eNOS基因G894T突变位点与缺血性脑卒中的关系
作者：赵勇 马丽媛 刘力生 刘一仙 王兴宇 Klaus Lindpaintner
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学阜外心血管病医院高血压研究室，100037
关键词：内皮型一氧化氮合成酶；突变；缺血性脑卒中
中国急救医学000806 [摘 要] 目的 为了了解内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因G894T突变位点与中国人群缺血性脑卒中之间的关系。方法 我们利用PCR和分子杂交技术对北京地区294例缺血性脑卒中患者及280例非卒中对照的eNOS基因G894T突变位点进行了检测和分析。结果 G894T位点在两组人群中的分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，但该位点基因型频率及等位基因频率在两组人群中分布无差异。结论 eNOS基因G894T突变不是中国人群缺血性脑卒中发病的遗传学危险因素。
[中图分类号] R 743.3；Q 559；Q 75 [文献标识码] A [文章编号] 1002-1949(2000)08-0457-02
, 百拇医药
Relationship between eNOS gene G894T mutation and ischemic stroke
ZHAO Yong,MA Li-yuan,LIU Li-sheng
(Department of Hypertension,Fuwai Heart Hospital,CAMS & PUMC,Beijing 100037,China)
[Abstract] Objective To evaluate the relationship between the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene G894T mutation and the ischemic stroke in Chinese population.Methods The G894T mutation of 294 patients with ischemic stroke and 280 controls without stroke was determined by polymerase chain reaction (PCR) and corresponding probe hybridization.Results Showed that the G894T mutation was in agreement with Hardy-Weinberg equilibrium in either cases or controls.But neiter the prevalence rates of G894T genotypes nor 894T allele frequency was significantly different between these two groups. Conclusion This suggests that the G894T mutation of eNOS gene cannot be a genetic risk of ischemic stroke in Chinese population.
, http://www.100md.com
[Key words] Endothelial nitric oxide synthase; Mutation; Ischemic stroke
脑血管病是当今人类三大死亡原因之一。流行病学研究资料表明，我国脑卒中发病率为170.3/10万，其中男性为182.5/10万，女性为159.7/10万[1]。脑卒中病人中，75%～90%为缺血性脑卒中。缺血性脑卒中包括动脉粥样硬化性血栓性脑梗死、脑栓塞和腔隙性脑梗死。引起脑血管病的原因众多，如高龄、吸烟、饮酒、高血压、高血脂、高血糖、心脏病、纤维蛋白原水平异常和凝血机制障碍等，但许多人即使具备上述危险因素却未发生脑卒中，这说明脑卒中的发生还与其它因素有关，尤其是与遗传因素有关[2]。动脉粥样硬化是血管壁对各种刺激引起的一种保护性炎性纤维增生性反应，是心肌梗死、中风和肢端坏疽的主要原因[3]。研究表明，血管内皮细胞产生的一氧化氮(NO)能够松驰血管平滑肌，降低血压、防止平滑肌细胞增生，抑制血小板聚集和白细胞粘附，具有抗动脉粥样硬化的作用。NO是由一氧化氮合成酶(NOS)催化L-精氨酸释放瓜氨酸后生成的[4]。1993年，Marsden PA等[5]发现内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因外显子7中存在G894T突变位点。国外学者认为该突变可能与心脑血管疾病发生有关，并对此进行了广泛研究，但结论不尽一致。为了解eNOS基因G894T突变在血管阻塞性疾病发病中的作用，我们利用分子生物学技术对该突变与中国人群缺血性脑卒中的关系进行了病例对照研究。
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1 资料与方法
1.1 临床资料 缺血性脑卒中患者294例，随机的非缺血性脑卒中对照组280例，两组人群按照年龄(相差不过3岁)、性别以及血进行匹配。所有受试者均来自北京地区。
1.2 研究方法 取外周静脉血5 ml，根据血细胞DNA快速提取法提取基因DNA。采用PCR技术扩增eNOS基因中含有G894T突变位点的核苷酸编码序列，将扩增产物与生物素标记的eNOS基因探针进行杂交，经显色后判断多态性结果。
1.3 统计学方法 计量资料采用t检验；计数资料采用χ2分析。
2 结果
2.1 病例组和对照组临床资料分析 见表1。
表1 病例组和对照组的临床资料
, 百拇医药
病例组(n=294)
对照组(n=280)
P值
年龄(岁)
61.82±9.42
62.11±9.02
ns
性别(男/女)
182/112
177/103
ns
收缩压(mmHg)
, http://www.100md.com
141.46±17.80
142.06±20.29
ns
舒张压(mmHg)
85.73±11.35
86.02±12.54
ns
体重指数(kg/m2)
24.53±3.03
25.19±3.64
ns
胆固醇(mmol/L)
, 百拇医药
5.12±1.14
4.64±1.10
ns
甘油三酯(mmol/L)
1.76±0.99
1.38±0.87
ns
血糖(mmol/L)
6.06±2.47
5.50±1.56
ns
尿素氮(mmol/L)
, 百拇医药
5.46±2.26
6.02±1.94
ns
血肌酐(mmol/L)
91.15±21.56
92.14±22.20
ns
ns：无统计学意义
从表1可以看到，病例组和对照组的年龄、性别比例、血压水平、体重指数、血浆总胆固醇、甘油三酯、血糖、尿素氮、血肌酐水平均无显著差异。
2.2 病例组和对照组eNOS基因G894T突变位点基因型和等位基因分布 见表2。表2 病例组和对照组eNOS基因G894T多态性
, 百拇医药
位点基因型和等位基因分布频率
病例组(n=294)
对照组(n=280)
χ2
P
基因型
GG
214(72.79%)
207(73.93%)
GT
71(24.15%)
61(21.78%)
, http://www.100md.com
0.9616
>0.05
TT
9(3.06%)
12(4.29%)
等位基因
G894
499(84.86%)
475(84.82%)
0.0004
>0.05
894T
, http://www.100md.com
89(15.14%)
85(15.18%)
由表2可知，病例组eNOS基因G894T突变位点基因型和等位基因分布频率与对照组均无差异。
2.3 中国人群与英国人群eNOS基因G894T突变位点分布频率的比较 见表3。表3 中国人群与英国人群eNOS基因G894T突
变位点基因型和等位基因分布频率的比较
中国人群(n=574)
英国人群(n=597)
χ2
P
, 百拇医药
基因型
GG
421(73.34%)
223(37.35%)
GT
132(23.00%)
291(48.75%)
157.21
<0.005
TT
21.(3.66%)
83(13.90%)
, 百拇医药
等位基因
G894
974(84.84%)
737(61.73%)
158.91
<0.005
894T
174(15.16%)
457(38.27%)
由于eNOS基因G894T突变位点在中国缺血性脑卒中及非卒中患者分布无差异，因此我们将这两组人群合并，然后同英国人群[6]中的分布情况进行比较，以了解该突变位点分布的种族差异性。
, 百拇医药
由表3可知，中国人群eNOS基因894T等位基因频率低于英国人，G894T突变位点基因型分布与英国人群相比有显著差异。为明确何种基因型在两组人群中的分布存在差异，我们利用χ2分割法对构成比差别最小的两种基因型(GT和TT)进行分析，结果见表4。表4 中国人群与英国人群eNOS
基因G894T突变位点各基因型构成比较
中国人群
英国人群
χ2值
P
基因型
GT
132
, 百拇医药
291
4.9143
<0.05
TT
21
83
由表3和表4可知，中国人群与英国人群eNOS基因G894T突变位点各基因型构成比分布均不相同。中国人群中的GG基因型分布频率高于英国人，而GT、TT基因型均较英国人低。
3 讨论
目前，在哺乳动物中已发现三种一氧化氮合成酶(NOS)，其中eNOS(即NOSⅢ或NOS3)主要存在于血管内皮细胞，参与动静脉血流动力学调节，与心脑血管疾病的关系较为密切。
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人eNOS含有1 203个氨基酸，其基因为单拷贝，位于染色体7 q35～q36，全长21 kb左右，有26个外显子和25个内含子[7，8]，外显子7中的G894T多态性伴有氨基酸序列的改变，即298位的Glu被Asp取代[5]。国外学者曾对eNOS基因G894T多态性与原发性高血压之间的关系进行研究，但结论不尽一致[9～12]。日本学者发现，894T等位基因与心肌梗死发生有关[13，14]，这可能与蛋白序列Glu被Asp取代后eNOS在此处的构象由α螺旋变为紧密折叠，从而引起eNOS活性低有关。
1998年，Markus HS等[6]对eNOS基因G894T多态性与英国人群缺血性脑卒中的关系进行了病例对照研究，病例组361人，对照组236人，结果发现，GG、GT、TT三种基因型频率在病例组中依次为35.2%、51.8%、13.0%，对照组为40.7%、44.1%、15.3%，894T等位基因频率分布分别为39%和37%，均无显著性差异。提示该多态性与英国人群缺血性脑卒中发病无关。我们的研究也表明，eNOS基因G894T多态性基因型和等位基因在缺血性脑卒中和非卒中人群中分布无统计学差异，支持该多态性与缺血性脑卒中发病无关的结论。但是，同英国人群相比，我国GG基因型分布频率较高，而GT、TT基因型较低，说明894T等位基因分布可能具有种族差异。
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[参考文献]
[1]Cheng XM,Ziegler DK,Lai Y-HC,et al.Stroke in China,1986 through 1990[J].Stroke,1995,26(11):1990-1994.
[2]张成，刘焯霖.重视脑血管病的遗传学研究[J].中华神经科杂志，1999，32(5)：262-264.
[3]Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the 1990s[J].Nature,1993,362(6423):801-809.
[4]Ignarro LJ.Biosynthesis and metabolism of endothelium-derived nitric oxide[J].Ann Rev Pharmacol Toxicol,1990,30:535-560.
, http://www.100md.com
[5]Marsden PA,Heng HHQ,Scherer SW，et al.Structure and chromosomal localization of the human constitutive endothelial nitric oxide synthase gene[J].J Biol Chem,1993,268(23):17478-17488.
[6]Markus HS,Ruigrok Y,Ali N,et al.Endothelial nitric oxide synthase exon 7 polymorphism,ischemic cerebrovascular disease,and carotid atheroma[J].Stroke,1998,29(9):1908-1911.
[7]Miyahara K,Kawamoto T,Sase K,et al.Cloning and structural characterixation of the human endothelial nitric oxide synthase gene[J].Eur J Biochem,1994,223(3);719-726.
, 百拇医药
[8]Nadaud S,Bonnardeaux A,Lathrop M,et al.Gene structure,polymorphism and mapping of the human endothelial nitric oxide synthase gene[J].Biochem Biophys Res Commun,1994,198(3):1027-1033.
[9]Hingorani AD,Liang CF,Fatibene J,et al.A common variant of the endothelial nitric oxide synthase gene is a risk factor for coronary atherosclerosis in the East Anglian Region of the UK.(abstr.)[J]. Circulation,1997,96(8 suppl 1):545.
[10]Miyamoto Y,Saito Y,Kajiyama N,et al.Endothelial nitric oxide synthase gene is positively associated with essential hypertension[J].Hypertension,1998,32(1):3-8.
, http://www.100md.com
[11]Kato N,Sugiyama T,Morita H,et al.Lack of evidence for association between the endothelial nitric oxide synthase gene and hypertension[J].Hypertension,1999,33(4):933-936.
[12]Lacolley P,Gautier S,Poirier O,et al.Nitric oxide synthase gene polymorphism,blood pressure and aortic stiffnessin normotensive and hypertensive subjects[J].J Hypertens,1998,16(1):31-35.
[13]Hibi K,Ishigami T,Tamura K,et al.Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphism and acute myocardial infarction[J].Hypertension,1998,32(3):521-526.
[14]Shimasaki Y,Yasue H,Yoshimura M,et al.Association of the missense Glu 298 Asp variant of the endothelial nitric oxide synthase gene with myocardial infarction[J].JACC,1998,31(7):1506-1510.
[收稿：2000-04-16], 百拇医药
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学阜外心血管病医院高血压研究室，100037
关键词：内皮型一氧化氮合成酶；突变；缺血性脑卒中
中国急救医学000806 [摘 要] 目的 为了了解内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因G894T突变位点与中国人群缺血性脑卒中之间的关系。方法 我们利用PCR和分子杂交技术对北京地区294例缺血性脑卒中患者及280例非卒中对照的eNOS基因G894T突变位点进行了检测和分析。结果 G894T位点在两组人群中的分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，但该位点基因型频率及等位基因频率在两组人群中分布无差异。结论 eNOS基因G894T突变不是中国人群缺血性脑卒中发病的遗传学危险因素。
[中图分类号] R 743.3；Q 559；Q 75 [文献标识码] A [文章编号] 1002-1949(2000)08-0457-02
, 百拇医药
Relationship between eNOS gene G894T mutation and ischemic stroke
ZHAO Yong,MA Li-yuan,LIU Li-sheng
(Department of Hypertension,Fuwai Heart Hospital,CAMS & PUMC,Beijing 100037,China)
[Abstract] Objective To evaluate the relationship between the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene G894T mutation and the ischemic stroke in Chinese population.Methods The G894T mutation of 294 patients with ischemic stroke and 280 controls without stroke was determined by polymerase chain reaction (PCR) and corresponding probe hybridization.Results Showed that the G894T mutation was in agreement with Hardy-Weinberg equilibrium in either cases or controls.But neiter the prevalence rates of G894T genotypes nor 894T allele frequency was significantly different between these two groups. Conclusion This suggests that the G894T mutation of eNOS gene cannot be a genetic risk of ischemic stroke in Chinese population.
, http://www.100md.com
[Key words] Endothelial nitric oxide synthase; Mutation; Ischemic stroke
脑血管病是当今人类三大死亡原因之一。流行病学研究资料表明，我国脑卒中发病率为170.3/10万，其中男性为182.5/10万，女性为159.7/10万[1]。脑卒中病人中，75%～90%为缺血性脑卒中。缺血性脑卒中包括动脉粥样硬化性血栓性脑梗死、脑栓塞和腔隙性脑梗死。引起脑血管病的原因众多，如高龄、吸烟、饮酒、高血压、高血脂、高血糖、心脏病、纤维蛋白原水平异常和凝血机制障碍等，但许多人即使具备上述危险因素却未发生脑卒中，这说明脑卒中的发生还与其它因素有关，尤其是与遗传因素有关[2]。动脉粥样硬化是血管壁对各种刺激引起的一种保护性炎性纤维增生性反应，是心肌梗死、中风和肢端坏疽的主要原因[3]。研究表明，血管内皮细胞产生的一氧化氮(NO)能够松驰血管平滑肌，降低血压、防止平滑肌细胞增生，抑制血小板聚集和白细胞粘附，具有抗动脉粥样硬化的作用。NO是由一氧化氮合成酶(NOS)催化L-精氨酸释放瓜氨酸后生成的[4]。1993年，Marsden PA等[5]发现内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因外显子7中存在G894T突变位点。国外学者认为该突变可能与心脑血管疾病发生有关，并对此进行了广泛研究，但结论不尽一致。为了解eNOS基因G894T突变在血管阻塞性疾病发病中的作用，我们利用分子生物学技术对该突变与中国人群缺血性脑卒中的关系进行了病例对照研究。
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1 资料与方法
1.1 临床资料 缺血性脑卒中患者294例，随机的非缺血性脑卒中对照组280例，两组人群按照年龄(相差不过3岁)、性别以及血进行匹配。所有受试者均来自北京地区。
1.2 研究方法 取外周静脉血5 ml，根据血细胞DNA快速提取法提取基因DNA。采用PCR技术扩增eNOS基因中含有G894T突变位点的核苷酸编码序列，将扩增产物与生物素标记的eNOS基因探针进行杂交，经显色后判断多态性结果。
1.3 统计学方法 计量资料采用t检验；计数资料采用χ2分析。
2 结果
2.1 病例组和对照组临床资料分析 见表1。
表1 病例组和对照组的临床资料
, 百拇医药
病例组(n=294)
对照组(n=280)
P值
年龄(岁)
61.82±9.42
62.11±9.02
ns
性别(男/女)
182/112
177/103
ns
收缩压(mmHg)
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141.46±17.80
142.06±20.29
ns
舒张压(mmHg)
85.73±11.35
86.02±12.54
ns
体重指数(kg/m2)
24.53±3.03
25.19±3.64
ns
胆固醇(mmol/L)
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5.12±1.14
4.64±1.10
ns
甘油三酯(mmol/L)
1.76±0.99
1.38±0.87
ns
血糖(mmol/L)
6.06±2.47
5.50±1.56
ns
尿素氮(mmol/L)
, 百拇医药
5.46±2.26
6.02±1.94
ns
血肌酐(mmol/L)
91.15±21.56
92.14±22.20
ns
ns：无统计学意义
从表1可以看到，病例组和对照组的年龄、性别比例、血压水平、体重指数、血浆总胆固醇、甘油三酯、血糖、尿素氮、血肌酐水平均无显著差异。
2.2 病例组和对照组eNOS基因G894T突变位点基因型和等位基因分布 见表2。表2 病例组和对照组eNOS基因G894T多态性
, 百拇医药
位点基因型和等位基因分布频率
病例组(n=294)
对照组(n=280)
χ2
P
基因型
GG
214(72.79%)
207(73.93%)
GT
71(24.15%)
61(21.78%)
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0.9616
>0.05
TT
9(3.06%)
12(4.29%)
等位基因
G894
499(84.86%)
475(84.82%)
0.0004
>0.05
894T
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89(15.14%)
85(15.18%)
由表2可知，病例组eNOS基因G894T突变位点基因型和等位基因分布频率与对照组均无差异。
2.3 中国人群与英国人群eNOS基因G894T突变位点分布频率的比较 见表3。表3 中国人群与英国人群eNOS基因G894T突
变位点基因型和等位基因分布频率的比较
中国人群(n=574)
英国人群(n=597)
χ2
P
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基因型
GG
421(73.34%)
223(37.35%)
GT
132(23.00%)
291(48.75%)
157.21
<0.005
TT
21.(3.66%)
83(13.90%)
, 百拇医药
等位基因
G894
974(84.84%)
737(61.73%)
158.91
<0.005
894T
174(15.16%)
457(38.27%)
由于eNOS基因G894T突变位点在中国缺血性脑卒中及非卒中患者分布无差异，因此我们将这两组人群合并，然后同英国人群[6]中的分布情况进行比较，以了解该突变位点分布的种族差异性。
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由表3可知，中国人群eNOS基因894T等位基因频率低于英国人，G894T突变位点基因型分布与英国人群相比有显著差异。为明确何种基因型在两组人群中的分布存在差异，我们利用χ2分割法对构成比差别最小的两种基因型(GT和TT)进行分析，结果见表4。表4 中国人群与英国人群eNOS
基因G894T突变位点各基因型构成比较
中国人群
英国人群
χ2值
P
基因型
GT
132
, 百拇医药
291
4.9143
<0.05
TT
21
83
由表3和表4可知，中国人群与英国人群eNOS基因G894T突变位点各基因型构成比分布均不相同。中国人群中的GG基因型分布频率高于英国人，而GT、TT基因型均较英国人低。
3 讨论
目前，在哺乳动物中已发现三种一氧化氮合成酶(NOS)，其中eNOS(即NOSⅢ或NOS3)主要存在于血管内皮细胞，参与动静脉血流动力学调节，与心脑血管疾病的关系较为密切。
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人eNOS含有1 203个氨基酸，其基因为单拷贝，位于染色体7 q35～q36，全长21 kb左右，有26个外显子和25个内含子[7，8]，外显子7中的G894T多态性伴有氨基酸序列的改变，即298位的Glu被Asp取代[5]。国外学者曾对eNOS基因G894T多态性与原发性高血压之间的关系进行研究，但结论不尽一致[9～12]。日本学者发现，894T等位基因与心肌梗死发生有关[13，14]，这可能与蛋白序列Glu被Asp取代后eNOS在此处的构象由α螺旋变为紧密折叠，从而引起eNOS活性低有关。
1998年，Markus HS等[6]对eNOS基因G894T多态性与英国人群缺血性脑卒中的关系进行了病例对照研究，病例组361人，对照组236人，结果发现，GG、GT、TT三种基因型频率在病例组中依次为35.2%、51.8%、13.0%，对照组为40.7%、44.1%、15.3%，894T等位基因频率分布分别为39%和37%，均无显著性差异。提示该多态性与英国人群缺血性脑卒中发病无关。我们的研究也表明，eNOS基因G894T多态性基因型和等位基因在缺血性脑卒中和非卒中人群中分布无统计学差异，支持该多态性与缺血性脑卒中发病无关的结论。但是，同英国人群相比，我国GG基因型分布频率较高，而GT、TT基因型较低，说明894T等位基因分布可能具有种族差异。
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[参考文献]
[1]Cheng XM,Ziegler DK,Lai Y-HC,et al.Stroke in China,1986 through 1990[J].Stroke,1995,26(11):1990-1994.
[2]张成，刘焯霖.重视脑血管病的遗传学研究[J].中华神经科杂志，1999，32(5)：262-264.
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[6]Markus HS,Ruigrok Y,Ali N,et al.Endothelial nitric oxide synthase exon 7 polymorphism,ischemic cerebrovascular disease,and carotid atheroma[J].Stroke,1998,29(9):1908-1911.
[7]Miyahara K,Kawamoto T,Sase K,et al.Cloning and structural characterixation of the human endothelial nitric oxide synthase gene[J].Eur J Biochem,1994,223(3);719-726.
, 百拇医药
[8]Nadaud S,Bonnardeaux A,Lathrop M,et al.Gene structure,polymorphism and mapping of the human endothelial nitric oxide synthase gene[J].Biochem Biophys Res Commun,1994,198(3):1027-1033.
[9]Hingorani AD,Liang CF,Fatibene J,et al.A common variant of the endothelial nitric oxide synthase gene is a risk factor for coronary atherosclerosis in the East Anglian Region of the UK.(abstr.)[J]. Circulation,1997,96(8 suppl 1):545.
[10]Miyamoto Y,Saito Y,Kajiyama N,et al.Endothelial nitric oxide synthase gene is positively associated with essential hypertension[J].Hypertension,1998,32(1):3-8.
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[收稿：2000-04-16], 百拇医药