风湿性心脏病及先天性心脏病心包组织病理改变及胶原含量的变化
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作者：宋智钢 徐志云 张宝仁 朱家麟 郝家骅 刘延玲
单位：宋智钢(第二军医大学附属长海医院胸心外科 上海，200433；现在西安市第四军医大学附属西京医院心血管外科)；徐志云 张宝仁 朱家麟 郝家骅 刘延玲(第二军医大学附属长海医院胸心外科 上海，200433)
关键词：风湿性心脏病；先天性心脏病；自体心包；心脏瓣膜，人工生物瓣；胶原
临床心血管病杂志000804 摘要 目的：探讨利用先天性心脏病(CHD)及风湿性心脏病(RHD)患者心包组织制作自体心包生物瓣膜的可行性。方法：采用苏木精-伊红、Van Gieson染色，透射电镜技术，原子吸收光谱测定，组织羟脯氨酸测定及蛋白电泳技术分别观察10例 CHD患者和10例慢性RHD患者心包组织病理，钙、胶原含量及Ⅰ、Ⅲ型胶原比值的变化，并与5例正常人尸检的心包组织比较。结果：CHD、RHD患者心包组织存在轻度纤维化，但组织结构基本正常；胶原含量分别为(167.89±17.44)mg/g和(163.65±19.35)mg/g，高于正常对照组(P<0.05)，而胶原Ⅰ/Ⅲ型比值低于正常对照组，组织钙含量与正常对照组无显著性差异。结论：CHD和RHD患者心包组织结构基本正常，无钙质沉积，可用于制作自体心包瓣膜。
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Alteration of tissue structure and collagen contents in pericardial tissue of patients with rheumatic heart disease and congenital heart disease
SONG Zhi-gang，XU Zhi-yun，ZHANG Bao-ren，ZHU Jia-lin，HAO Jia-hua，LIU Yan-ling
(Institute of Thoracic and Cardiovascular Surgery,Changhai Hospital,Second Military Medical University,PLA,Shanghai 200433)
Abstract Objective:To investigate the feasible of making autologous pericardial heart valves by autologous pericardium of patients with congenital heart disease (CHD) and rheumatic heart disease (RHD).Method:The changes of tissue structure,Ca2+,collagen contents and collagen type Ⅰ/Ⅲ ratio on pericardium of patients with CHD (n=10) and RHD (n=10) were study respectively by means of HE and VG staining,transmission electron microscope,histochemical and biochemical methods and compared with those of 5 normal autopsy cases.Result:Although the pericardial tissue of patients with CHD or RHD showed fibrosis slightly,tissue of structure was normal.The collagen contents of pericardium of patients with CHD and RHD increased slightly,but collagen type Ⅰ/Ⅲ ratio decreased and the contents of calcium of those had no significant different with that of normal people.Conclusion:The structure of pericardium of patients with CHD and RHD is normal on the whole,no calcium depositing.These pericardium can be used for making autologous pericardial heart valves.
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Key words Rheumatic heart disease Congenital heart disease Autologous pericardium Heart valve prostaesis Bioprosthesis Collagen
近年来国外利用患者自身心包制作自体心包瓣(APHV)在瓣膜领域中的应用逐年增多，而国内才刚刚起步〔1，2〕。我国属风湿性心脏病(RHD)高发区，有关RHD患者心包组织的研究未见报道。研究慢性RHD心包组织的病理及生化改变，明确利用患者自身心包组织制作APHV的可行性，是APHV能在国内推广应用的前提条件。
1 对象与方法
1.1 对象
先天性心脏病(CHD)组：CHD或瓣膜病变除外曾有风湿活动者10例，男女各5例，年龄16～40岁，心胸比>50%；RHD组：慢性RHD单瓣或双瓣病变，其病史超过10年者10例，男女各5例，年龄25～50岁，心胸比>55%。CHD组和RHD组于术中取心前区心包组织(无心包粘连)，去除心包外脂肪和疏松结缔组织，-70℃保存备用。正常对照组：尸检中除外心血管疾病者5例，均为男性，年龄18～30岁，脑死亡后4h内取材。病理检查标本立即固定。1.2 方法
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1.2.1 组织病理学观察：心包取材后立即用中性甲醛或2.5%戊二醛固定，分别进行组织病理和超微结构观察。苏木精-伊红、Van Gieson染色和透射电镜按常规进行，免疫组化染色运用标准DAKO EnVisionTM两步法，用兔抗人Ⅰ、Ⅲ型胶原多克隆抗体(Sigma公司)，并设空白对照和替代对照。
1.2.2 心包组织胶原含量的测定：应用组织羟脯氨酸含量测定法，以羟脯氨酸标准液做标准曲线，得出样品中羟脯氨酸的量，乘以7.46即为胶原的含量〔3〕。
1.2.3 心包组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原比值的测定：用胃蛋白酶消化法提取心包组织胶原，行间断SDS-PAGE电泳分离胶原α2(Ⅰ)、α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)、β、链，用双波长密度扫描仪在530 nm扫描，得出α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)条带积分面积，以Chan〔4〕公式计算Ⅰ/Ⅲ型胶原比值。
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1.2.4 心包组织Ca2+含量的测定：用高氯酸硝酸混合液消化烘干定量的心包组织，去离子水、镧溶液稀释，原子吸收光谱仪测定溶液的光密度，所测得的光密度根据标准液对比求出组织Ca2+含量。
1.3 统计学处理
数值以±s表示，组间比较用F检验。
2 结果
2.1 组织病理学
正常人心包组织由浆膜层、纤维层和心包外结缔组织层构成，胶原纤维束以不同方向排列，呈波浪状，并可见少量的毛细血管及弹力纤维；免疫组化染色示胶原以Ⅰ型为主。CHD及RHD心包组织较正常人的略增厚，胶原纤维及弹力纤维较正常人增多，但三层结构清晰，胶原束排列正常，与正常人无明显差别；部分RHD患者心包组织中可见毛细血管增多及血管周围有少量的炎性细胞浸润；免疫组化染色显示CHD、RHD患者心包组织的Ⅰ、Ⅲ型胶原均增加，以Ⅲ型胶原增加显著。
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2.2 透射电镜
CHD、RHD患者心包组织胶原纤维较正常人的致密，胶原纤维排列整齐，具有明暗相间的条纹，无溶解及断裂现象；成纤维细胞较正常人的略增多，但细胞结构完整，胞浆丰富，细胞核膜光滑延续，核内常染色质、异染色质定位良好，细胞器清晰可见，线粒体无肿胀，无变形；细胞间质内未发现有钙质沉积。
2.3 胶原、组织Ca2+含量及胶原Ⅰ/Ⅲ型比值的变化
各组心包组织胶原制品经间断SDS-PAGE电泳显示的条带与Ⅰ、Ⅲ型胶原混合物对照品电泳条带相符，各条带清晰，表明所提取的蛋白属胶原蛋白无疑。3组心包组织胶原、I/III型比值及Ca2+含量见表1。
表1 3组心包组织胶原含量、Ⅰ/Ⅲ型比值及
组织Ca2+含量比较±s 组别
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例数
胶原/
(mg.g-1)
胶原Ⅰ/Ⅲ
型比值
组织Ca2+/
(mg.g-1)
CHD组
10
167.89±17.441)
6.04±2.231)
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0.36±0.13
RHD组
10
163.65±19.351)
5.57±1.951)
0.39±0.11
对照组
5
144.69±9.56
9.27±3.06
0.35±0.09
, 百拇医药 与对照组比较1)P<0.053 讨论
生物瓣材料的选择应符合材料易得、易加工成型、无组织抗原性、组织结构正常并与人体瓣膜的组织结构基本相似。心包组织是制作生物瓣的常用生物材料，其与正常主动脉瓣叶相比即有相似之处又有不同之点〔5〕。
大量临床资料已表明〔6〕，在我国单纯主动脉瓣病变的病因中，RHD仍居首位，远较西方国家多见。因此，欲使自体心包瓣能在我国推广应用，首先需对慢性RHD心包组织进行研究，评价其病变程度，以确定利用RHD患者自身心包组织制作自体心包瓣的可行性。而目前有关RHD心包组织的研究尚未见报道。
本研究结果显示，慢性RHD心包组织存在轻度纤维化，部分病例可见轻度血管增生，血管周围有少量炎性细胞浸润，提示曾经历过炎性改变；但心包组织结构基本完整，无纤维断裂和溶解，透射电镜亦显示胶原纤维排列整齐，成纤维细胞结构正常，细胞器结构完整无变性，而且心包组织Ca2+与正常相比无显著性差异。以上结果均表明，慢性RHD非活动期患者心包组织的病理改变与RHD瓣膜相比，变化甚微，并且胶原比值的变化亦不同于RHD瓣膜，而与肥大心肌或CHD心包组织的变化相似，提示慢性RHD心包组织纤维化可能由于心脏扩大导致的心包张力增加所致〔7，8〕。
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Escalante〔9〕研究认为，虽然约有1/3 RHD患者发生过不同程度的风湿性心包炎，但风湿后期心包组织有严重损害的仅占RHD患者的1.25%。结合本研究结果，我们认为就大部分RHD患者而言，炎症期过后心包组织仍可保持较为正常的组织结构。CHD、RHD患者自身心包组织可作为制作APHV的生物材料。
上海市卫生系统百人计划资助项目 No.97BR045
宋智钢：导师
张宝仁：研究生
参考文献
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2，徐志云，张宝仁，朱家麟，等.自体心包瓣叶替换主动脉瓣.第二军医大学学报，1997，18(增)：6～6
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4，Chan D.Quantitation of the type Ⅰ and Ⅲ collagens by SDS-PAGE.J Biochem,1979,86:453～460
5，Mitchell R N,Jonas R A,Schoen F J.Structure-function correlation in cryopreserved allograft cardiac valves.Ann Thorac Surg,1995,60:S108～117
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9，Escalante A.Cardiac compression in rheumatoid pericarditis.Semin Arthritis Rhem,1990,20:148～160
(收稿 1999-11-07), http://www.100md.com