同种异体骨基质明胶在椎体间融合术中的实验研究
白伦浩 张云岐 王海义 付勤 马兴为 刘学勇 付永慧
摘 要：目的 通过同种异体骨基质明胶(BMG)在腰椎间诱导成骨的实验结果，证明同种BMG能够在椎间诱导成骨，达到椎间融合的目的。方法 以兔腰椎间盘摘除后的椎间隙作为动物模型，分别植入明胶海绵、同种BMG、脱钙骨基质和酒精保存骨。植入后4、8及12周进行X线摄片和组织学检查。结果 同种BMG无明显免疫排斥反应，并且具有良好的骨诱导作用，术后4及8周有大量新骨出现于椎间隙中央部，术后12周椎间完全融合。结论 同种BMG通过骨诱导作用在椎体间成骨融合，是理想的自体骨替代材料。
关键词：骨基质明胶 椎体间融合 诱导成骨
近年来，许多学者报道了同种或异种骨基质明胶(bone matrix gelatin,BMG)诱导成骨的实验研究，并且已经在临床上试用，但是有关BMG用于脊柱融合中的研究报道很少。我们通过同种异体BMG在兔腰椎间诱导成骨的研究，证明同种BMG能在椎体间诱导成骨，并且达到椎间融合的目的。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 移植材料的制备
1.1.1 同种BMG的制备 在相对无菌条件下，取纯种新西兰幼兔新鲜四肢长管状骨，剔除骨面上的软组织，将骨髓劈开为二半，清除骨髓。按照Urist方法制成BMG，用环氧乙烷灭菌，置于0 ℃～20 ℃冰箱内冻干后保存，备用。
1.1.2 酒精保存骨的制备 取骨方法同BMG的制备。将骨质水洗后，置于75%酒精内浸泡，即为酒精保存骨(undemineralized bone, UDB)。
1.1.3 脱钙骨基质的制备 取骨方法同BMG的制备。将骨质置于0.6 mol/L盐酸内脱钙24小时，经蒸馏水反复冲洗，呈中性为止，冻干，环氧乙烷消毒，置于0 ℃～20 ℃冰箱内保存，即为脱钙骨基质(demineralized bone matrix, DBM)。
, 百拇医药
1.1.4 明胶海绵 为空白组。由上海生物制品研究所提供。
1.2 动物模型建立
选用体重2.0～2.5 kg的兔48只，随机分为三组，每组16只兔(附表)。各组动物均在无菌条件下，经腹膜后进路，在腰椎的前外侧注意保护下腔静脉、腹主动脉及其分支的前提下，暴露L3～L5椎体及其间隙。纵行切开前纵韧带，并在骨膜下潜行剥离，用尖刀从椎体软骨板分离椎间盘和纤维环，用髓核钳和小刮匙摘除髓核、部分软骨板和纤维环。在终板侧椎体钻几个孔致出血，取相应大小植骨块置入后，用钢丝固定上、下椎体，并间断缝合前纵韧带。
附表 实验动物分组情况
Tab. Groups of experimental animals
组别
, http://www.100md.com
Groups
n
移植物 Graft
L3～4
L4～5
1
16
空白
Blank control
BMG
2
16
, 百拇医药 UDB
BMG
3
16
DBM
BMG
各组实验动物饲养条件一致，术后4、8及12周分批处死实验动物，取材检查。
1.3 检查项目
1.3.1 X线检查 制备好的四种移植物进行X线摄片(电压40 kV,电流50 mA，曝光时间0.04 s，焦距72 cm)，以作骨痂生成情况的对比标准。各组兔在规定时间按上述条件摄片，观察新骨形成情况及椎间融合情况。
1.3.2 组织学检查 动物活杀后，立即在椎体间取材，10%福尔马林液固定，EDTA脱钙，石蜡包埋，切片厚5 μm，HE染色后光镜下观察。
, 百拇医药
2 结果
2.1 X线摄片
术后4周，空白组椎间隙清晰，无密度改变；UDB植入椎间隙密度相对降低，呈现轻度吸收；DBM植入和BMG植入椎间隙密度无明显改变(图1)。术后8周，空白组仅椎体边缘有少许模糊阴影；UDB植入椎间隙密度明显降低，移植块呈明显吸收；DBM和BMG植入椎间隙中央均有不同程度密度增高，但以后者为明显。术后12周，空白组无明显变化；UDB植入移植物已基本吸收；DBM植入椎间隙密度增高略低于椎体，其面积为椎间隙的2/5；BMG植入椎间隙完全融合，椎间密度近于或高于椎体(图2)。
图1 术后4周兔腰椎X线片 DBM植入(a)和BMG植入(b)椎间隙密度无明显改变
, 百拇医药 Fig. 1 Rabbit lumbar X-ray,4 weeks after operation
There was no obvious difference in the densities of
intervertebral space of DBM group(a) and BMG group(b)
图2 术后12周兔腰椎X线片 空白组(a)椎间隙无明显变化；
BMG植入(b)椎间隙完全融合，椎体间隙消失
Fig. 2 Lumbar X-ray,12 weeks after operation
, 百拇医药
There was no obvious change in the intervertebral
space in control group(a).The intervertebral space of
BMG group(b) were fused completely
2.2 组织形态学检查
术后4周，UDB植入间隙，移植物周围有大量炎性细胞浸润，移植物内部无成活的细胞成份；DBM植入间隙，移植物周围见少量炎性细胞；BMG植入间隙有大量间质细胞和大量肥大软骨细胞存在于椎间隙中央。术后8周，UDB植入间隙，周围仍见炎性细胞，并有纤维样组织形成，移植物部分被吸收；DBM植入间隙，椎间隙中央存在大量软骨细胞团，其周围有少量纤维组织；BMG植入间隙，椎间隙已有大量软骨细胞及成骨细胞形成。术后12周，UDB植入间隙中，移植物基本被纤维组织替代，其周围血管明显扩张、充血；DBM植入间隙，椎间中央有大量肥大软骨及骨样组织形成；BMG植入间隙的椎间已融合，表现为编织骨和骨髓形成。空白组椎间隙在术后4、8及12周，移植物逐渐被吸收并被纤维组织代替。
, 百拇医药
3 讨论
我们的实验按Urist法，用幼兔长管状骨在脱钙基础上，通过氯仿、甲醇等连续化学处理后，即成为不溶性骨基质明胶。电镜观察发现它是一种无定形的失去原纤维结构的母质。由于制作过程中除去了除BMP以外95%胶原性蛋白和脂质类，故其抗原性很低，并保留了其成骨诱导的能力。将其植入同种异体动物椎间隙，宿主对其不产生免疫排斥反应，能较快生成新骨。本组实验动物仅在术后8～12周就可在椎间成骨融合，说明BMG的骨诱导活性强，可用于椎间融合、脊柱成形等脊柱外科领域中。
目前认为，BMG所具有的骨诱导能力归因于所含的BMP。该蛋白质是一种低分子量的非胶原性蛋白质，已分别从不同种属动物的牙基质、骨和骨肉瘤中提取出来，其特异生物学功能是诱导间充质细胞分化为软骨细胞、成骨细胞并形成骨髓[1]。这与我们实验所观察到的结果相符合，即先在椎间中央出现肥大软骨细胞，以后逐渐向四周扩散，最终椎间融合。所以，我们实验植入BMG后对椎间融合的影响是它们能够主动地诱导成骨，而不是仅起被动的“支架”或“桥梁”作用。通过X线摄片发现，BMG和DBM植入术后4周或8周见椎间隙中央密度增高，但空白组和UDB植入椎间隙密度无明显变化，表明新骨都先出现于椎间隙中央部，椎间融合主要靠诱导成骨，而由“爬行替代”所产生的新骨数量很少，靠“爬行替代”不可能在如此大的椎间隙成骨融合[2]。
, 百拇医药
胡晓波等[3]认为，诱导成骨的方式主要表现为“同步取代”和“叠状成骨”，即BMG的吸收和新骨的生成是同时发生的，并且BMG逐步被新骨取代。BMG吸收后留出一块“空地”，BMG在被吸收的同时释放出的BMP就在这块“空地”上诱导间质细胞分化成软骨细胞、成骨细胞“同步取代”过程，也就是骨吸收与骨形成之间的耦合过程，其特点是：①新生骨组织仅出现于诱导材料本身的部位；②新骨的形状与诱导材料相似。但我们的实验结果与上述结论有不同之处：①肥大的软骨细胞首先出现于椎间隙中央部，并逐渐向四周扩散、变性、成骨和骨髓形成，而未见“叠状排列”；②新骨充填椎间隙，其形状与植骨材料不相同。
在我们的实验中，明胶海绵和UDB在椎间隙不能成骨融合，其原因可能是：①明胶海绵在椎间隙逐步被吸收，并纤维化；②UBD移植后有严重的排斥反应，被大量炎性细胞包绕，并且UDB中钙离子等矿物质，阻碍了BMP扩散到间质类细胞[4]，对BMP的活性起着重要的直接或间接作用；③UDB在吸收的同时BMP由于纤维囊的包绕不能扩散出来，因而不能与间质类细胞接触并诱导其分化为成骨细胞。相反，BMG、DBM没有钙离子等阳性离子干扰和纤维囊包绕，故在移植块吸收的同时释放出BMP并向四周扩散[5]。但DBM的软骨化骨程度和速度远不如BMG，这可能与DBM未完全消除脂类、蛋白质等抗原物质有关。
, 百拇医药
总之，同种异体骨是常用的自身骨移植替代材料，由于免疫排斥反应，UDB移植块局部有大量炎性细胞浸润，无新骨形成征象，而DBM和BMG有诱导成骨活性，能够在椎间隙诱导成骨，达椎间融合目的，其中BMG活性更活跃。BMG的制备简便，骨诱导活性好，必将被广泛应用于脊柱外科领域，成为一种新型理想的自体骨替代植骨材料。
作者单位：白伦浩(中国医科大学第二临床学院骨科(沈阳，110003))
张云岐(中国医科大学第二临床学院骨科(沈阳，110003))
王海义(中国医科大学第二临床学院骨科(沈阳，110003))
付勤(中国医科大学第二临床学院骨科(沈阳，110003))
马兴为(中国医科大学第二临床学院骨科(沈阳，110003))
, 百拇医药
刘学勇(中国医科大学第二临床学院骨科(沈阳，110003))
付永慧(中国医科大学第二临床学院骨科(沈阳，110003))
参考文献：
[1]Urist MR，Lietze A,Mizutani H,et al.A bovine low molecular weight bone morphogenetic protein(BMP)fraction.Clin Orthop,1982;162:219
[2]Heckman JD,Boyan BD,Aufdemorte TB,et al. The use of bone morphogenetic protein in the treatment of non-union in a canine model.J Bone Joint Surg(Am),1991;73:750
[3]胡晓波，吴祖尧.骨基质明胶和脱钙骨基质的骨诱导能力及其差异的实验研究.重庆医科大学学报，1986；2(1)：69
[4]Einhorm TA.The healing of segmental bone defects induced by demineralized bone matrix.J Bone Joint Surg(Am),1984;66:274
[5]李拾林，胡小令，刘龙平.同种骨基质明胶加石膏修复骨缺损的实验研究.中国修复重建外科杂志，1999；13(3)：137, 百拇医药
摘 要：目的 通过同种异体骨基质明胶(BMG)在腰椎间诱导成骨的实验结果，证明同种BMG能够在椎间诱导成骨，达到椎间融合的目的。方法 以兔腰椎间盘摘除后的椎间隙作为动物模型，分别植入明胶海绵、同种BMG、脱钙骨基质和酒精保存骨。植入后4、8及12周进行X线摄片和组织学检查。结果 同种BMG无明显免疫排斥反应，并且具有良好的骨诱导作用，术后4及8周有大量新骨出现于椎间隙中央部，术后12周椎间完全融合。结论 同种BMG通过骨诱导作用在椎体间成骨融合，是理想的自体骨替代材料。
关键词：骨基质明胶 椎体间融合 诱导成骨
近年来，许多学者报道了同种或异种骨基质明胶(bone matrix gelatin,BMG)诱导成骨的实验研究，并且已经在临床上试用，但是有关BMG用于脊柱融合中的研究报道很少。我们通过同种异体BMG在兔腰椎间诱导成骨的研究，证明同种BMG能在椎体间诱导成骨，并且达到椎间融合的目的。
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1 材料与方法
1.1 移植材料的制备
1.1.1 同种BMG的制备 在相对无菌条件下，取纯种新西兰幼兔新鲜四肢长管状骨，剔除骨面上的软组织，将骨髓劈开为二半，清除骨髓。按照Urist方法制成BMG，用环氧乙烷灭菌，置于0 ℃～20 ℃冰箱内冻干后保存，备用。
1.1.2 酒精保存骨的制备 取骨方法同BMG的制备。将骨质水洗后，置于75%酒精内浸泡，即为酒精保存骨(undemineralized bone, UDB)。
1.1.3 脱钙骨基质的制备 取骨方法同BMG的制备。将骨质置于0.6 mol/L盐酸内脱钙24小时，经蒸馏水反复冲洗，呈中性为止，冻干，环氧乙烷消毒，置于0 ℃～20 ℃冰箱内保存，即为脱钙骨基质(demineralized bone matrix, DBM)。
, 百拇医药
1.1.4 明胶海绵 为空白组。由上海生物制品研究所提供。
1.2 动物模型建立
选用体重2.0～2.5 kg的兔48只，随机分为三组，每组16只兔(附表)。各组动物均在无菌条件下，经腹膜后进路，在腰椎的前外侧注意保护下腔静脉、腹主动脉及其分支的前提下，暴露L3～L5椎体及其间隙。纵行切开前纵韧带，并在骨膜下潜行剥离，用尖刀从椎体软骨板分离椎间盘和纤维环，用髓核钳和小刮匙摘除髓核、部分软骨板和纤维环。在终板侧椎体钻几个孔致出血，取相应大小植骨块置入后，用钢丝固定上、下椎体，并间断缝合前纵韧带。
附表 实验动物分组情况
Tab. Groups of experimental animals
组别
, http://www.100md.com
Groups
n
移植物 Graft
L3～4
L4～5
1
16
空白
Blank control
BMG
2
16
, 百拇医药 UDB
BMG
3
16
DBM
BMG
各组实验动物饲养条件一致，术后4、8及12周分批处死实验动物，取材检查。
1.3 检查项目
1.3.1 X线检查 制备好的四种移植物进行X线摄片(电压40 kV,电流50 mA，曝光时间0.04 s，焦距72 cm)，以作骨痂生成情况的对比标准。各组兔在规定时间按上述条件摄片，观察新骨形成情况及椎间融合情况。
1.3.2 组织学检查 动物活杀后，立即在椎体间取材，10%福尔马林液固定，EDTA脱钙，石蜡包埋，切片厚5 μm，HE染色后光镜下观察。
, 百拇医药
2 结果
2.1 X线摄片
术后4周，空白组椎间隙清晰，无密度改变；UDB植入椎间隙密度相对降低，呈现轻度吸收；DBM植入和BMG植入椎间隙密度无明显改变(图1)。术后8周，空白组仅椎体边缘有少许模糊阴影；UDB植入椎间隙密度明显降低，移植块呈明显吸收；DBM和BMG植入椎间隙中央均有不同程度密度增高，但以后者为明显。术后12周，空白组无明显变化；UDB植入移植物已基本吸收；DBM植入椎间隙密度增高略低于椎体，其面积为椎间隙的2/5；BMG植入椎间隙完全融合，椎间密度近于或高于椎体(图2)。
图1 术后4周兔腰椎X线片 DBM植入(a)和BMG植入(b)椎间隙密度无明显改变
, 百拇医药 Fig. 1 Rabbit lumbar X-ray,4 weeks after operation
There was no obvious difference in the densities of
intervertebral space of DBM group(a) and BMG group(b)
图2 术后12周兔腰椎X线片 空白组(a)椎间隙无明显变化；
BMG植入(b)椎间隙完全融合，椎体间隙消失
Fig. 2 Lumbar X-ray,12 weeks after operation
, 百拇医药
There was no obvious change in the intervertebral
space in control group(a).The intervertebral space of
BMG group(b) were fused completely
2.2 组织形态学检查
术后4周，UDB植入间隙，移植物周围有大量炎性细胞浸润，移植物内部无成活的细胞成份；DBM植入间隙，移植物周围见少量炎性细胞；BMG植入间隙有大量间质细胞和大量肥大软骨细胞存在于椎间隙中央。术后8周，UDB植入间隙，周围仍见炎性细胞，并有纤维样组织形成，移植物部分被吸收；DBM植入间隙，椎间隙中央存在大量软骨细胞团，其周围有少量纤维组织；BMG植入间隙，椎间隙已有大量软骨细胞及成骨细胞形成。术后12周，UDB植入间隙中，移植物基本被纤维组织替代，其周围血管明显扩张、充血；DBM植入间隙，椎间中央有大量肥大软骨及骨样组织形成；BMG植入间隙的椎间已融合，表现为编织骨和骨髓形成。空白组椎间隙在术后4、8及12周，移植物逐渐被吸收并被纤维组织代替。
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3 讨论
我们的实验按Urist法，用幼兔长管状骨在脱钙基础上，通过氯仿、甲醇等连续化学处理后，即成为不溶性骨基质明胶。电镜观察发现它是一种无定形的失去原纤维结构的母质。由于制作过程中除去了除BMP以外95%胶原性蛋白和脂质类，故其抗原性很低，并保留了其成骨诱导的能力。将其植入同种异体动物椎间隙，宿主对其不产生免疫排斥反应，能较快生成新骨。本组实验动物仅在术后8～12周就可在椎间成骨融合，说明BMG的骨诱导活性强，可用于椎间融合、脊柱成形等脊柱外科领域中。
目前认为，BMG所具有的骨诱导能力归因于所含的BMP。该蛋白质是一种低分子量的非胶原性蛋白质，已分别从不同种属动物的牙基质、骨和骨肉瘤中提取出来，其特异生物学功能是诱导间充质细胞分化为软骨细胞、成骨细胞并形成骨髓[1]。这与我们实验所观察到的结果相符合，即先在椎间中央出现肥大软骨细胞，以后逐渐向四周扩散，最终椎间融合。所以，我们实验植入BMG后对椎间融合的影响是它们能够主动地诱导成骨，而不是仅起被动的“支架”或“桥梁”作用。通过X线摄片发现，BMG和DBM植入术后4周或8周见椎间隙中央密度增高，但空白组和UDB植入椎间隙密度无明显变化，表明新骨都先出现于椎间隙中央部，椎间融合主要靠诱导成骨，而由“爬行替代”所产生的新骨数量很少，靠“爬行替代”不可能在如此大的椎间隙成骨融合[2]。
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胡晓波等[3]认为，诱导成骨的方式主要表现为“同步取代”和“叠状成骨”，即BMG的吸收和新骨的生成是同时发生的，并且BMG逐步被新骨取代。BMG吸收后留出一块“空地”，BMG在被吸收的同时释放出的BMP就在这块“空地”上诱导间质细胞分化成软骨细胞、成骨细胞“同步取代”过程，也就是骨吸收与骨形成之间的耦合过程，其特点是：①新生骨组织仅出现于诱导材料本身的部位；②新骨的形状与诱导材料相似。但我们的实验结果与上述结论有不同之处：①肥大的软骨细胞首先出现于椎间隙中央部，并逐渐向四周扩散、变性、成骨和骨髓形成，而未见“叠状排列”；②新骨充填椎间隙，其形状与植骨材料不相同。
在我们的实验中，明胶海绵和UDB在椎间隙不能成骨融合，其原因可能是：①明胶海绵在椎间隙逐步被吸收，并纤维化；②UBD移植后有严重的排斥反应，被大量炎性细胞包绕，并且UDB中钙离子等矿物质，阻碍了BMP扩散到间质类细胞[4]，对BMP的活性起着重要的直接或间接作用；③UDB在吸收的同时BMP由于纤维囊的包绕不能扩散出来，因而不能与间质类细胞接触并诱导其分化为成骨细胞。相反，BMG、DBM没有钙离子等阳性离子干扰和纤维囊包绕，故在移植块吸收的同时释放出BMP并向四周扩散[5]。但DBM的软骨化骨程度和速度远不如BMG，这可能与DBM未完全消除脂类、蛋白质等抗原物质有关。
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总之，同种异体骨是常用的自身骨移植替代材料，由于免疫排斥反应，UDB移植块局部有大量炎性细胞浸润，无新骨形成征象，而DBM和BMG有诱导成骨活性，能够在椎间隙诱导成骨，达椎间融合目的，其中BMG活性更活跃。BMG的制备简便，骨诱导活性好，必将被广泛应用于脊柱外科领域，成为一种新型理想的自体骨替代植骨材料。
作者单位：白伦浩(中国医科大学第二临床学院骨科(沈阳，110003))
张云岐(中国医科大学第二临床学院骨科(沈阳，110003))
王海义(中国医科大学第二临床学院骨科(沈阳，110003))
付勤(中国医科大学第二临床学院骨科(沈阳，110003))
马兴为(中国医科大学第二临床学院骨科(沈阳，110003))
, 百拇医药
刘学勇(中国医科大学第二临床学院骨科(沈阳，110003))
付永慧(中国医科大学第二临床学院骨科(沈阳，110003))
参考文献：
[1]Urist MR，Lietze A,Mizutani H,et al.A bovine low molecular weight bone morphogenetic protein(BMP)fraction.Clin Orthop,1982;162:219
[2]Heckman JD,Boyan BD,Aufdemorte TB,et al. The use of bone morphogenetic protein in the treatment of non-union in a canine model.J Bone Joint Surg(Am),1991;73:750
[3]胡晓波，吴祖尧.骨基质明胶和脱钙骨基质的骨诱导能力及其差异的实验研究.重庆医科大学学报，1986；2(1)：69
[4]Einhorm TA.The healing of segmental bone defects induced by demineralized bone matrix.J Bone Joint Surg(Am),1984;66:274
[5]李拾林，胡小令，刘龙平.同种骨基质明胶加石膏修复骨缺损的实验研究.中国修复重建外科杂志，1999；13(3)：137, 百拇医药