骨折患者外周血各6ml，肝素抗凝。20例患者中男性12例，女性8例。年龄55 ～71岁，平均年龄60.2岁。所有患者全身无其它慢性疾病。
采用分层液密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞[3，4]。方法：取抗凝血用Ha nks液稀释一倍，将其轻铺在葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll-Urografin)分层液(比重1.077)上 ，然后用水平离心机离心(2000rpm,30min)。单个核细胞悬于分层液上层，呈白膜状。用毛 细吸管吸取单个核细胞层，加入Hanks液清洗、离心(1500rpm,7min)3遍。加入含5%小牛血清 RPMI-1640培养基制成细胞悬液(细胞计数2×105)。用台盼蓝染色法检测细胞活力，经 检测活细胞比例均>95%。
单个核细胞主要由淋巴细胞和单核细胞组成。需进一步分离出单核细胞。用贴附法分离单核 细胞[3，4]：将每个标本分成3份，每份3ml，放入培养皿中，放置于培养箱中4h (37℃、5%CO2)，吸取非贴壁细胞，并用Hanks液轻轻清洗。由于单核细胞具有贴附能力 将贴附于培养皿底壁。
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单核细胞与磨损微粒混合培养：每个标本已分为3份，分别用RPMI-1640、RPMI-1640加聚 乙烯微粒、RPMI-1640加钛合金微粒进行培养(均加入10%小牛血清)，培养条件37℃、5%CO 2。培养48h后，收集上清液，-20℃保存。
Ficoll-Urografin分层液为购自上海化学试剂厂。RPMI-1640培养基购自Gibco公司。聚乙 烯微粒和钛合金微粒均由Zimmer公司赠送。聚乙烯微粒为超高分子聚乙烯(UHWPE)，为不规 则球形， 直径1.2～3.5μm，与RPMI-1640配置成微粒浓度1×109/ml；钛合金微粒为钛六铝四钒( Ti6A14V)，平均直径2.84μm，与RPMI-1640配置成微粒浓度1×109/ml。
TNF-α含量测定：上清液标本收集完成，将标本解冻，离心除去沉淀物。用放射免疫法测 定TNF-α。检测药盒购自东亚免疫技术研究所。所得数值用配伍设计方差分析进行统计学 处理。
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2 结果
空白对照组TNF-α均值为0.20±0.07ng/ml，聚乙烯微粒组TNF-α均值为0.49±0.13ng/ml钛合金微粒组TNF-α均值为0.55±0.21ng/ml。利用Exce197配伍组设计方差分析进行多样 本均数比较，差异有统计学意义(P<0.01)。各组间均数两两比较用q检验，空白 对照组分别与聚乙烯组、钛合金组比较有显著性差异(P<0.01)，聚乙烯组与钛合金 组比较有显著性差异(P>0.05)。
3 讨论
人工关节的无菌性松动仍是目前人工关节失败的主要原因。无菌性松动发生的原因包括机械 学因素和生物学因素两方面[5]。微粒物质诱发骨溶解是生物学因素中的主要内容 。在松动的假体-骨界面同样发现了一层结缔组织界膜，由纤维基质、成纤维细胞和大量的 巨噬细胞、多核巨细胞组成，与骨水泥界膜并无本质的区别。在界膜组织中发现了大量假体 磨损微粒，主要有：聚乙烯微粒、金属微粒、骨水泥微粒等[1，2，5]。
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人们注意到界膜组织中含有较高浓度的溶骨性因子。Chiba比较了松动假体与非松动假体界 膜组织，发现松动假体界膜可产生更多的白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤 坏死因子(TNF)[6]。通过原位分子杂交技术证实界膜组织中的巨噬细胞中有上述 溶骨性因子的基因表达[7]。于是推测巨噬细胞吞噬微粒物质后被激活，产生大量 的溶骨性因子，这些溶骨性因子使破骨细胞的破骨活性增强，从而引起假体周围的骨溶解， 假体的支撑结构遭到破坏，最终导致假体松动[8、9]。
从界膜组织中提取出的微粒进行分析后发现聚乙烯微粒数量最多分布最广，几乎见于所有界 膜组织中；金属微粒的数量较少。多数作者认为假体周围骨溶解主要由聚乙烯微粒引起。金 属微粒在界膜组织中数量较少，主要有钛合金和钴铬钼合金。钛合金中Ti6A14V合金应用最 广。关于金属微粒对骨溶解的作用目前仍有争论。Schmalzried等认为金属微粒引起的异物 反应远较聚乙烯要轻。这可能与金属微粒数量较少或金属微粒本身不易引起异物反应有关， 或两者都有[8]。但Huo等认为金属微粒亦可导致显著的骨溶解[9]。Roger s等的体外实验证实钛合金微粒同样可以激活巨噬细胞，释放溶骨性因子[10]。
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本研究在体外细胞培养实验中，用UHWPE微粒和Ti6A14V微粒与人外周血单核细胞混合培养， 检测培养上清液中TNF的含量，从而了解两种微粒激活单核巨噬细胞的能力。研究选择人体 外周血单核细胞作为靶细胞是由于它是组织中巨噬细胞的前体。单核细胞游走出血管壁进入 组织中即成为巨噬细胞，与假体周围组织中的磨损微粒有关[10]。单核细胞可以分 泌TNF、IL-1、IL-6等溶骨性因子。
巨噬细胞吞噬微粒后释放各种溶骨性因子，各种溶骨性因子如何相互作用目前仍不清楚。TN F是影响骨吸收的重要因子。人体TNF有两种形式：TNF-α由单核巨噬细胞产生：TNF-β由 T淋巴细胞产生，介导T淋巴细胞活性。在界膜组织中有大量巨噬细胞，淋巴细胞数量较少。 TNF激发骨吸收的机理仍不十分清楚。TNF激发的骨吸收作用可能由成骨细胞介导，TNF刺激 成骨细胞产生IL-6，IL-6在骨质吸收的调节上起重要作用[11]。
本次体外细胞培养实验证实，UHWPE微粒和Ti6A14V微粒同样都可以激活单核巨噬细胞，使之 释放多量的TNF，两者比较无显著差异。故大量的金属微粒亦可能导致骨溶解的发生。但在 人体界膜组织中金属微粒的数量较少，而聚乙烯微粒的数量最多。故一般认为聚乙烯微粒对 骨溶解起主要作用。于是近来又开始出现金属对金属的人工髋关节，取消了金属对聚乙烯的 磨损面，避免了聚乙烯微粒的产生。虽然新一代金属对金属关节的磨损率低于金属对聚乙烯 关节的磨损率，但本研究证实大量金属微粒的产生同样可以引起骨溶解，故金属对金属关节 的长期疗效仍有待观察[12]。
, 百拇医药
作者简介：王青(1968-)，男，上海籍，主治医师， 医学硕士，研究方向：关节外科。
参考文献：
〔1〕 Horikoshi M, Macaulay W, Booth RE, et al. Comparison of int erface membranes obtained from failed cemented and cementless hip and knee prost heses[J]. Clin Orthop, 1994,309:69～87.
〔2〕 Tanzer M, Maloney W, Jasty M, et al. The progression of fem oral cortical osteolysis in association with total hip arthroplasty without ceme nt[J]. J Bone Joint Surg,1992,74-A：401～412.
, http://www.100md.com
〔3〕 杨景山. 医学细胞化学与细胞生物学技术[M].北京医科大学中国 协和医科大学联合出版社.第一版，北京：1990，6～16.
〔4〕 Herman JH, Sowder WG, Anderson D, et al. Polymethylmethacry late-induced release of bone-resorbing factors[J]. J Bone Joint Surg,1989,71 -A：1530～1541.
〔5〕 戴克戎. 骨溶解与人工关节后期松动[J]. 中华骨科杂志，1997 ，17：3～4.
〔6〕 Chiba J, Rubash HE, Kim KJ, et al. The characterization of cytokines in the interface tissue obtained from failed cementless total hip arth roplasty with and without femoral osteolysis[J]. Clin Orthop, 1994,300:304～31 2.
, 百拇医药
〔7〕 Jiranek WA, Machado M, Jasty M, et al. Production of cytoki nes around loosened cemented acetabular components[J]. J Bone Joint Surg,1993, 75-A：863～878.
〔8〕 Schmalzried TP, Peter PC, Maurer BT, et al. Long-duration metal-on-metal total hip arthroplasties with low wear of the articulating surf aces[J]. J Arthroplasty,1996,11:322～331.
〔9〕 Huo MH, Betts F, Bogumill GP, et al. Metallic wear debris i n acetabular osteolysis in a mechanically stable cementless total hip replacemen t:report of a case[J]. Orthopedics, 1993,16:1277～1281.
, http://www.100md.com
〔10〕 Rogers SD, Howie DW, Graves SE, et al. In vitro hum an mono cyte response to wear particles of titanium alloy containing vanadium or niobium [J]. J Bone Joint Surg,1997,79-B：311～315.
〔11〕 史凤芹，于世凤. IL-1、TNF-和PGE-2对破骨细胞性骨吸 收的作用[J].中华骨科杂志，1995，15：458～460.
〔12〕 Dorr LD, Hilton KR, Wan Z, et al. Modern mental on m ental articulation for total hip replacements[J]. Clin Orthop, 1996,333:108～117.
(收稿：1999-11-16 修回：2000-01-31), 百拇医药
单位：南京医科大学第一附属医院骨科，南京 210029
关键词：人工关节；骨溶解；磨损微粒；肿瘤坏死因子
中国矫形外科杂志000814 摘 要 目的：研究人工关节磨损微粒诱发骨溶解的机理，探 讨不同微粒物质介导骨溶解能力的差异。方法：通过体外培养人外周血单核细胞对超高分子 聚乙烯微粒和钛合金(Ti6A14V)微粒反应，检测培养上清液中肿瘤坏死因子(TNF-α)含量。 结果：超高分子聚乙烯微粒和钛合金微粒均可刺激单核细胞，使之产生更多的TNF-α，与 对照组相比较差异有统计学意义(P<0.01)。但超高分子聚乙烯组与钛合金组的TNF-α 含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：由实验证实Ti6A14V微粒与超高分子聚乙 烯微粒一样都可以激活外周血单核巨噬细胞，使其释放更多的溶骨性因子(TNF-α)。
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中图分类号 R687 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2000)08-0773-03
Human Monocyte Response to Wear Particles of Polyethylene and Titan ium Alloy in Vitro
WANG Qing, FAN Wei-min,TAO Song-nian, et al
(Department of Orthopaedics. The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical Un iversity, Nanjing,210029)
Abstract Objective: To study the mechanisms of osteolys is induced by wear particles, and to discuss the ability of different particulat es to stimulate monocytes for producing TNF-α. Methods: In vitro human monocyt es were cultured and stimulated by polyethylene particles or Ti6A14V particles. The levels of TNF-α of the supernats were measured by radioimmunoassay. Result s: The levels of TNF-α were significantly increased when the monocytes were ex posed to polyethylene particles or Ti6A14V particles (P<0.01). There was no significant difference of TNF-α level between the polyethylene group and th e Ti6A14V group (P<0.05). Conclusion:Both polyethylence particles and Ti6A1 4V particles can stimulate moncytes to produce more TNF-α.
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Key words Prosthesis Osteolysis Wear particles TNF
现代人工关节置换技术日趋成熟，但人工关节的无菌性松动一直是困扰骨科医生的难题。Ch arnley早在七十年代就注意到在松动假体骨水泥-骨界面形成一层结缔组织界膜。大量的临 床研究表明，在发生无菌性松动的假体周围，出现了一层结缔组织界膜，这层界膜组织中存 在着大量的人工关节磨损微粒，这些微粒物质的存在可能激发机体反应，产生过多的溶骨性 介质，诱发假体周围骨溶解，使金属假体的支撑结构遭到破坏，从而导致假体松动[1，2]。
本研究通过体外细胞培养了解不同微粒物质(聚乙烯微粒和金属微粒)刺激单核巨噬细胞，使 其产生溶骨性因子的能力，验证微粒物质所产生的溶骨作用及其可能的溶骨机理。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 采取20例股骨颈骨折患者外周血各6ml，肝素抗凝。20例患者中男性12例，女性8例。年龄55 ～71岁，平均年龄60.2岁。所有患者全身无其它慢性疾病。
采用分层液密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞[3，4]。方法：取抗凝血用Ha nks液稀释一倍，将其轻铺在葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll-Urografin)分层液(比重1.077)上 ，然后用水平离心机离心(2000rpm,30min)。单个核细胞悬于分层液上层，呈白膜状。用毛 细吸管吸取单个核细胞层，加入Hanks液清洗、离心(1500rpm,7min)3遍。加入含5%小牛血清 RPMI-1640培养基制成细胞悬液(细胞计数2×105)。用台盼蓝染色法检测细胞活力，经 检测活细胞比例均>95%。
单个核细胞主要由淋巴细胞和单核细胞组成。需进一步分离出单核细胞。用贴附法分离单核 细胞[3，4]：将每个标本分成3份，每份3ml，放入培养皿中，放置于培养箱中4h (37℃、5%CO2)，吸取非贴壁细胞，并用Hanks液轻轻清洗。由于单核细胞具有贴附能力 将贴附于培养皿底壁。
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单核细胞与磨损微粒混合培养：每个标本已分为3份，分别用RPMI-1640、RPMI-1640加聚 乙烯微粒、RPMI-1640加钛合金微粒进行培养(均加入10%小牛血清)，培养条件37℃、5%CO 2。培养48h后，收集上清液，-20℃保存。
Ficoll-Urografin分层液为购自上海化学试剂厂。RPMI-1640培养基购自Gibco公司。聚乙 烯微粒和钛合金微粒均由Zimmer公司赠送。聚乙烯微粒为超高分子聚乙烯(UHWPE)，为不规 则球形， 直径1.2～3.5μm，与RPMI-1640配置成微粒浓度1×109/ml；钛合金微粒为钛六铝四钒( Ti6A14V)，平均直径2.84μm，与RPMI-1640配置成微粒浓度1×109/ml。
TNF-α含量测定：上清液标本收集完成，将标本解冻，离心除去沉淀物。用放射免疫法测 定TNF-α。检测药盒购自东亚免疫技术研究所。所得数值用配伍设计方差分析进行统计学 处理。
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2 结果
空白对照组TNF-α均值为0.20±0.07ng/ml，聚乙烯微粒组TNF-α均值为0.49±0.13ng/ml钛合金微粒组TNF-α均值为0.55±0.21ng/ml。利用Exce197配伍组设计方差分析进行多样 本均数比较，差异有统计学意义(P<0.01)。各组间均数两两比较用q检验，空白 对照组分别与聚乙烯组、钛合金组比较有显著性差异(P<0.01)，聚乙烯组与钛合金 组比较有显著性差异(P>0.05)。
3 讨论
人工关节的无菌性松动仍是目前人工关节失败的主要原因。无菌性松动发生的原因包括机械 学因素和生物学因素两方面[5]。微粒物质诱发骨溶解是生物学因素中的主要内容 。在松动的假体-骨界面同样发现了一层结缔组织界膜，由纤维基质、成纤维细胞和大量的 巨噬细胞、多核巨细胞组成，与骨水泥界膜并无本质的区别。在界膜组织中发现了大量假体 磨损微粒，主要有：聚乙烯微粒、金属微粒、骨水泥微粒等[1，2，5]。
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人们注意到界膜组织中含有较高浓度的溶骨性因子。Chiba比较了松动假体与非松动假体界 膜组织，发现松动假体界膜可产生更多的白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤 坏死因子(TNF)[6]。通过原位分子杂交技术证实界膜组织中的巨噬细胞中有上述 溶骨性因子的基因表达[7]。于是推测巨噬细胞吞噬微粒物质后被激活，产生大量 的溶骨性因子，这些溶骨性因子使破骨细胞的破骨活性增强，从而引起假体周围的骨溶解， 假体的支撑结构遭到破坏，最终导致假体松动[8、9]。
从界膜组织中提取出的微粒进行分析后发现聚乙烯微粒数量最多分布最广，几乎见于所有界 膜组织中；金属微粒的数量较少。多数作者认为假体周围骨溶解主要由聚乙烯微粒引起。金 属微粒在界膜组织中数量较少，主要有钛合金和钴铬钼合金。钛合金中Ti6A14V合金应用最 广。关于金属微粒对骨溶解的作用目前仍有争论。Schmalzried等认为金属微粒引起的异物 反应远较聚乙烯要轻。这可能与金属微粒数量较少或金属微粒本身不易引起异物反应有关， 或两者都有[8]。但Huo等认为金属微粒亦可导致显著的骨溶解[9]。Roger s等的体外实验证实钛合金微粒同样可以激活巨噬细胞，释放溶骨性因子[10]。
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本研究在体外细胞培养实验中，用UHWPE微粒和Ti6A14V微粒与人外周血单核细胞混合培养， 检测培养上清液中TNF的含量，从而了解两种微粒激活单核巨噬细胞的能力。研究选择人体 外周血单核细胞作为靶细胞是由于它是组织中巨噬细胞的前体。单核细胞游走出血管壁进入 组织中即成为巨噬细胞，与假体周围组织中的磨损微粒有关[10]。单核细胞可以分 泌TNF、IL-1、IL-6等溶骨性因子。
巨噬细胞吞噬微粒后释放各种溶骨性因子，各种溶骨性因子如何相互作用目前仍不清楚。TN F是影响骨吸收的重要因子。人体TNF有两种形式：TNF-α由单核巨噬细胞产生：TNF-β由 T淋巴细胞产生，介导T淋巴细胞活性。在界膜组织中有大量巨噬细胞，淋巴细胞数量较少。 TNF激发骨吸收的机理仍不十分清楚。TNF激发的骨吸收作用可能由成骨细胞介导，TNF刺激 成骨细胞产生IL-6，IL-6在骨质吸收的调节上起重要作用[11]。
本次体外细胞培养实验证实，UHWPE微粒和Ti6A14V微粒同样都可以激活单核巨噬细胞，使之 释放多量的TNF，两者比较无显著差异。故大量的金属微粒亦可能导致骨溶解的发生。但在 人体界膜组织中金属微粒的数量较少，而聚乙烯微粒的数量最多。故一般认为聚乙烯微粒对 骨溶解起主要作用。于是近来又开始出现金属对金属的人工髋关节，取消了金属对聚乙烯的 磨损面，避免了聚乙烯微粒的产生。虽然新一代金属对金属关节的磨损率低于金属对聚乙烯 关节的磨损率，但本研究证实大量金属微粒的产生同样可以引起骨溶解，故金属对金属关节 的长期疗效仍有待观察[12]。
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作者简介：王青(1968-)，男，上海籍，主治医师， 医学硕士，研究方向：关节外科。
参考文献：
〔1〕 Horikoshi M, Macaulay W, Booth RE, et al. Comparison of int erface membranes obtained from failed cemented and cementless hip and knee prost heses[J]. Clin Orthop, 1994,309:69～87.
〔2〕 Tanzer M, Maloney W, Jasty M, et al. The progression of fem oral cortical osteolysis in association with total hip arthroplasty without ceme nt[J]. J Bone Joint Surg,1992,74-A：401～412.
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〔3〕 杨景山. 医学细胞化学与细胞生物学技术[M].北京医科大学中国 协和医科大学联合出版社.第一版，北京：1990，6～16.
〔4〕 Herman JH, Sowder WG, Anderson D, et al. Polymethylmethacry late-induced release of bone-resorbing factors[J]. J Bone Joint Surg,1989,71 -A：1530～1541.
〔5〕 戴克戎. 骨溶解与人工关节后期松动[J]. 中华骨科杂志，1997 ，17：3～4.
〔6〕 Chiba J, Rubash HE, Kim KJ, et al. The characterization of cytokines in the interface tissue obtained from failed cementless total hip arth roplasty with and without femoral osteolysis[J]. Clin Orthop, 1994,300:304～31 2.
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〔7〕 Jiranek WA, Machado M, Jasty M, et al. Production of cytoki nes around loosened cemented acetabular components[J]. J Bone Joint Surg,1993, 75-A：863～878.
〔8〕 Schmalzried TP, Peter PC, Maurer BT, et al. Long-duration metal-on-metal total hip arthroplasties with low wear of the articulating surf aces[J]. J Arthroplasty,1996,11:322～331.
〔9〕 Huo MH, Betts F, Bogumill GP, et al. Metallic wear debris i n acetabular osteolysis in a mechanically stable cementless total hip replacemen t:report of a case[J]. Orthopedics, 1993,16:1277～1281.
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〔11〕 史凤芹，于世凤. IL-1、TNF-和PGE-2对破骨细胞性骨吸 收的作用[J].中华骨科杂志，1995，15：458～460.
〔12〕 Dorr LD, Hilton KR, Wan Z, et al. Modern mental on m ental articulation for total hip replacements[J]. Clin Orthop, 1996,333:108～117.
(收稿：1999-11-16 修回：2000-01-31), 百拇医药