NGF和Svate-3对多发性脑梗塞大鼠纹旁区神经元作用的实验研究
刘晓湘 李东培 方秀斌 高杰
摘 要 目的：探讨多发性脑梗塞(MCI)大鼠纹旁区一氧化氮合酶(NOS)的变化及神经生长因子(NGF)和精制蝮蛇抗栓酶3号(Svate-3)联合应用对MCI大鼠纹旁区的作用。方法: 选用Wistar大鼠, 应用微栓子栓塞阻断法建立多发性脑梗塞性缺血模型, 用NADPH-d组化方法、透射电镜技术并结合显微图像分析技术。结果: 实验组NOS阳性反应物平均灰度值与实验对照组比较明显降低(P<0.01)。结论: NGF和Svate-3联合应用可使MCI大鼠纹旁区NOS阳性反应物明显增多, 对MCI有一定的治疗作用。
关键词：多发性脑梗塞 神经生长因子 精制蝮蛇抗栓酶3号 纹旁区 一氧化氮合酶 大鼠
纹旁区接受从大脑皮质17区发来的冲动并与其他皮质和丘脑枕有往返的联系，对感知、整合视觉信息有重要作用，且含有一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)阳性神经元胞体和纤维。但多发性脑梗塞(multiple cerebral infarction，MCI)时纹旁区NOS阳性反应物是否有变化，尚未见有文献报道。作者联合应用神经生长因子(nerve growth factor, NGF)和Svate-3，观察MCI大鼠纹旁区NOS的变化，旨在探讨二者对MCI大鼠纹旁区的作用，为临床治疗MCI提供新的理论依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验动物分组
本实验选用雄性Wistar大鼠24只，体重220～280 g，随机分成3组：正常对照组、实验对照组和实验组各8只。
1.2 实验方法
1.2.1 模型制备：1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，颈部侧切口，暴露分离左侧颈内、外动脉，结扎颈外动脉的分支甲状腺动脉、枕动脉及颈内动脉分支翼腭动脉，夹闭颈总动脉，颈外动脉远端结扎。套管针经颈外动脉向颈内动脉注入同种动物全血干粉配成的2.5%血悬浊液0.5 ml，结扎颈外动脉。实验对照组于术后4 h取材。实验组术后立即经颈内动脉注入NGF 500 BU、Svate-3 0.125 U，术后4 h取材(NGF及Svate-3由大连司威特公司提供)。
1.2.2 组化标本制备及染色：按预定时间处死各组动物，常规心脏灌注固定取脑，切成冠状薄组织块，放入30%蔗糖磷酸缓冲液中4℃过夜，待组织块下沉后，经OCT包埋，入-23℃恒冷箱切片机，制成16 μm厚冠状连续切片，-70℃保存备用。按组织化学手册进行尼氏染色，切片入甲苯胺蓝孵育液，常规水洗，系列脱水，中性树胶封片。
, 百拇医药
1.2.3 透射电镜标本制备：各组动物在1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉下，用含1%肝素钠生理盐水200 ml快速冲洗后，用2%多聚甲醛及2.5%戊二醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液250 ml灌流固定，灌流后立即取脑，参照包新民大鼠脑图谱切取枕叶组织块置于4℃，2.5%戊二醛中固定24 h，经1%锇酸固定1 h后，常规脱水Epon 812包埋，L.K.B超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅双重染色，日立H-600透射电镜观察并拍片。
1.2.4 还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH-d)组织化学染色：将制备好的冰冻切片吹干，按下列步骤进行NOS组织化学反应：(1) 用0.1 mol/L PBS(pH 7.4)彻底漂洗切片；(2) 在0.2% Triton X-100磷酸缓冲液中预孵育5～10 min(室温)；(3) 在下列孵育液中反应2 h(37℃)：NADPH-d 10 mg，四硝基唑蓝(NBT)5 mg，Triton-100 0.03 ml，用0.1 mol/L PBS(pH7.4)新鲜配制成10ml；(4) 用PBS终止反应，并漂洗，1 min×3次；(5) 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。
, 百拇医药
1.3 显微图像定量分析
用Luzex-F显微图像分析仪测定纹旁区单位面积NOS阳性细胞、纤维的平均灰度值及NOS阳性反应物密度。数据经统计学处理，以X±s表示。
2 结果
2.1 尼氏染色和透射电镜结果
尼氏染色切片上，正常对照组纹旁区神经元胞质着蓝色，数量较多,排列紧密,形态完整，胞浆内尼氏体丰富。实验对照组细胞数量减少，排列紊乱，细胞肿胀或皱缩，坏死崩解。电镜下实验对照组纹旁区神经元呈现核皱缩，核膜断裂，突触融合或间隙增大，数量减少，突触小泡聚集或消失，线粒体肿大，高尔基复合体扩张，内质网扩张，脱颗粒等改变。尼氏染色和透射电镜结果证明MCI动物模型制备成功。
2.2 NADPH-d组织化学染色结果
, 百拇医药
正常大鼠纹旁区内存在着丰富的NOS阳性神经纤维。NOS阳性神经元呈疏散分布，为锥体细胞，阳性反应物呈深蓝色，分布于胞质和突起，胞核不着色，有的细胞有较长的串珠样突起。与正常对照组比较，实验对照组NOS阳性反应产物大量减少(P<0.01)，细胞形态各异，大小不同，纤维变细，且隐约可见血管走行。实验组NOS阳性反应产物比实验对照组明显增加(P<0.01)且比正常对照组也有所增加。
MCI时纹旁区实验组NOS阳性反应物的平均灰度值比实验对照组明显降低。实验组NOS阳性反应物的密度比实验对照组明显增加，见表1。
表1 MCI大鼠纹旁区NOS阳性反应物密度及X
平均灰度值各组间的比较
Tab.1 Comparison of the density and the average grey
, 百拇医药
value of NOS positive reactive product in parastriate
area neurons of MCI rats with those in controls
组 别
场面积
(X±sXμm2)
密 度
(X±sX， %)
平均灰度值
(X±s)
正常对照组
, 百拇医药
309316±15775
35.3±1.8
115.8±10.2
实验对照组
231495±10344
26.4±1.2*
149.1±11.3*
实 验 组
446119±18142
50.9±2.1**
87.3±7.2**
, 百拇医药
* 与正常对照组比较P<0.01； ** 与实验对照组比较P<0.01
3 讨论
本实验中，MCI时纹旁区NOS阳性反应物的密度和含量比正常对照组明显减少，而应用NGF和Svate-3后NOS阳性反应物的密度和含量比实验对照组明显增多, 这一实验结果未见有关文献报道。NO是近年来发现的一种特殊活性物质，与其合酶广泛存在于中枢神经系统中，并参与神经传导和脑血流的调节。NOS是NO生物合成的限速酶，通过检测NOS可以反映NO的水平。据报道，在成年猫视觉通路中，视网膜、上丘以及皮层中均存在NOS阳性神经元[1]，外侧膝状体中虽不存在NOS阳性神经元，却存在丰富的NOS阳性纤维，提示NO在视觉功能中可能起重要作用。本研究证明纹旁区内有NOS阳性反应细胞和纤维，提示纹旁区内的NO也可能与视觉功能有关。本实验中NOS阳性神经元多为锥体细胞，这与猫视皮层中NOS阳性神经元均为非锥体细胞[2]不甚一致，这可能是由于动物种属不同的原因。
, http://www.100md.com
NGF 通过作用于靶细胞表面的特异性受体，具有维持神经元存活，参与神经元损伤修复等作用，并能通过血脑屏障且在海马和皮层内含量最高。有研究表明，在动物虹膜、视神经、猕猴视皮层均含有NGF[3]。 Carmingnoto[4]在视网膜节细胞、外侧膝状体、视皮层发现NGF受体及其mRNA的表达。可见，NGF与视觉传导神经元有密切关系。Svate-3是有效的溶栓剂，有实验证明给予Svate-3 1 h后即有溶栓效果。NGF和Svate-3联合应用使MCI时纹旁旁区NOS反应物增多，是由于NGF对受损神经元的修复作用，还是直接作用于NOS，尚需进一步探讨。
本实验结果中，NGF与Svate-3联合使用，使MCI大鼠纹旁区NOS阳性反应物增加，提示NGF和Svate-3对MCI有一定的治疗作用，为NGF和Svate-3的临床应用提供实验依据。
辽宁省自然科学基金资助项目，619019
, 百拇医药
刘晓湘(中国医科大学基础医学院解剖学教研室，沈阳 110001)
李东培(中国医科大学基础医学院解剖学教研室，沈阳 110001)
方秀斌(中国医科大学基础医学院解剖学教研室，沈阳 110001)
高杰(中国医科大学基础医学院解剖学教研室，沈阳 110001)
参考文献
1，Mizukawa K, Vincent SR, McGeer PL, et al. Distribution of reduced-nicotinamide-adenine-dinucleotide-phosphate diaphorase-positive cells and fibers in the cat central nervous system. J Comp Neurol, 1989, 279(2), 281-311
, http://www.100md.com
2，Cudeiro J, Rivadulla C, Rodrignez R, et al. Application of L-Arg and L-No-Arg modify cellular responses in the primary visual cortex of the cat. Soc Neurosci Abstr, 1995,21: 1653
3，Hayashi M, Yamashita A, Shimizu K. Nerve growth factor in the primate central nervous system: regional distribution and ontogeny. Neuroscience, 1990, 36(3): 683-689
4，Carmignoto G, Comelli MC, Candeo P, et al. Expression of NGF receptor and NGF receptor mRNA in the developing and adult rat retina. Exp Neurol, 1991, 111(3): 302-311, 百拇医药
摘 要 目的：探讨多发性脑梗塞(MCI)大鼠纹旁区一氧化氮合酶(NOS)的变化及神经生长因子(NGF)和精制蝮蛇抗栓酶3号(Svate-3)联合应用对MCI大鼠纹旁区的作用。方法: 选用Wistar大鼠, 应用微栓子栓塞阻断法建立多发性脑梗塞性缺血模型, 用NADPH-d组化方法、透射电镜技术并结合显微图像分析技术。结果: 实验组NOS阳性反应物平均灰度值与实验对照组比较明显降低(P<0.01)。结论: NGF和Svate-3联合应用可使MCI大鼠纹旁区NOS阳性反应物明显增多, 对MCI有一定的治疗作用。
关键词：多发性脑梗塞 神经生长因子 精制蝮蛇抗栓酶3号 纹旁区 一氧化氮合酶 大鼠
纹旁区接受从大脑皮质17区发来的冲动并与其他皮质和丘脑枕有往返的联系，对感知、整合视觉信息有重要作用，且含有一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)阳性神经元胞体和纤维。但多发性脑梗塞(multiple cerebral infarction，MCI)时纹旁区NOS阳性反应物是否有变化，尚未见有文献报道。作者联合应用神经生长因子(nerve growth factor, NGF)和Svate-3，观察MCI大鼠纹旁区NOS的变化，旨在探讨二者对MCI大鼠纹旁区的作用，为临床治疗MCI提供新的理论依据。
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1 材料与方法
1.1 实验动物分组
本实验选用雄性Wistar大鼠24只，体重220～280 g，随机分成3组：正常对照组、实验对照组和实验组各8只。
1.2 实验方法
1.2.1 模型制备：1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，颈部侧切口，暴露分离左侧颈内、外动脉，结扎颈外动脉的分支甲状腺动脉、枕动脉及颈内动脉分支翼腭动脉，夹闭颈总动脉，颈外动脉远端结扎。套管针经颈外动脉向颈内动脉注入同种动物全血干粉配成的2.5%血悬浊液0.5 ml，结扎颈外动脉。实验对照组于术后4 h取材。实验组术后立即经颈内动脉注入NGF 500 BU、Svate-3 0.125 U，术后4 h取材(NGF及Svate-3由大连司威特公司提供)。
1.2.2 组化标本制备及染色：按预定时间处死各组动物，常规心脏灌注固定取脑，切成冠状薄组织块，放入30%蔗糖磷酸缓冲液中4℃过夜，待组织块下沉后，经OCT包埋，入-23℃恒冷箱切片机，制成16 μm厚冠状连续切片，-70℃保存备用。按组织化学手册进行尼氏染色，切片入甲苯胺蓝孵育液，常规水洗，系列脱水，中性树胶封片。
, 百拇医药
1.2.3 透射电镜标本制备：各组动物在1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉下，用含1%肝素钠生理盐水200 ml快速冲洗后，用2%多聚甲醛及2.5%戊二醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液250 ml灌流固定，灌流后立即取脑，参照包新民大鼠脑图谱切取枕叶组织块置于4℃，2.5%戊二醛中固定24 h，经1%锇酸固定1 h后，常规脱水Epon 812包埋，L.K.B超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅双重染色，日立H-600透射电镜观察并拍片。
1.2.4 还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH-d)组织化学染色：将制备好的冰冻切片吹干，按下列步骤进行NOS组织化学反应：(1) 用0.1 mol/L PBS(pH 7.4)彻底漂洗切片；(2) 在0.2% Triton X-100磷酸缓冲液中预孵育5～10 min(室温)；(3) 在下列孵育液中反应2 h(37℃)：NADPH-d 10 mg，四硝基唑蓝(NBT)5 mg，Triton-100 0.03 ml，用0.1 mol/L PBS(pH7.4)新鲜配制成10ml；(4) 用PBS终止反应，并漂洗，1 min×3次；(5) 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。
, 百拇医药
1.3 显微图像定量分析
用Luzex-F显微图像分析仪测定纹旁区单位面积NOS阳性细胞、纤维的平均灰度值及NOS阳性反应物密度。数据经统计学处理，以X±s表示。
2 结果
2.1 尼氏染色和透射电镜结果
尼氏染色切片上，正常对照组纹旁区神经元胞质着蓝色，数量较多,排列紧密,形态完整，胞浆内尼氏体丰富。实验对照组细胞数量减少，排列紊乱，细胞肿胀或皱缩，坏死崩解。电镜下实验对照组纹旁区神经元呈现核皱缩，核膜断裂，突触融合或间隙增大，数量减少，突触小泡聚集或消失，线粒体肿大，高尔基复合体扩张，内质网扩张，脱颗粒等改变。尼氏染色和透射电镜结果证明MCI动物模型制备成功。
2.2 NADPH-d组织化学染色结果
, 百拇医药
正常大鼠纹旁区内存在着丰富的NOS阳性神经纤维。NOS阳性神经元呈疏散分布，为锥体细胞，阳性反应物呈深蓝色，分布于胞质和突起，胞核不着色，有的细胞有较长的串珠样突起。与正常对照组比较，实验对照组NOS阳性反应产物大量减少(P<0.01)，细胞形态各异，大小不同，纤维变细，且隐约可见血管走行。实验组NOS阳性反应产物比实验对照组明显增加(P<0.01)且比正常对照组也有所增加。
MCI时纹旁区实验组NOS阳性反应物的平均灰度值比实验对照组明显降低。实验组NOS阳性反应物的密度比实验对照组明显增加，见表1。
表1 MCI大鼠纹旁区NOS阳性反应物密度及X
平均灰度值各组间的比较
Tab.1 Comparison of the density and the average grey
, 百拇医药
value of NOS positive reactive product in parastriate
area neurons of MCI rats with those in controls
组 别
场面积
(X±sXμm2)
密 度
(X±sX， %)
平均灰度值
(X±s)
正常对照组
, 百拇医药
309316±15775
35.3±1.8
115.8±10.2
实验对照组
231495±10344
26.4±1.2*
149.1±11.3*
实 验 组
446119±18142
50.9±2.1**
87.3±7.2**
, 百拇医药
* 与正常对照组比较P<0.01； ** 与实验对照组比较P<0.01
3 讨论
本实验中，MCI时纹旁区NOS阳性反应物的密度和含量比正常对照组明显减少，而应用NGF和Svate-3后NOS阳性反应物的密度和含量比实验对照组明显增多, 这一实验结果未见有关文献报道。NO是近年来发现的一种特殊活性物质，与其合酶广泛存在于中枢神经系统中，并参与神经传导和脑血流的调节。NOS是NO生物合成的限速酶，通过检测NOS可以反映NO的水平。据报道，在成年猫视觉通路中，视网膜、上丘以及皮层中均存在NOS阳性神经元[1]，外侧膝状体中虽不存在NOS阳性神经元，却存在丰富的NOS阳性纤维，提示NO在视觉功能中可能起重要作用。本研究证明纹旁区内有NOS阳性反应细胞和纤维，提示纹旁区内的NO也可能与视觉功能有关。本实验中NOS阳性神经元多为锥体细胞，这与猫视皮层中NOS阳性神经元均为非锥体细胞[2]不甚一致，这可能是由于动物种属不同的原因。
, http://www.100md.com
NGF 通过作用于靶细胞表面的特异性受体，具有维持神经元存活，参与神经元损伤修复等作用，并能通过血脑屏障且在海马和皮层内含量最高。有研究表明，在动物虹膜、视神经、猕猴视皮层均含有NGF[3]。 Carmingnoto[4]在视网膜节细胞、外侧膝状体、视皮层发现NGF受体及其mRNA的表达。可见，NGF与视觉传导神经元有密切关系。Svate-3是有效的溶栓剂，有实验证明给予Svate-3 1 h后即有溶栓效果。NGF和Svate-3联合应用使MCI时纹旁旁区NOS反应物增多，是由于NGF对受损神经元的修复作用，还是直接作用于NOS，尚需进一步探讨。
本实验结果中，NGF与Svate-3联合使用，使MCI大鼠纹旁区NOS阳性反应物增加，提示NGF和Svate-3对MCI有一定的治疗作用，为NGF和Svate-3的临床应用提供实验依据。
辽宁省自然科学基金资助项目，619019
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刘晓湘(中国医科大学基础医学院解剖学教研室，沈阳 110001)
李东培(中国医科大学基础医学院解剖学教研室，沈阳 110001)
方秀斌(中国医科大学基础医学院解剖学教研室，沈阳 110001)
高杰(中国医科大学基础医学院解剖学教研室，沈阳 110001)
参考文献
1，Mizukawa K, Vincent SR, McGeer PL, et al. Distribution of reduced-nicotinamide-adenine-dinucleotide-phosphate diaphorase-positive cells and fibers in the cat central nervous system. J Comp Neurol, 1989, 279(2), 281-311
, http://www.100md.com
2，Cudeiro J, Rivadulla C, Rodrignez R, et al. Application of L-Arg and L-No-Arg modify cellular responses in the primary visual cortex of the cat. Soc Neurosci Abstr, 1995,21: 1653
3，Hayashi M, Yamashita A, Shimizu K. Nerve growth factor in the primate central nervous system: regional distribution and ontogeny. Neuroscience, 1990, 36(3): 683-689
4，Carmignoto G, Comelli MC, Candeo P, et al. Expression of NGF receptor and NGF receptor mRNA in the developing and adult rat retina. Exp Neurol, 1991, 111(3): 302-311, 百拇医药