PTEN基因与脑胶质瘤
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国外医学遗传学分册 2000年第23卷第3期
PTEN基因与脑胶质瘤
李志强(综述) 袁先厚(审校)
摘 要 PTEN基因是肿瘤抑制基因家庭的新成员。它具有蛋白质酪氨酸磷酸酶催化区域，并与张力蛋白、辅助蛋白同源。在高级别胶质瘤中PTEN基因发生突变而失活，但经复制缺陷型腺病毒转染野生型PTEN基因的瘤细胞增殖可受到抑制。
关键词：PTEN基因 肿瘤抑制基因 胶质瘤
肿瘤抑制基因PTEN的发现是人类探讨肿瘤生物学行为分子基础的又一成果。本文就其结构、功能，以及与胶质瘤的关系作一综述。
1 PTEN基因和蛋白
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1.1 PTEN基因的发现和染色体定位
10q23染色体的杂合性丢失(LOH)在人类多种肿瘤晚期的高发频率，暗示着它可能编码肿瘤抑制基因。1997年，Li等[1]用代表性差别分析法(representational difference analysis,RDA)，在浸润性乳腺癌的两个移植瘤中发现了10q23染色体特定区域的纯合性缺失，并通过外显子俘获分析法(exon trap analysis)分离出一种新的基因，对其开放阅读框架(ORF)序列分析揭示了它可能编码蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)，且与张力蛋白，辅助蛋白有大片同源区，因此将其命名为PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10)。同时，由于10q23LOH在胶质母细胞瘤中的频率为70%左右，Steck[2]等对此现象研究时，亦从其细胞系中克隆得到亚定位于10q23.3，于多种进展期癌中突变的基因，称之为MMAC1(mutated in multiple advanced cancer 1)。之后不久，在搜索PTPs家族新成员过程中又获得一受TGF-β调节、上皮细胞富含的磷酸酶基因TEP1，(TGF-βregulated and epithelial cell-enriched phosphatase)[3]。在比较三者cDNA及编码的蛋白后将其归为同一基因[3]，随后文献中多以PTEN或PTEN/MMAC1的形式出现。
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1.2 PTEN基因的结构
该基因具有9个外显子[2]，其cDNA序列内ORF由1209个核苷酸组成，编码分子量在47000Dalt左右，由403个氨基酸构成的蛋白质，启动子位于第805位编码蛋氨酸的核苷酸其上游与Kozak序列一致[3]。
该基因cDNA全长内尚有许多令人感兴趣的特点[3]：它具有少见的长5’-未翻译区，说明其表达可能属释放水平的调节；在未翻译区出现了CGG重复的多岛结构，而CpG岛可能受DNA甲基化调节，并且包括p16INK4A在内的许多基因，因肿瘤特异性的CpG甲基化所诱导的转录终止已被报道。
1.3 PTEN蛋白的表达及功能
应用免疫荧光显微镜观察发现该蛋白定位于胞浆[3，4]。正常人体多种组织中可检测出其mRNA表达，且在脑、心、肺、肾、胎盘、肝等组织中水平较高[2]。在Hela等DNA肿瘤病毒转化的细胞和Saos2等p53和Rb抑癌基因失活的细胞系中，TEP1基因的mRNA表达水平下降，而对TGF-β敏感的人类角化细胞和Haca T细胞系中其表达相对丰富，但细胞经TGF-β处理后其表达迅速下调[3]。这提示TEP1基因可能是TGF-β的新靶点，且其转录水平降低与p53和Rb蛋白失活有关。
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对PTEN蛋白结构的分析表明，它具有PTPs家族成员中构成磷酸酶催化区活性位点的保守元件：(I/V)-H-C-X-A-G-X-X-R-(S/T)-G[1]，并在其附近发现了与BVP、VHR、MAPKs、CDC14等双重特异性磷酸酶的同源区[3]。进一步用重组PTEN验证了其双重特异性磷酸酶活性，并具有底物的高度特异性，体外底物的酸性特征对其识别具有决定作用[5]。
由于细胞内蛋白质酪氨酸磷酸化水平受PTP和PTK的调节，PTP在信号转导、细胞周期进程、细胞间转化中具有双向调节作用[3]，且促进生长的PTK被原癌基因编码，据此推测能编码与PTK相拮抗的PTP的PTEN基因是一种肿瘤抑制基因，在抑制肿瘤生长中具有一定作用[1，3，4]。而张力蛋白与肌动蛋白丝的结合，使其与细胞粘附相联；辅助蛋白则与突触小泡运输功能有关；同时PTP对细胞之间、细胞与胞外基质间的作用亦具有重要意义，因此PTEN蛋白可能影响瘤细胞浸润和转移过程[3，4]。
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2 胶质瘤中PTEN基因改变及其意义
肿瘤抑制基因常因一个等位基因位点发生基因内改变(核苷酸替换、小插入或微缺失)，另一位点大片染色体丢失而导致双等位基因失活。胶质瘤中PTEN基因改变亦是如此[6]。其核苷酸替换多为C：G→T：A的转换，从而引起错义或无义突变，而碱基的缺失或插入引起移码突变，导致剪切位点或氨基酸组成改变[1，4，7，8]。除此之外，亦有报道在PTEN基因区发生纯合性缺失[7，9，10]，或半合子缺失[6]。
PTEN基因突变在9个外显子及部分内含子中均有发生，无明显热点，但外显子3，4，外显子6的5’端，外显子8的3’端为簇集区域[10]。其中外显子5的突变常导致磷酸酶活性丧失，从而影响其抑制肿瘤生长的功能[5，7]。但该区并非突变的特异靶点[10]。外显子3区点突变CAT183→CGT183使组氨酸变为精氨酸(H61R)亦被认为是功能性的，因为该氨基酸是张力蛋白、辅助蛋白保守位点[6]，而外显子7内R233×突变不仅在胶质瘤中多次发生，在其它疾病中亦有报道，说明精氨酸Arg233可能是突变发生的高危区[10]。
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关于PTEN基因突变的频率，各家报道不一，Li[1]等最早报道了在胶质母细胞瘤系中PTEN突变率为63%(5/8)，移植瘤为24%(8/34)，原发性胶质母细胞廇为17%(3/18)。随后，Wang[3]等从34例胶质母细胞瘤患者外周血和瘤组织中提取DNA并测序，在外周血抽提的DNA中未发现PTEN突变，但瘤组织中DNA扩增显示了11例突变，并用PTEN基因内及其附近多态性标记物检测出另4例纯合性缺失，总突变率为44%(15/34)。这些结果提示PTEN基因可能是胶质母细胞瘤染色体10q失活的主要靶基因，并且其突变属体细胞型。
为探讨PTEN基因在胶质瘤进展、复发中的作用，Hulsebos[11]发现32%(7/22)复发病例有PTEN基因的LOH，而Tohma[9]等将胶质母细胞廇分为原发性和继发性(从Ⅱ、Ⅲ级演变为Ⅳ级)的研究更耐人寻味：原发性胶质母细胞瘤中仅为4%(1/25)，并且此突变在其尚未演化为Ⅳ级时的间变型(Ⅲ级)星形细胞瘤中业已存在。这说明原发性，继发性胶质母细胞瘤进展的基因水平各异。
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进一步用SSCP和DNA测序分析PTEN突变与胶质瘤的发病年龄和组织学类型的关系，结果其突变在成人胶质母细胞瘤中为13/42，成人间变型星形细胞胶质瘤为3/13，而在21例低级别成人胶质瘤和22例儿童各级别胶质瘤中无突变发生[8]。该趋势表明PTEN突变多发生在高龄、高级别胶质瘤患者中。但也有学者认为该指标与年龄和生存期无关，无预后意义[10]。
3 PTEN基因与胶质瘤的生长抑制
对可疑的肿瘤抑制基因进行鉴定时，除对其突变频率进行描述外，关键还须演示它对分离的瘤细胞致瘤性的拮抗作用。为此Furnari[4]等联合应用Northern杂交、序列分析及蛋白截断试验(protein truncation test,PTT)对18个胶质瘤细胞系中PTEN突变频率和类型进行分析后，确定出三型受体细胞；在不同位点发生PTEN突变的U87和U178细胞系，以及表达野生型PTEN的LN229细胞系。在构建5种不同质粒后，通过转基因技术对PTEN基因的生长抑制功能进行评估，结果在转染野生型PTEN质粒后U87、U178细胞数目减少60%～70%，而LN229细胞则无类似减少。转染三种突变型PTEN质粒削弱了其生长抑制功能。这说明外源性野生型PTEN的表达在内源性PTEN突变时发挥了生长抑制作用。在该实验基础上，进一步构建复制缺陷型腺病毒并将MMAC1转导入U87MG细胞系，导致了剂量-依赖型外源性MMAC1蛋白的表达。与对照组相比，U87MG细胞系增殖被抑制。再将转导的培养细胞植入裸鼠体内，结果其致瘤性几乎完全丧失[12]。该现象亦支持野生型PTEN在体内对胶质瘤生长的抑制作用。
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4 结语
PTEN基因的发现为我们更好地理解染色体10q改变与胶质瘤的关系提供了新的线索，但目前仍有许多问题亟待解决：①PTEN的生理学底物尚不可知；②PTEN突变位点及类型与蛋白稳定性的降低、与磷酸酶失活或保留磷酸酶活性但底物识别缺陷等关系亦未阐明；③PTEN基因是否存在CpG岛甲基化所诱导的转录终止；④染色体10q上胶质瘤发生的原始靶标是10q23还是10q25-q26亦有争论[6，13]。上述疑问的阐释都将有助于在分子水平明了胶质瘤发生及进展的过程，并为基因治疗打下坚实的理论基础。
作者简介：李志强，男，1975年生，博士研究生
作者单位：湖北医科大学附属第二医院神经外科，湖北 武汉430071
参考文献
, 百拇医药
[1] Li J et al.Science,1997,275:1943-1947.
[2] Steck PA et al.Nat Genet,1997,15:356-363.
[3] Li DM et al.Cancer Res ,1997,57:2124-2129.
[4] Furnari FB et al.Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:12479-12484.
[5] Myers MP et al.Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:9052-9057.
[6] Maier D et al.Oncogene,1998,16(24):3331-3335.
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[7] Wang SI et al.Cancer Res,1997,57:4183-4186.
[8] Ahmed Rasheed BK et al.Cancer Res,1997,57:4187-4190.
[9] Johma Y et al.J Neuropathol Exp Neurol,1998,57(7):684-689.
[10] Duerr EM et al.Oncogene,1998,16(17):2259-2264.
[11] Hulsebos TJ et al.Genes Chromosomes Cancer,1998,23(2):153-158.
[12] Cheney IW et al.Cancer Res ,1998,58:2331-2334.
[13] Chiariello E et al.Oncogene,1998,16(4):541-545., 百拇医药
李志强(综述) 袁先厚(审校)
摘 要 PTEN基因是肿瘤抑制基因家庭的新成员。它具有蛋白质酪氨酸磷酸酶催化区域，并与张力蛋白、辅助蛋白同源。在高级别胶质瘤中PTEN基因发生突变而失活，但经复制缺陷型腺病毒转染野生型PTEN基因的瘤细胞增殖可受到抑制。
关键词：PTEN基因 肿瘤抑制基因 胶质瘤
肿瘤抑制基因PTEN的发现是人类探讨肿瘤生物学行为分子基础的又一成果。本文就其结构、功能，以及与胶质瘤的关系作一综述。
1 PTEN基因和蛋白
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1.1 PTEN基因的发现和染色体定位
10q23染色体的杂合性丢失(LOH)在人类多种肿瘤晚期的高发频率，暗示着它可能编码肿瘤抑制基因。1997年，Li等[1]用代表性差别分析法(representational difference analysis,RDA)，在浸润性乳腺癌的两个移植瘤中发现了10q23染色体特定区域的纯合性缺失，并通过外显子俘获分析法(exon trap analysis)分离出一种新的基因，对其开放阅读框架(ORF)序列分析揭示了它可能编码蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)，且与张力蛋白，辅助蛋白有大片同源区，因此将其命名为PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10)。同时，由于10q23LOH在胶质母细胞瘤中的频率为70%左右，Steck[2]等对此现象研究时，亦从其细胞系中克隆得到亚定位于10q23.3，于多种进展期癌中突变的基因，称之为MMAC1(mutated in multiple advanced cancer 1)。之后不久，在搜索PTPs家族新成员过程中又获得一受TGF-β调节、上皮细胞富含的磷酸酶基因TEP1，(TGF-βregulated and epithelial cell-enriched phosphatase)[3]。在比较三者cDNA及编码的蛋白后将其归为同一基因[3]，随后文献中多以PTEN或PTEN/MMAC1的形式出现。
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1.2 PTEN基因的结构
该基因具有9个外显子[2]，其cDNA序列内ORF由1209个核苷酸组成，编码分子量在47000Dalt左右，由403个氨基酸构成的蛋白质，启动子位于第805位编码蛋氨酸的核苷酸其上游与Kozak序列一致[3]。
该基因cDNA全长内尚有许多令人感兴趣的特点[3]：它具有少见的长5’-未翻译区，说明其表达可能属释放水平的调节；在未翻译区出现了CGG重复的多岛结构，而CpG岛可能受DNA甲基化调节，并且包括p16INK4A在内的许多基因，因肿瘤特异性的CpG甲基化所诱导的转录终止已被报道。
1.3 PTEN蛋白的表达及功能
应用免疫荧光显微镜观察发现该蛋白定位于胞浆[3，4]。正常人体多种组织中可检测出其mRNA表达，且在脑、心、肺、肾、胎盘、肝等组织中水平较高[2]。在Hela等DNA肿瘤病毒转化的细胞和Saos2等p53和Rb抑癌基因失活的细胞系中，TEP1基因的mRNA表达水平下降，而对TGF-β敏感的人类角化细胞和Haca T细胞系中其表达相对丰富，但细胞经TGF-β处理后其表达迅速下调[3]。这提示TEP1基因可能是TGF-β的新靶点，且其转录水平降低与p53和Rb蛋白失活有关。
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对PTEN蛋白结构的分析表明，它具有PTPs家族成员中构成磷酸酶催化区活性位点的保守元件：(I/V)-H-C-X-A-G-X-X-R-(S/T)-G[1]，并在其附近发现了与BVP、VHR、MAPKs、CDC14等双重特异性磷酸酶的同源区[3]。进一步用重组PTEN验证了其双重特异性磷酸酶活性，并具有底物的高度特异性，体外底物的酸性特征对其识别具有决定作用[5]。
由于细胞内蛋白质酪氨酸磷酸化水平受PTP和PTK的调节，PTP在信号转导、细胞周期进程、细胞间转化中具有双向调节作用[3]，且促进生长的PTK被原癌基因编码，据此推测能编码与PTK相拮抗的PTP的PTEN基因是一种肿瘤抑制基因，在抑制肿瘤生长中具有一定作用[1，3，4]。而张力蛋白与肌动蛋白丝的结合，使其与细胞粘附相联；辅助蛋白则与突触小泡运输功能有关；同时PTP对细胞之间、细胞与胞外基质间的作用亦具有重要意义，因此PTEN蛋白可能影响瘤细胞浸润和转移过程[3，4]。
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2 胶质瘤中PTEN基因改变及其意义
肿瘤抑制基因常因一个等位基因位点发生基因内改变(核苷酸替换、小插入或微缺失)，另一位点大片染色体丢失而导致双等位基因失活。胶质瘤中PTEN基因改变亦是如此[6]。其核苷酸替换多为C：G→T：A的转换，从而引起错义或无义突变，而碱基的缺失或插入引起移码突变，导致剪切位点或氨基酸组成改变[1，4，7，8]。除此之外，亦有报道在PTEN基因区发生纯合性缺失[7，9，10]，或半合子缺失[6]。
PTEN基因突变在9个外显子及部分内含子中均有发生，无明显热点，但外显子3，4，外显子6的5’端，外显子8的3’端为簇集区域[10]。其中外显子5的突变常导致磷酸酶活性丧失，从而影响其抑制肿瘤生长的功能[5，7]。但该区并非突变的特异靶点[10]。外显子3区点突变CAT183→CGT183使组氨酸变为精氨酸(H61R)亦被认为是功能性的，因为该氨基酸是张力蛋白、辅助蛋白保守位点[6]，而外显子7内R233×突变不仅在胶质瘤中多次发生，在其它疾病中亦有报道，说明精氨酸Arg233可能是突变发生的高危区[10]。
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关于PTEN基因突变的频率，各家报道不一，Li[1]等最早报道了在胶质母细胞瘤系中PTEN突变率为63%(5/8)，移植瘤为24%(8/34)，原发性胶质母细胞廇为17%(3/18)。随后，Wang[3]等从34例胶质母细胞瘤患者外周血和瘤组织中提取DNA并测序，在外周血抽提的DNA中未发现PTEN突变，但瘤组织中DNA扩增显示了11例突变，并用PTEN基因内及其附近多态性标记物检测出另4例纯合性缺失，总突变率为44%(15/34)。这些结果提示PTEN基因可能是胶质母细胞瘤染色体10q失活的主要靶基因，并且其突变属体细胞型。
为探讨PTEN基因在胶质瘤进展、复发中的作用，Hulsebos[11]发现32%(7/22)复发病例有PTEN基因的LOH，而Tohma[9]等将胶质母细胞廇分为原发性和继发性(从Ⅱ、Ⅲ级演变为Ⅳ级)的研究更耐人寻味：原发性胶质母细胞瘤中仅为4%(1/25)，并且此突变在其尚未演化为Ⅳ级时的间变型(Ⅲ级)星形细胞瘤中业已存在。这说明原发性，继发性胶质母细胞瘤进展的基因水平各异。
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进一步用SSCP和DNA测序分析PTEN突变与胶质瘤的发病年龄和组织学类型的关系，结果其突变在成人胶质母细胞瘤中为13/42，成人间变型星形细胞胶质瘤为3/13，而在21例低级别成人胶质瘤和22例儿童各级别胶质瘤中无突变发生[8]。该趋势表明PTEN突变多发生在高龄、高级别胶质瘤患者中。但也有学者认为该指标与年龄和生存期无关，无预后意义[10]。
3 PTEN基因与胶质瘤的生长抑制
对可疑的肿瘤抑制基因进行鉴定时，除对其突变频率进行描述外，关键还须演示它对分离的瘤细胞致瘤性的拮抗作用。为此Furnari[4]等联合应用Northern杂交、序列分析及蛋白截断试验(protein truncation test,PTT)对18个胶质瘤细胞系中PTEN突变频率和类型进行分析后，确定出三型受体细胞；在不同位点发生PTEN突变的U87和U178细胞系，以及表达野生型PTEN的LN229细胞系。在构建5种不同质粒后，通过转基因技术对PTEN基因的生长抑制功能进行评估，结果在转染野生型PTEN质粒后U87、U178细胞数目减少60%～70%，而LN229细胞则无类似减少。转染三种突变型PTEN质粒削弱了其生长抑制功能。这说明外源性野生型PTEN的表达在内源性PTEN突变时发挥了生长抑制作用。在该实验基础上，进一步构建复制缺陷型腺病毒并将MMAC1转导入U87MG细胞系，导致了剂量-依赖型外源性MMAC1蛋白的表达。与对照组相比，U87MG细胞系增殖被抑制。再将转导的培养细胞植入裸鼠体内，结果其致瘤性几乎完全丧失[12]。该现象亦支持野生型PTEN在体内对胶质瘤生长的抑制作用。
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4 结语
PTEN基因的发现为我们更好地理解染色体10q改变与胶质瘤的关系提供了新的线索，但目前仍有许多问题亟待解决：①PTEN的生理学底物尚不可知；②PTEN突变位点及类型与蛋白稳定性的降低、与磷酸酶失活或保留磷酸酶活性但底物识别缺陷等关系亦未阐明；③PTEN基因是否存在CpG岛甲基化所诱导的转录终止；④染色体10q上胶质瘤发生的原始靶标是10q23还是10q25-q26亦有争论[6，13]。上述疑问的阐释都将有助于在分子水平明了胶质瘤发生及进展的过程，并为基因治疗打下坚实的理论基础。
作者简介：李志强，男，1975年生，博士研究生
作者单位：湖北医科大学附属第二医院神经外科，湖北 武汉430071
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[1] Li J et al.Science,1997,275:1943-1947.
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[4] Furnari FB et al.Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:12479-12484.
[5] Myers MP et al.Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:9052-9057.
[6] Maier D et al.Oncogene,1998,16(24):3331-3335.
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[7] Wang SI et al.Cancer Res,1997,57:4183-4186.
[8] Ahmed Rasheed BK et al.Cancer Res,1997,57:4187-4190.
[9] Johma Y et al.J Neuropathol Exp Neurol,1998,57(7):684-689.
[10] Duerr EM et al.Oncogene,1998,16(17):2259-2264.
[11] Hulsebos TJ et al.Genes Chromosomes Cancer,1998,23(2):153-158.
[12] Cheney IW et al.Cancer Res ,1998,58:2331-2334.
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