食管鳞癌组织中9pter～p21区域的杂合性缺失及其意义
张文涛 陈东义 张玉魁 潘忠诚 周立娜
摘 要 目的：探讨在原发性食管鳞癌组织中染色体9pter～p21区域内的杂合性缺失及其意义。方法：采用微卫星序列PCR银染方法，检测9pter～p21区域内3个位点的DNA微卫星多态标记，并对43例散发性原发食管鳞癌标本及其癌旁正常组织进行杂合性缺失分析。结果：9pter～p21区域内3个DNA微卫星多态标记的杂合性缺失率均大于50%，有显著意义。结论：在染色体9pter～p21区域内存在与食管鳞癌密切相关的抑癌基因。
关键词：杂合性缺失 食管鳞癌 9号染色体 抑癌基因
食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，由于食管癌诊断相对较晚，其死亡率接近发病率。因此，对食管癌的预防及病因学研究就显得更为重要。同其它类型的恶性肿瘤一样，食管癌的发生和演进也与包括原癌基因和抑癌基因在内的肿瘤相关基因的改变有关。根据Knudson的“两次突变”学说，若在染色体某一位点处频发杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)，则可能在此位点附近存在抑癌基因。
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本研究选择了位于染色体9pter～p21区域内的3个位点特异性的DNA微卫星多态标记，分别为D9S324(9p23)、D9S304(9p21.1)和D9S319(9p21.1)，并对43例散发性原发食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的肿瘤新鲜标本及其配对癌旁正常组织进行了杂合性缺失分析，探讨在食管鳞癌组织中9pter～p21区域杂合性缺失的意义，以期为进一步定位食管鳞癌特异性的抑癌基因提供线索。
1 材料与方法
1.1 标本
取自中国医科大学第一临床学院胸外科和辽宁省肿瘤医院胸外科1997年5～12月食管癌手术切除标本，取癌组织及距癌组织1 cm以上的正常癌旁组织0.5～1 cm3，-70℃保存备用。
1.2 DNA标本和引物
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从基因数据库(genetic data base,GDB)选择9pter～p21区域内3个位点的DNA微卫生多态标记，分别为D9S324，定位于9p23，引物顺序为(TAC TTT GAG CAG GAG GT；CCT GGA TTT TGT GGT CAC TC)，D9S304，定位于9p21.1，引物顺序为(GTG CAC CTC TAC ACC CAG AC;TGT GCC CAC ACA CAT CTA TC)，和D9S319，定位于9p21.1，引物顺序为(GCC ACT GTT CTC CAG AGA AA;TGG GAT ATG TCA GCC AAA AT)，它们均为短的串联重复顺序，重复单位含4个碱基。
1.3 DNA样品的提取
所有的肿瘤标本及相应的正常癌旁组织(病理诊断证实无肿瘤细胞存在)液氮冷冻保存。将标本研碎后以蛋白酶K消化，用酚-氯仿-异戊醇法提取基因组DNA，乙醇沉淀后紫外分光光度计定量备用。
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1.4 PCR反应
10 μl PCR反应体系中加入基因组DNA 5～100 ng，上下游引物各5 pmol,10×PCR缓冲液，50～ 200 mol/L 4×d NTP,0.5 U Taq DNA聚合酶，经94℃，3 min，再经92℃,0.5 min，55℃ 1min，72℃1 min，30个循环后72℃延伸5 min。
1.5 结果观察
将5 μl PCR反应产物95℃热变性5 min，上样至8%变性聚丙烯酰胺凝胶(含8 mol/L尿素)，700 V电泳2 h后以10%冰乙酸固定凝胶30 min，0.16 mol/L HNO3洗2×4 min，用去离子水淋洗后以12 mmol/L AgNO3染色2×10 min，再用去离子水冲洗，加显色液(每升含Na2CO3 30 g，37%甲醛1 ml)显色，待显带清晰后以10%冰乙酸浸泡定影，照相观察结果。
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1.6 LOH判定
将肿瘤组织标本与其相应的正常组织PCR结果同时上样比较，若正常组织基因组DNA为某一标记的杂合子时，即出现两个等位片段，可提供信息用于LOH分析。如果出现一个片段，即不能提供信息。与癌旁组织对比，癌组织基因组DNA PCR扩增产物带一条消失或其中一条带信号明显减弱时则为LOH。
2 结果
在43例食管鳞癌新鲜标本及其配对癌旁正常粘膜组织中，3个位点的总信息个体数为62，杂合性缺失阳性总数为40。D9S324(9p23)位点的信息个体数13，其中杂合性缺失阳性者10例，其杂合性缺失率为77%，D9S304(9p21.1)位点的信息个体数为27，其中杂合性缺失阳性者17例，其杂合性缺失率为63%；D9S319(9p21.1)位点的信息个体数为22，其中杂合性缺失阳性者13例，其杂合性缺失率为59%。3个位点的杂合性缺失率均大于50%，有显著意义。
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3 讨论
长期以来，食管癌的细胞遗传学研究已经证明在食管癌中存在一些有规律的染色体改变，并且存在家族聚集性和遗传易感性。提示在食管癌的发病过程中，可能有一种或几种食管癌的易感基因起作用。目前，食管癌相关的抑癌基因的定位研究已成为我国分子遗传学研究的热点之一。1994年，李万波等以限制性片段长度多态性(RFLP)法检测了食管癌组织中3号、9号染色体的杂合性缺失[1]。1996年，李卫东等采用微卫星序列-PCR银染法检测了食管癌标本中不同染色体位点的杂合性缺失[2]。但均未检测到食管鳞癌组织中高频缺失(>50%)的染色体区段。
肿瘤分子遗传学研究已经发现许多人类肿瘤和细胞系中都存在染色体9pter～p21区域的异常，如纯合性缺失、杂合性缺失、易位、倒位等，因而认为此区可能存在抑癌基因。本实验着重选取了3个位于9号染色体上的DNA微卫星多态性位点，重点检测了9pter～p21区域。在此区域内含有MTS-1基因。此基因编码p16蛋白，一种特异性周期素依赖性激酶抑制因子，它检测细胞周期中G1-S转换。MTS-1基因灭活可通过多种机制，如纯合性缺失，异常DNA甲基化所致表达缺失或错义突变[3]。其杂合性缺失有两层含义，一是它本身即是杂合性缺失的靶基因，因为它的丢失，食管上皮获得生长优势。二是它也可以作为一种缺失的标记，提示附近可能还有别的候选抑癌基因。因此，对食管癌和其它癌而言，MTS-1基因本身是否为等位基因缺失的靶基因，仍不能确定[4～6]。
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综上所述，D9S324，D9S304，D9S319 3个位点的杂合性缺失率均大于50%，有显著性意义，表明染色体9pter～p21区域内存在于与食管鳞癌密切相关的抑癌基因，该基因的定位与分离尚有待于进一步的研究。
张玉魁(中国医科大学生物技术研究所)
潘忠诚(中国医科大学生物技术研究所)
周立娜(中国医科大学生物技术研究所)
张文涛(中国医科大学第一临床学院胸外科，沈阳 110001)
陈东义(中国医科大学第一临床学院胸外科，沈阳 110001)
张玉魁(中国医科大学第一临床学院胸外科，沈阳 110001)
, 百拇医药 潘忠诚(中国医科大学第一临床学院胸外科，沈阳 110001)
周立娜(中国医科大学第一临床学院胸外科，沈阳 110001)
参考文献
1，李万波，王秀琴，吴民.食管癌第3号和第9号染色体频发的等位基因丢失.自然科学进展——国家重点实验室通讯，1994，4(4)：461～464
2，李卫东，王亮，王秀琴，等.食管癌组织染色体位点特异性的杂合性缺失和微卫星DNA序列不稳定.中华医学遗传学杂志，1996，13(4)：194～197
3，Tsutomu Nobori,Kaoru Miura, David J,et al. Deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers.Nature,1994,368(21):753-756
, 百拇医药
4，Takahiro Mori,，Koh Miura, Takahisa Aoki, et al. Frequent somatic mutation of the MTS1/CDK4I(multiple tumor suppressor/cyclin-dependent kinase 4 inhibitor) gene in esophageal squamous cell carcinoma.Cancer Res,1994,57(7):3396-3397
5，Asuncion Esteve,，Ghyslaine Martel-Planche, Bakary S Sylia,，et al.Low frequence of p16/CDKN2 gene mutations in esophageal carcinomas.Int J Cancer,1996,66(2):301-304
6，金顺钱，彭琼，陆士新，等.食管癌组织中MTS1/p16基因的缺失.中华肿瘤杂志，1998，66(20)：9～11, http://www.100md.com
摘 要 目的：探讨在原发性食管鳞癌组织中染色体9pter～p21区域内的杂合性缺失及其意义。方法：采用微卫星序列PCR银染方法，检测9pter～p21区域内3个位点的DNA微卫星多态标记，并对43例散发性原发食管鳞癌标本及其癌旁正常组织进行杂合性缺失分析。结果：9pter～p21区域内3个DNA微卫星多态标记的杂合性缺失率均大于50%，有显著意义。结论：在染色体9pter～p21区域内存在与食管鳞癌密切相关的抑癌基因。
关键词：杂合性缺失 食管鳞癌 9号染色体 抑癌基因
食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，由于食管癌诊断相对较晚，其死亡率接近发病率。因此，对食管癌的预防及病因学研究就显得更为重要。同其它类型的恶性肿瘤一样，食管癌的发生和演进也与包括原癌基因和抑癌基因在内的肿瘤相关基因的改变有关。根据Knudson的“两次突变”学说，若在染色体某一位点处频发杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)，则可能在此位点附近存在抑癌基因。
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本研究选择了位于染色体9pter～p21区域内的3个位点特异性的DNA微卫星多态标记，分别为D9S324(9p23)、D9S304(9p21.1)和D9S319(9p21.1)，并对43例散发性原发食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的肿瘤新鲜标本及其配对癌旁正常组织进行了杂合性缺失分析，探讨在食管鳞癌组织中9pter～p21区域杂合性缺失的意义，以期为进一步定位食管鳞癌特异性的抑癌基因提供线索。
1 材料与方法
1.1 标本
取自中国医科大学第一临床学院胸外科和辽宁省肿瘤医院胸外科1997年5～12月食管癌手术切除标本，取癌组织及距癌组织1 cm以上的正常癌旁组织0.5～1 cm3，-70℃保存备用。
1.2 DNA标本和引物
, 百拇医药
从基因数据库(genetic data base,GDB)选择9pter～p21区域内3个位点的DNA微卫生多态标记，分别为D9S324，定位于9p23，引物顺序为(TAC TTT GAG CAG GAG GT；CCT GGA TTT TGT GGT CAC TC)，D9S304，定位于9p21.1，引物顺序为(GTG CAC CTC TAC ACC CAG AC;TGT GCC CAC ACA CAT CTA TC)，和D9S319，定位于9p21.1，引物顺序为(GCC ACT GTT CTC CAG AGA AA;TGG GAT ATG TCA GCC AAA AT)，它们均为短的串联重复顺序，重复单位含4个碱基。
1.3 DNA样品的提取
所有的肿瘤标本及相应的正常癌旁组织(病理诊断证实无肿瘤细胞存在)液氮冷冻保存。将标本研碎后以蛋白酶K消化，用酚-氯仿-异戊醇法提取基因组DNA，乙醇沉淀后紫外分光光度计定量备用。
, http://www.100md.com
1.4 PCR反应
10 μl PCR反应体系中加入基因组DNA 5～100 ng，上下游引物各5 pmol,10×PCR缓冲液，50～ 200 mol/L 4×d NTP,0.5 U Taq DNA聚合酶，经94℃，3 min，再经92℃,0.5 min，55℃ 1min，72℃1 min，30个循环后72℃延伸5 min。
1.5 结果观察
将5 μl PCR反应产物95℃热变性5 min，上样至8%变性聚丙烯酰胺凝胶(含8 mol/L尿素)，700 V电泳2 h后以10%冰乙酸固定凝胶30 min，0.16 mol/L HNO3洗2×4 min，用去离子水淋洗后以12 mmol/L AgNO3染色2×10 min，再用去离子水冲洗，加显色液(每升含Na2CO3 30 g，37%甲醛1 ml)显色，待显带清晰后以10%冰乙酸浸泡定影，照相观察结果。
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1.6 LOH判定
将肿瘤组织标本与其相应的正常组织PCR结果同时上样比较，若正常组织基因组DNA为某一标记的杂合子时，即出现两个等位片段，可提供信息用于LOH分析。如果出现一个片段，即不能提供信息。与癌旁组织对比，癌组织基因组DNA PCR扩增产物带一条消失或其中一条带信号明显减弱时则为LOH。
2 结果
在43例食管鳞癌新鲜标本及其配对癌旁正常粘膜组织中，3个位点的总信息个体数为62，杂合性缺失阳性总数为40。D9S324(9p23)位点的信息个体数13，其中杂合性缺失阳性者10例，其杂合性缺失率为77%，D9S304(9p21.1)位点的信息个体数为27，其中杂合性缺失阳性者17例，其杂合性缺失率为63%；D9S319(9p21.1)位点的信息个体数为22，其中杂合性缺失阳性者13例，其杂合性缺失率为59%。3个位点的杂合性缺失率均大于50%，有显著意义。
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3 讨论
长期以来，食管癌的细胞遗传学研究已经证明在食管癌中存在一些有规律的染色体改变，并且存在家族聚集性和遗传易感性。提示在食管癌的发病过程中，可能有一种或几种食管癌的易感基因起作用。目前，食管癌相关的抑癌基因的定位研究已成为我国分子遗传学研究的热点之一。1994年，李万波等以限制性片段长度多态性(RFLP)法检测了食管癌组织中3号、9号染色体的杂合性缺失[1]。1996年，李卫东等采用微卫星序列-PCR银染法检测了食管癌标本中不同染色体位点的杂合性缺失[2]。但均未检测到食管鳞癌组织中高频缺失(>50%)的染色体区段。
肿瘤分子遗传学研究已经发现许多人类肿瘤和细胞系中都存在染色体9pter～p21区域的异常，如纯合性缺失、杂合性缺失、易位、倒位等，因而认为此区可能存在抑癌基因。本实验着重选取了3个位于9号染色体上的DNA微卫星多态性位点，重点检测了9pter～p21区域。在此区域内含有MTS-1基因。此基因编码p16蛋白，一种特异性周期素依赖性激酶抑制因子，它检测细胞周期中G1-S转换。MTS-1基因灭活可通过多种机制，如纯合性缺失，异常DNA甲基化所致表达缺失或错义突变[3]。其杂合性缺失有两层含义，一是它本身即是杂合性缺失的靶基因，因为它的丢失，食管上皮获得生长优势。二是它也可以作为一种缺失的标记，提示附近可能还有别的候选抑癌基因。因此，对食管癌和其它癌而言，MTS-1基因本身是否为等位基因缺失的靶基因，仍不能确定[4～6]。
, http://www.100md.com
综上所述，D9S324，D9S304，D9S319 3个位点的杂合性缺失率均大于50%，有显著性意义，表明染色体9pter～p21区域内存在于与食管鳞癌密切相关的抑癌基因，该基因的定位与分离尚有待于进一步的研究。
张玉魁(中国医科大学生物技术研究所)
潘忠诚(中国医科大学生物技术研究所)
周立娜(中国医科大学生物技术研究所)
张文涛(中国医科大学第一临床学院胸外科，沈阳 110001)
陈东义(中国医科大学第一临床学院胸外科，沈阳 110001)
张玉魁(中国医科大学第一临床学院胸外科，沈阳 110001)
, 百拇医药 潘忠诚(中国医科大学第一临床学院胸外科，沈阳 110001)
周立娜(中国医科大学第一临床学院胸外科，沈阳 110001)
参考文献
1，李万波，王秀琴，吴民.食管癌第3号和第9号染色体频发的等位基因丢失.自然科学进展——国家重点实验室通讯，1994，4(4)：461～464
2，李卫东，王亮，王秀琴，等.食管癌组织染色体位点特异性的杂合性缺失和微卫星DNA序列不稳定.中华医学遗传学杂志，1996，13(4)：194～197
3，Tsutomu Nobori,Kaoru Miura, David J,et al. Deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers.Nature,1994,368(21):753-756
, 百拇医药
4，Takahiro Mori,，Koh Miura, Takahisa Aoki, et al. Frequent somatic mutation of the MTS1/CDK4I(multiple tumor suppressor/cyclin-dependent kinase 4 inhibitor) gene in esophageal squamous cell carcinoma.Cancer Res,1994,57(7):3396-3397
5，Asuncion Esteve,，Ghyslaine Martel-Planche, Bakary S Sylia,，et al.Low frequence of p16/CDKN2 gene mutations in esophageal carcinomas.Int J Cancer,1996,66(2):301-304
6，金顺钱，彭琼，陆士新，等.食管癌组织中MTS1/p16基因的缺失.中华肿瘤杂志，1998，66(20)：9～11, http://www.100md.com