阳离子脂质体对重组腺病毒转染效率的影响
徐彤 殷慧君 唐佩弦
摘 要 目的 观察不同因素对重组腺病毒转染效率的影响。方法 以重组腺病毒去感染小鼠T淋巴瘤细胞株EL-4，加入不同的刺激因子和lipofectamine，通过计数X-gal染色阳性细胞数测定转染效率。结果 rmIL-2，植物血凝素均不能改善重组腺病毒对EL-4的感染效率，而阳离子脂质体可以明显提高重组腺病毒对EL-4的感染效率。结论 可以利用阳离子脂质体来提高重组腺病毒的转染效率。
关键词：阳离子脂质体 重组腺病毒 转染效率
将外源基因导入细胞内的方式有多种，腺病毒既可以感染分裂期细胞也可感染非分裂期细胞，病毒颗粒比较稳定，可以纯化和浓缩，不整合，安全性高，因此近来受到广泛关注，以其作载体将不同的外源基因导入真核细胞的研究纷纷开展，尤其是利用重组腺病毒将细胞因子导入实体瘤细胞，激活机体抗肿瘤免疫的研究。关于重组腺病毒转染血液系统肿瘤的报道很少，因此我们用重组腺病毒AdCMVLacZ感染小鼠淋巴瘤细胞EL-4，测定不同因素对重组腺病毒感染效率的影响，以期找到提高腺病毒感染效率的有效途径。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂 重组腺病毒AdCMVLacZ、AdCMVIL-12粗提液(西班牙Navarra大学Dr Cheng Qian惠赠)。氯化铯(Boehringer公司)。阳离子脂质体lipofectamine(Gibco公司产品)。X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷，Sigma公司产品)。mIL-12的ELISA检测试剂盒购自Endogen公司。植物血凝素(PHA，广州医学工程研究所产品)。rmIL-2纯品由军事医学科学院惠赠。
1.2 细胞株 EL-4细胞是化学致癌剂在C57BL/6(H-2b)小鼠诱导T淋巴瘤细胞株(由北京医科大学免疫系提供)。复制缺陷型重组腺病毒载体包装细胞株293(人胚肾细胞株)由军事医学科学院吴祖泽院士惠赠。Hela为人宫颈癌细胞株，CHO细胞株为中国仓鼠卵巢细胞。
1.3 腺病毒的扩增、收集及纯化
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1.3.1 293细胞用完全DMEM 含体积分数为10%新生牛血清，1×105 U.L-1青霉素、100 mg.L-1链霉素，37℃、0.05 CO2、饱和湿度培养。待细胞长至培养瓶底的70%～80%时培养基更换为含体积分数为2.5%新生牛血清的DMEM，加入重组腺病毒粗提液，继续培养观察48～72 h，收集呈病态反应(cytopathic effect,CPE)的293细胞，反复冻融5次，每次冻融后振摇30 s，1 500 rpm离心20 min，弃细胞碎片，收集上清，经氯化铯密度梯度两次离心浓缩腺病毒颗粒[1]，经Hanks液透析后，加入体积分数为20%甘油，分装后于-70℃冻存备用。
1.3.2 重组腺病毒滴度的测定 病毒滴度采用噬斑分析法结合细胞病变测定法[2]。
1.3.3 重组腺病毒感染EL-4细胞的测定 AdCMVLacZ以MOI(multiplicity of infection)5，50，500，5 000分别感染EL-4细胞，4 h后用RPMI 1640洗涤去除游离病毒，于37℃、0.05 CO2培养24 h，体积分数为2.5%戊二醛固定15 min，再以含10 mmol.L-1 MgCl2的PBS洗2遍，X-gal染色48 h后计数蓝染细胞。
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1.4 重组腺病毒对不同细胞株感染效率的测定 AdCMVLacZ以MOI 50分别感染HeLa,CHO细胞株，测定转染效率。
1.5 不同刺激分子对重组腺病毒感染EL-4效率的影响 EL-4细胞分别以rmIL-2，PHA或rmIL-2+PHA刺激72 h，rmIL-2的终浓度为20 kU.L-1，PHA的终浓度为5 mg.L-1，刺激后以AdCMVLacZ感染，测定转染效率。
1.6 阳离子脂质体(lipofectamine)对重组腺病毒感染EL-4效率的影响 50 μl纯化的腺病毒加入50 μl无抗生素RPMI 1640，在此100 μl体系内加入1 μl的lipofectamine(终浓度为1 mg.L-1)室温静置30 min。100 μl浓度为2×1010 cells.L-1的EL-4细胞与该体系共同孵育105 min(MOI为50)，以RPMI 1640洗涤2次去除游离病毒，用完全RPMI 1640培养24 h，固定，X-gal染色48 h观察结果。
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1.7 AdCMVIL-12感染EL-4细胞培养上清中IL-12含量的测定 AdCMVIL-12分别在有无lipofectamine的情况下感染EL-4细胞，收集感染48 h的培养上清，ELISA测定mIL-12的含量，结果以450 nm OD值在标准曲线上对应值表示。
1.8 统计学处理 采用未配对计量资料的t检验。
2 结果
2.1 重组腺病毒对EL-4细胞感染效率的观察 重组腺病毒颗粒经扩增浓缩纯化后AdCMVLacZ和AdCMVIL-12的滴度分别为2.1×1013 pfu.L-1及4.5×1012 pfu.L-1(plaque forming unit，空斑形成单位)。AdCMVLacZ的MOI值为5时，感染EL-4后X-gal染色阳性细胞率达4.6%±2.97%，MOI为50时，感染阳性率达12.3%±2.51%，MOI达500时，X-gal染色阳性细胞率为20.3%±4.73%，以后随着MOI的升高，细胞感染阳性细胞率没有明显提高，见图1。
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Fig 1 The efficacy of recombinant adenovirus at different MOI
2.2 重组腺病毒对不同细胞株感染效率的影响 当AdCMVLacZ的MOI值为50时，HeLa和CHO感染的阳性细胞率均高于90%，而EL-4的感染率仅为12.3%±2.51%，提示HeLa和CHO是腺病毒的易感细胞，而EL-4不易被腺病毒感染。
2.3 不同因素对重组腺病毒感染EL-4效率的影响 培养的EL-4细胞分别以rmIL-2、PHA、rmIL-2+PHA刺激后，AdCMVLacZ的感染率分别为20%±4.4%、23.7%±3.1%、22.0%±2.7%，而EL-4细胞用lipofectamine协同感染后，在MOI=50时，AdCMVLacZ的感染率就可上升到37.0%±4.0%，见图2。由图可见，EL-4细胞经rmIL-2，PHA，rmIL-2+PHA刺激，重组腺病毒对其的感染率没有明显的增加。而与未经刺激的AdCMVLacZ感染的EL-4组相比，lipofectamine可以明显提高重组腺病毒的感染效率(P<0.01)。
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Fig 2 The influence of different factors on the
efficacy of recombinant adenovirus
A：rmIL-2;B:PHA;C:rmIL-2+PHA;D:control;E:lipofectamine(MOI=50)
2.4 AdCMVIL-12感染EL-4细胞mlL-12的测定 AdCMVIL-12以MOI 500感染EL-4细胞，ELISA检测感染48 h的培养上清中mIL-12的含量达(37±6.4) μg.L-1；在lipofectamine的协助下，MOI为50时，感染48 h的培养上清中mIL-12含量可以上升到(84.6±9.5) μg.L-1，明显高于未加lipofectamine者(P<0.01)。
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3 讨论
基因治疗的关键是基因转移，即将目的基因导至靶细胞内。基因转移有物理方法，化学方法和生物方法。物理方法包括电穿孔、显微注射；化学方法包括磷酸钙沉淀、脂质体及DEAE-葡聚糖等方法；生物方法主要指的是病毒介导基因转移，包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘病毒等。物理和化学方法转染效率低但相对安全，病毒转染效率高但有潜在危险性。腺病毒作为基因转染的载体之一，具有病毒颗粒比较稳定，可以纯化和浓缩、可感染非分裂细胞、无随机插入的危险性，宿主范围广的特点[3]，因而近来受到广泛关注。但腺病毒并非对所有细胞的感染效率均令人满意，有学者[4]用AdRSV β-gal感染13种不同的血液系统肿瘤的细胞株及27例血液病患者血细胞，发现K 562和PRMI 8226感染效率分别为65%和64%，MT达38%，其余的细胞株感染效率均不足20%，甚至为零，AML(急性粒细胞白血病)、CLL(慢性淋巴细胞白血病)、NHL(非何杰金淋巴病)、MDS(骨髓增生异常综合症)患者新鲜血细胞转染效率也几乎为零。腺病毒要进入细胞，需先和细胞表面的受体结合，继而在αv整合素介导下被细胞内吞[5，6]。腺病毒对一些特定细胞的感染受到限制，可能就是由于这些细胞表面缺乏受体和整合素。Cantwell等[7]比较了腺病毒感染CLL和HeLa的效率，发现腺病毒对CLL的转染效率在MOI(1～10 000)时均低于对HeLa的转染效率100～1 000倍，抗CD 40单抗刺激CLL，可以诱导CLL表面表达αvβ3和αvβ5，腺病毒对CLL的感染效率可以提高5倍。我们在本实验中用AdCMVLacZ感染EL-4细胞株，发现当MOI为500时，转染效率为20%，单纯提高MOI值或用PHA和rmIL-2刺激细胞均未能明显提高腺病毒的感染效率。而lipofectamine与腺病毒先行作用30 min，在较低的MOI时可以明显地提高转染效率(P<0.01)。lipofectamine既往通常被用来转染质粒，寡聚核苷酸之用，其在病毒转染中的作用刚刚起步，究其提高腺病毒感染效率的机制可能是lipofectamine与腺病毒通过电荷作用，形成复合物，复合物表面被脂质包裹，与带负电荷的细胞表面相互接触，细胞内吞或通过胞膜融合摄取腺病毒与lipofectamine的复合物。这种摄取方式可以不依赖细胞表面的腺病毒蛋白受体、整合素的参与[8]。我们在本实验中，还采用lipofectamine协同重组腺病毒AdCMVIL-12感染EL-4细胞，提高了mlL-12基因的转染效率，将其作为肿瘤疫苗的研究另见报道。
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作者简介：徐彤，女，29岁，博士
徐彤(北京医科大学附属人民医院儿科，北京 100044)
殷慧君(北京医科大学附属人民医院儿科，北京 100044)
唐佩弦(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
参考文献
1.Graham FL, Prevec L. Manipulation of adenovirus vectors. In:Murray EJ ed. Methods in molecular biology,Clifton:The Humana Press Inc,1991:109～27
2.耿雨红，吴昊泉，应蓓蓓 et al.带HSV-tk的重组腺病毒杀伤离体肺癌细胞的研究.复旦大学学报(自然科学版)，1996；35：121～6
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3.彭朝晖主编.基因治疗——基因与临床，北京：中国科学技术出版社，1994:212～3
4.Wattel E, Vanrumbeke M, Abina MA et al. Deferential efficacy of adenoviral mediated gene transfer into cells from hematological cell lines and fresh hematological malignancies. Leukemia,1996;10:171～4
5.Goldman MJ, Wilson JM. Gradient of RGD-dependent entry of adenoviral vector in nasal and intrapulmonary epithelia; implications for gene therapy of cystic fibrosis. Gene Ther,1996;3:811～8
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6.Bergelson JM, Cunningham JA, Droguett G et al. Isolation of a common receptor for coxsackie B viruses and adenoviruses 2 and 5. Science,1997；275：1320～3
7.Cantwill MJ, Sharma S, Friedmann T et al. Adenovirus vector infection of chronic lymphocytic leukemia B cells. Blood,1996;88:4676～83
8.Changbin Q, Mary BDY, Aloke F et al. Cationic liposomes enhance adenovirus entry via a pathway independent of the fiber receptor and αv-integrins. Human Gene Therapy,1998;9:507～20, 百拇医药
摘 要 目的 观察不同因素对重组腺病毒转染效率的影响。方法 以重组腺病毒去感染小鼠T淋巴瘤细胞株EL-4，加入不同的刺激因子和lipofectamine，通过计数X-gal染色阳性细胞数测定转染效率。结果 rmIL-2，植物血凝素均不能改善重组腺病毒对EL-4的感染效率，而阳离子脂质体可以明显提高重组腺病毒对EL-4的感染效率。结论 可以利用阳离子脂质体来提高重组腺病毒的转染效率。
关键词：阳离子脂质体 重组腺病毒 转染效率
将外源基因导入细胞内的方式有多种，腺病毒既可以感染分裂期细胞也可感染非分裂期细胞，病毒颗粒比较稳定，可以纯化和浓缩，不整合，安全性高，因此近来受到广泛关注，以其作载体将不同的外源基因导入真核细胞的研究纷纷开展，尤其是利用重组腺病毒将细胞因子导入实体瘤细胞，激活机体抗肿瘤免疫的研究。关于重组腺病毒转染血液系统肿瘤的报道很少，因此我们用重组腺病毒AdCMVLacZ感染小鼠淋巴瘤细胞EL-4，测定不同因素对重组腺病毒感染效率的影响，以期找到提高腺病毒感染效率的有效途径。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂 重组腺病毒AdCMVLacZ、AdCMVIL-12粗提液(西班牙Navarra大学Dr Cheng Qian惠赠)。氯化铯(Boehringer公司)。阳离子脂质体lipofectamine(Gibco公司产品)。X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷，Sigma公司产品)。mIL-12的ELISA检测试剂盒购自Endogen公司。植物血凝素(PHA，广州医学工程研究所产品)。rmIL-2纯品由军事医学科学院惠赠。
1.2 细胞株 EL-4细胞是化学致癌剂在C57BL/6(H-2b)小鼠诱导T淋巴瘤细胞株(由北京医科大学免疫系提供)。复制缺陷型重组腺病毒载体包装细胞株293(人胚肾细胞株)由军事医学科学院吴祖泽院士惠赠。Hela为人宫颈癌细胞株，CHO细胞株为中国仓鼠卵巢细胞。
1.3 腺病毒的扩增、收集及纯化
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1.3.1 293细胞用完全DMEM 含体积分数为10%新生牛血清，1×105 U.L-1青霉素、100 mg.L-1链霉素，37℃、0.05 CO2、饱和湿度培养。待细胞长至培养瓶底的70%～80%时培养基更换为含体积分数为2.5%新生牛血清的DMEM，加入重组腺病毒粗提液，继续培养观察48～72 h，收集呈病态反应(cytopathic effect,CPE)的293细胞，反复冻融5次，每次冻融后振摇30 s，1 500 rpm离心20 min，弃细胞碎片，收集上清，经氯化铯密度梯度两次离心浓缩腺病毒颗粒[1]，经Hanks液透析后，加入体积分数为20%甘油，分装后于-70℃冻存备用。
1.3.2 重组腺病毒滴度的测定 病毒滴度采用噬斑分析法结合细胞病变测定法[2]。
1.3.3 重组腺病毒感染EL-4细胞的测定 AdCMVLacZ以MOI(multiplicity of infection)5，50，500，5 000分别感染EL-4细胞，4 h后用RPMI 1640洗涤去除游离病毒，于37℃、0.05 CO2培养24 h，体积分数为2.5%戊二醛固定15 min，再以含10 mmol.L-1 MgCl2的PBS洗2遍，X-gal染色48 h后计数蓝染细胞。
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1.4 重组腺病毒对不同细胞株感染效率的测定 AdCMVLacZ以MOI 50分别感染HeLa,CHO细胞株，测定转染效率。
1.5 不同刺激分子对重组腺病毒感染EL-4效率的影响 EL-4细胞分别以rmIL-2，PHA或rmIL-2+PHA刺激72 h，rmIL-2的终浓度为20 kU.L-1，PHA的终浓度为5 mg.L-1，刺激后以AdCMVLacZ感染，测定转染效率。
1.6 阳离子脂质体(lipofectamine)对重组腺病毒感染EL-4效率的影响 50 μl纯化的腺病毒加入50 μl无抗生素RPMI 1640，在此100 μl体系内加入1 μl的lipofectamine(终浓度为1 mg.L-1)室温静置30 min。100 μl浓度为2×1010 cells.L-1的EL-4细胞与该体系共同孵育105 min(MOI为50)，以RPMI 1640洗涤2次去除游离病毒，用完全RPMI 1640培养24 h，固定，X-gal染色48 h观察结果。
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1.7 AdCMVIL-12感染EL-4细胞培养上清中IL-12含量的测定 AdCMVIL-12分别在有无lipofectamine的情况下感染EL-4细胞，收集感染48 h的培养上清，ELISA测定mIL-12的含量，结果以450 nm OD值在标准曲线上对应值表示。
1.8 统计学处理 采用未配对计量资料的t检验。
2 结果
2.1 重组腺病毒对EL-4细胞感染效率的观察 重组腺病毒颗粒经扩增浓缩纯化后AdCMVLacZ和AdCMVIL-12的滴度分别为2.1×1013 pfu.L-1及4.5×1012 pfu.L-1(plaque forming unit，空斑形成单位)。AdCMVLacZ的MOI值为5时，感染EL-4后X-gal染色阳性细胞率达4.6%±2.97%，MOI为50时，感染阳性率达12.3%±2.51%，MOI达500时，X-gal染色阳性细胞率为20.3%±4.73%，以后随着MOI的升高，细胞感染阳性细胞率没有明显提高，见图1。
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Fig 1 The efficacy of recombinant adenovirus at different MOI
2.2 重组腺病毒对不同细胞株感染效率的影响 当AdCMVLacZ的MOI值为50时，HeLa和CHO感染的阳性细胞率均高于90%，而EL-4的感染率仅为12.3%±2.51%，提示HeLa和CHO是腺病毒的易感细胞，而EL-4不易被腺病毒感染。
2.3 不同因素对重组腺病毒感染EL-4效率的影响 培养的EL-4细胞分别以rmIL-2、PHA、rmIL-2+PHA刺激后，AdCMVLacZ的感染率分别为20%±4.4%、23.7%±3.1%、22.0%±2.7%，而EL-4细胞用lipofectamine协同感染后，在MOI=50时，AdCMVLacZ的感染率就可上升到37.0%±4.0%，见图2。由图可见，EL-4细胞经rmIL-2，PHA，rmIL-2+PHA刺激，重组腺病毒对其的感染率没有明显的增加。而与未经刺激的AdCMVLacZ感染的EL-4组相比，lipofectamine可以明显提高重组腺病毒的感染效率(P<0.01)。
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Fig 2 The influence of different factors on the
efficacy of recombinant adenovirus
A：rmIL-2;B:PHA;C:rmIL-2+PHA;D:control;E:lipofectamine(MOI=50)
2.4 AdCMVIL-12感染EL-4细胞mlL-12的测定 AdCMVIL-12以MOI 500感染EL-4细胞，ELISA检测感染48 h的培养上清中mIL-12的含量达(37±6.4) μg.L-1；在lipofectamine的协助下，MOI为50时，感染48 h的培养上清中mIL-12含量可以上升到(84.6±9.5) μg.L-1，明显高于未加lipofectamine者(P<0.01)。
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3 讨论
基因治疗的关键是基因转移，即将目的基因导至靶细胞内。基因转移有物理方法，化学方法和生物方法。物理方法包括电穿孔、显微注射；化学方法包括磷酸钙沉淀、脂质体及DEAE-葡聚糖等方法；生物方法主要指的是病毒介导基因转移，包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘病毒等。物理和化学方法转染效率低但相对安全，病毒转染效率高但有潜在危险性。腺病毒作为基因转染的载体之一，具有病毒颗粒比较稳定，可以纯化和浓缩、可感染非分裂细胞、无随机插入的危险性，宿主范围广的特点[3]，因而近来受到广泛关注。但腺病毒并非对所有细胞的感染效率均令人满意，有学者[4]用AdRSV β-gal感染13种不同的血液系统肿瘤的细胞株及27例血液病患者血细胞，发现K 562和PRMI 8226感染效率分别为65%和64%，MT达38%，其余的细胞株感染效率均不足20%，甚至为零，AML(急性粒细胞白血病)、CLL(慢性淋巴细胞白血病)、NHL(非何杰金淋巴病)、MDS(骨髓增生异常综合症)患者新鲜血细胞转染效率也几乎为零。腺病毒要进入细胞，需先和细胞表面的受体结合，继而在αv整合素介导下被细胞内吞[5，6]。腺病毒对一些特定细胞的感染受到限制，可能就是由于这些细胞表面缺乏受体和整合素。Cantwell等[7]比较了腺病毒感染CLL和HeLa的效率，发现腺病毒对CLL的转染效率在MOI(1～10 000)时均低于对HeLa的转染效率100～1 000倍，抗CD 40单抗刺激CLL，可以诱导CLL表面表达αvβ3和αvβ5，腺病毒对CLL的感染效率可以提高5倍。我们在本实验中用AdCMVLacZ感染EL-4细胞株，发现当MOI为500时，转染效率为20%，单纯提高MOI值或用PHA和rmIL-2刺激细胞均未能明显提高腺病毒的感染效率。而lipofectamine与腺病毒先行作用30 min，在较低的MOI时可以明显地提高转染效率(P<0.01)。lipofectamine既往通常被用来转染质粒，寡聚核苷酸之用，其在病毒转染中的作用刚刚起步，究其提高腺病毒感染效率的机制可能是lipofectamine与腺病毒通过电荷作用，形成复合物，复合物表面被脂质包裹，与带负电荷的细胞表面相互接触，细胞内吞或通过胞膜融合摄取腺病毒与lipofectamine的复合物。这种摄取方式可以不依赖细胞表面的腺病毒蛋白受体、整合素的参与[8]。我们在本实验中，还采用lipofectamine协同重组腺病毒AdCMVIL-12感染EL-4细胞，提高了mlL-12基因的转染效率，将其作为肿瘤疫苗的研究另见报道。
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作者简介：徐彤，女，29岁，博士
徐彤(北京医科大学附属人民医院儿科，北京 100044)
殷慧君(北京医科大学附属人民医院儿科，北京 100044)
唐佩弦(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
参考文献
1.Graham FL, Prevec L. Manipulation of adenovirus vectors. In:Murray EJ ed. Methods in molecular biology,Clifton:The Humana Press Inc,1991:109～27
2.耿雨红，吴昊泉，应蓓蓓 et al.带HSV-tk的重组腺病毒杀伤离体肺癌细胞的研究.复旦大学学报(自然科学版)，1996；35：121～6
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3.彭朝晖主编.基因治疗——基因与临床，北京：中国科学技术出版社，1994:212～3
4.Wattel E, Vanrumbeke M, Abina MA et al. Deferential efficacy of adenoviral mediated gene transfer into cells from hematological cell lines and fresh hematological malignancies. Leukemia,1996;10:171～4
5.Goldman MJ, Wilson JM. Gradient of RGD-dependent entry of adenoviral vector in nasal and intrapulmonary epithelia; implications for gene therapy of cystic fibrosis. Gene Ther,1996;3:811～8
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6.Bergelson JM, Cunningham JA, Droguett G et al. Isolation of a common receptor for coxsackie B viruses and adenoviruses 2 and 5. Science,1997；275：1320～3
7.Cantwill MJ, Sharma S, Friedmann T et al. Adenovirus vector infection of chronic lymphocytic leukemia B cells. Blood,1996;88:4676～83
8.Changbin Q, Mary BDY, Aloke F et al. Cationic liposomes enhance adenovirus entry via a pathway independent of the fiber receptor and αv-integrins. Human Gene Therapy,1998;9:507～20, 百拇医药