耐药基因TopoⅡ在肺癌中表达与预后的研究
孙丽梅 朱继江 王恩华 邱雪杉
摘 要 目的：明确非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer, NSCLC)中TopoⅡ表达与组织类型、细胞分化程度、TNM分期是否相关；是否影响NSCLC患者的预后。方法：采用S-P免疫组化方法，检测97例化疗前NSCLC患者中TopoⅡ的表达情况。结果：TopoⅡ在鳞癌中高表达；且影响患者预后。结论：NSCLC中存在着原发耐药；TopoⅡ表达是NSCLC患者预后的影响因素之一。
关键词：非小细胞肺癌 拓扑异构酶Ⅱ 预后 S-P免疫组化方法
拓扑异构酶Ⅱ (topoisomerase Ⅱ, TopoⅡ)介导的耐药，称为不典型多药耐药(atypical MDR, at-MDR)。Topo是DNA复制时必需的酶，催化单链或双链DNA短暂的断裂分离以利复制。Topo抑制剂(抗癌药)可抑制DNA复制。当基因突变时，抗癌药物不能与其结合，而产生耐药[1]。本实验采用高敏感的S-P免疫组化方法，对大样本的实体肿瘤—非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer, NSCLC)中耐药基因TopoⅡ的表达进行研究，为临床制定个体化疗方案提供有益的信息。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 收集中国医科大学第一临床学院外科病理室 1978年1月～1994年12月手术切除原发性肺癌标本，经常规福尔马林固定，石蜡包埋，挑选有完整随访记录和TNM分期且术后均采用化疗的病例97例。其中鳞癌55例(高分化10例，中分化21例，低分化24例)，腺癌39例(高分化12例，中分化14例，低分化13例)，大细胞癌3例。年龄27～78岁。生存期的计算是从手术日期起到随访日期或由于复发、转移而死亡的日期为止。
1.2 免疫组化方法 将标本制成 4 μm的连续切片，经脱蜡、脱苯、水化后，采用福州迈新公司生产的即用型S-P免疫组化试剂盒进行染色，其中TopoⅡ单克隆抗体经高压锅抗原修复，4℃冰箱过夜。阴性对照采用PBS液代替一抗，其它步骤不变。
1.3 结果判定标准及统计学分析 每张切片都选较好的5个视野，计数500个癌细胞中TopoⅡ染色的核阳性数。细胞核无着色定为阴性。将阳性反应按阳性瘤细胞占全部细胞的百分比分为4个等级：<25%为+；26%～50%为
；51%～75%为
；>76%为
。其中统计学分析中以着色细胞超过25%为免疫组化反应阳性，<25%为阴性。
, 百拇医药
统计学分析采用SAS软件进行χ2检验、t检验。
2 结果
TopoⅡ主要在细胞核内表达，阳性反应细胞呈局灶性，在周围正常肺组织胞浆或胞核无一着色(见图1)。TopoⅡ的总阳性率为65.96%，其表达与NSCLC的组织类型相关(见表1)；与细胞分化程度及TNM 分期均无统计学意义。TopoⅡ阳性表达者平均生存时间大于阴性表达病例(P<0.05)，见表2。
图1 肺鳞癌癌细胞核中TopoⅡ的阳性表达 SP ×400
Figure 1 Squamous cell carcinoma of the lung showing positive reaction in nuclear
, 百拇医药
of carcinoma cells by TopoⅡ monoclonal antibody. Streptavidin peroxidase conjugated method ×400
表1 TopoⅡ 在NSCLC中表达与组织类型关系
Table 1 Relationship between histological
type and expression of TopoⅡ
组织类型
n
+
-
阳性率(%)
, 百拇医药
鳞癌
55
41
14
74.55*
腺癌
39
21
18
53.85*
大细胞癌
3
2
, 百拇医药
1
33.33*
注：百分数(阳性例/总例数) * P<0.05 表2 TopoⅡ 表达与NSCLC术后平均
生存时间关系(X±s)
Table 2 Expression of TopoⅡ and patients'
survival after tumor resection
表达
n
生存时间(d)
-
, 百拇医药
19
751.58±683.77*
+
13
1098.46±1038.84
28
1487.14±1214.92*
24
1123.75±1132.98
, 百拇医药
10
1060.00±1135.75
* P<0.05
3 讨论
实验证明，某些耐药肿瘤细胞内药物聚集总量并无减少，亦无P-gp的过量表达，而是与细胞内酶的改变或DNA修复机制等有关，故提出at-MDR概念，并认为at-MDR出现可能是由于药物识别(结合)部位、ATP消耗、TopoⅡ数量和分布、磷酸化等的改变所引起的，其中TopoⅡ在耐药中的作用更为突出[2]。
Eijdems等用人NSCLC细胞系SW-1573分析TopoⅡ的变化与肺癌MDR的关系，发现在耐药细胞中TopoⅡ数量减少和活性减低，推测肺癌MDR的产生与TopoⅡ数量减少和(或)活性降低有关[3]。虽然TopoⅡ表达与耐药关系密切，但目前的研究主要集中于体外细胞观察，对体内或临床上的TopoⅡ表达与肿瘤耐药关系则报道不多。本实验检测97例未经化疗的NSCLC患者TopoⅡ表达情况，其结果TopoⅡ是在鳞癌中高表达(χ2＝4.35， P<0.05)，符合鳞癌对化疗药物敏感的现象，进一步表明TopoⅡ表达与耐药关系密切。TopoⅡ表达对预后有影响，其阳性表达者平均生存时间大于阴性表达病例，这表明TopoⅡ在评价预后方面也起重要作用。
, 百拇医药
孙丽梅(中国医科大学基础医学院病理学教研室，沈阳 110001)
朱继江(中国医科大学基础医学院病理学教研室，沈阳 110001)
王恩华(中国医科大学基础医学院病理学教研室，沈阳 110001)
邱雪杉(中国医科大学基础医学院病理学教研室，沈阳 110001)
参考文献
1，De Jong S, Kooistra AJ, De Vries E, et al. Topoisomerase Ⅱ as a target of VM-26 and 4'-(9-Acridinylamino) methanesulfonm-aniside in atypical umltidrug resistant human small cell lung carcinoma cells. Cancer Res, 1993, 53(5): 1064-1071
, 百拇医药
2，Cole SPC, Chanda ER, Dicke FP, et al. Non-P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in a small cell lung cancer cell line: evidence for decreased susceptibility to drug-induced DNA damage and reduced levels of topoisomerase Ⅱ. Cancer Res, 1991, 51(13): 3345-3352
3，Eijdems EW, De Haas M, Timmerman AJ, et al. Reduced topoisomerase Ⅱ activity in multidrug-resistant human non-small-cell lung cancer cell lines. Br J Cancer, 1995, 71(1): 40-47, http://www.100md.com
摘 要 目的：明确非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer, NSCLC)中TopoⅡ表达与组织类型、细胞分化程度、TNM分期是否相关；是否影响NSCLC患者的预后。方法：采用S-P免疫组化方法，检测97例化疗前NSCLC患者中TopoⅡ的表达情况。结果：TopoⅡ在鳞癌中高表达；且影响患者预后。结论：NSCLC中存在着原发耐药；TopoⅡ表达是NSCLC患者预后的影响因素之一。
关键词：非小细胞肺癌 拓扑异构酶Ⅱ 预后 S-P免疫组化方法
拓扑异构酶Ⅱ (topoisomerase Ⅱ, TopoⅡ)介导的耐药，称为不典型多药耐药(atypical MDR, at-MDR)。Topo是DNA复制时必需的酶，催化单链或双链DNA短暂的断裂分离以利复制。Topo抑制剂(抗癌药)可抑制DNA复制。当基因突变时，抗癌药物不能与其结合，而产生耐药[1]。本实验采用高敏感的S-P免疫组化方法，对大样本的实体肿瘤—非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer, NSCLC)中耐药基因TopoⅡ的表达进行研究，为临床制定个体化疗方案提供有益的信息。
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1 材料与方法
1.1 材料 收集中国医科大学第一临床学院外科病理室 1978年1月～1994年12月手术切除原发性肺癌标本，经常规福尔马林固定，石蜡包埋，挑选有完整随访记录和TNM分期且术后均采用化疗的病例97例。其中鳞癌55例(高分化10例，中分化21例，低分化24例)，腺癌39例(高分化12例，中分化14例，低分化13例)，大细胞癌3例。年龄27～78岁。生存期的计算是从手术日期起到随访日期或由于复发、转移而死亡的日期为止。
1.2 免疫组化方法 将标本制成 4 μm的连续切片，经脱蜡、脱苯、水化后，采用福州迈新公司生产的即用型S-P免疫组化试剂盒进行染色，其中TopoⅡ单克隆抗体经高压锅抗原修复，4℃冰箱过夜。阴性对照采用PBS液代替一抗，其它步骤不变。
1.3 结果判定标准及统计学分析 每张切片都选较好的5个视野，计数500个癌细胞中TopoⅡ染色的核阳性数。细胞核无着色定为阴性。将阳性反应按阳性瘤细胞占全部细胞的百分比分为4个等级：<25%为+；26%～50%为
；51%～75%为；>76%为。其中统计学分析中以着色细胞超过25%为免疫组化反应阳性，<25%为阴性。, 百拇医药
统计学分析采用SAS软件进行χ2检验、t检验。
2 结果
TopoⅡ主要在细胞核内表达，阳性反应细胞呈局灶性，在周围正常肺组织胞浆或胞核无一着色(见图1)。TopoⅡ的总阳性率为65.96%，其表达与NSCLC的组织类型相关(见表1)；与细胞分化程度及TNM 分期均无统计学意义。TopoⅡ阳性表达者平均生存时间大于阴性表达病例(P<0.05)，见表2。
图1 肺鳞癌癌细胞核中TopoⅡ的阳性表达 SP ×400
Figure 1 Squamous cell carcinoma of the lung showing positive reaction in nuclear
, 百拇医药
of carcinoma cells by TopoⅡ monoclonal antibody. Streptavidin peroxidase conjugated method ×400
表1 TopoⅡ 在NSCLC中表达与组织类型关系
Table 1 Relationship between histological
type and expression of TopoⅡ
组织类型
n
+
-
阳性率(%)
, 百拇医药
鳞癌
55
41
14
74.55*
腺癌
39
21
18
53.85*
大细胞癌
3
2
, 百拇医药
1
33.33*
注：百分数(阳性例/总例数) * P<0.05 表2 TopoⅡ 表达与NSCLC术后平均
生存时间关系(X±s)
Table 2 Expression of TopoⅡ and patients'
survival after tumor resection
表达
n
生存时间(d)
-
, 百拇医药
19
751.58±683.77*
+
13
1098.46±1038.84
28
1487.14±1214.92*
24
1123.75±1132.98
, 百拇医药
10
1060.00±1135.75
* P<0.05
3 讨论
实验证明，某些耐药肿瘤细胞内药物聚集总量并无减少，亦无P-gp的过量表达，而是与细胞内酶的改变或DNA修复机制等有关，故提出at-MDR概念，并认为at-MDR出现可能是由于药物识别(结合)部位、ATP消耗、TopoⅡ数量和分布、磷酸化等的改变所引起的，其中TopoⅡ在耐药中的作用更为突出[2]。
Eijdems等用人NSCLC细胞系SW-1573分析TopoⅡ的变化与肺癌MDR的关系，发现在耐药细胞中TopoⅡ数量减少和活性减低，推测肺癌MDR的产生与TopoⅡ数量减少和(或)活性降低有关[3]。虽然TopoⅡ表达与耐药关系密切，但目前的研究主要集中于体外细胞观察，对体内或临床上的TopoⅡ表达与肿瘤耐药关系则报道不多。本实验检测97例未经化疗的NSCLC患者TopoⅡ表达情况，其结果TopoⅡ是在鳞癌中高表达(χ2＝4.35， P<0.05)，符合鳞癌对化疗药物敏感的现象，进一步表明TopoⅡ表达与耐药关系密切。TopoⅡ表达对预后有影响，其阳性表达者平均生存时间大于阴性表达病例，这表明TopoⅡ在评价预后方面也起重要作用。
, 百拇医药
孙丽梅(中国医科大学基础医学院病理学教研室，沈阳 110001)
朱继江(中国医科大学基础医学院病理学教研室，沈阳 110001)
王恩华(中国医科大学基础医学院病理学教研室，沈阳 110001)
邱雪杉(中国医科大学基础医学院病理学教研室，沈阳 110001)
参考文献
1，De Jong S, Kooistra AJ, De Vries E, et al. Topoisomerase Ⅱ as a target of VM-26 and 4'-(9-Acridinylamino) methanesulfonm-aniside in atypical umltidrug resistant human small cell lung carcinoma cells. Cancer Res, 1993, 53(5): 1064-1071
, 百拇医药
2，Cole SPC, Chanda ER, Dicke FP, et al. Non-P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in a small cell lung cancer cell line: evidence for decreased susceptibility to drug-induced DNA damage and reduced levels of topoisomerase Ⅱ. Cancer Res, 1991, 51(13): 3345-3352
3，Eijdems EW, De Haas M, Timmerman AJ, et al. Reduced topoisomerase Ⅱ activity in multidrug-resistant human non-small-cell lung cancer cell lines. Br J Cancer, 1995, 71(1): 40-47, http://www.100md.com