体外免疫法制备狗脾抗结核特异性转移因子的实验研究
作者：杨卉 王倩 齐志敏
单位：杨卉 王倩(山东省烟台市台山医院药剂科 264000)；王化洲 齐志敏(锦州医学院药理教研室王化洲)
关键词：特异性转移因子；体外免疫；狗脾淋巴细胞；卡介苗
中国现代医学杂志000907 目的：本实验旨在探索体外细胞免疫的可行性，即脾淋巴细胞与卡介苗 在体外培养条件下能否使淋巴细胞致敏，产生抗结核特异性转移因子(STFTB)。方法 ：采用狗脾淋巴细胞与卡介苗共同孵育培养，收集培养后的细胞，用超声粉碎法破碎 细胞，中空纤维超滤器超滤，收集超滤液即为狗脾抗结核特异性转移因子(CS-STFTB) 。 对该制剂进行理化指标及相关的免疫学试验。结果：该制剂为淡黄色澄清黄色澄清透明液体 ，多肽含量1.03mg/ml，核糖含量87μg/ml。蛋白质反应(-)。紫外最大吸收峰在258nm，E26 0nm/280nm为2.667。CS-STFTB与白细胞、PPD共同孵育数减低。能够拮抗HC引 起的 吞噬功能下降。结论：用体外免疫法制备的CS-STFTB符合转移因子制检标准，可提 高机体的特异性和非特异性免疫功能。
, 百拇医药
分类号 R392-33
STUDY ON ANTI-TUBERCULOSIS SPECIFIC TRANSFER FACTOR MADE FROM CANINE SPLEEN CELLS BY IMMUNIZATION IN VITRO
Yang Hui Wang Huazhou Qi Zhimin
(Department of Pharmacology, Jinzhou Medical College, Jinzhou 121001)
Abstract:In the research, the canice spleen cells were immun ized with BCG in vi tro collected by centrifugation, pulverized by ultrasonic pulverizer and ultrafi ltrated by fiber ultrafilter. The liquid we got was the Anti-Tuberculosis Specif ic Transfer Factor solution. Then we did a series of experiments to judge its bi ochemical and immune qualities. The solution was yellow and transparent. The con centration of peptide and ribose is 1.03 milligram per milliliter and 87 ug per milliliter respectively. The protein reaction was negative. The peak detection o f ultraviolet ray was 258 nm. Delayed Type Hypersensitivity (DTH) test showed th at the mice immunized with CS-STFTB had delayed type hypersensitivity to PPD. Le ukocyte Adhesion Inhibition test showed that the white cells incubated with CS-S TFTB and PPD could result in a significant adhesion inhibition. In the test to c ounteract the immunity inhibition caused by hydrocortisone, CS-STFTB could signi ficantly counteract the effect of hydrocortisone. All experimental results come to the following conclusion that immunization in vitro is a practical way to sti mulate leukocytes to produce CS-STFTB.
, 百拇医药
Key words:Specific Transfer Factor; Immunization in Vitro; Cani ne Spleen Cells; BCG
自从1949年Lawrence[1]发现白细胞可透析的裂解产物-- 转移因子(Transfer Factor,TF)具有转移细胞免疫的能力，转移因子得到广泛重视。由于转 移因子无种属特异性，无抗原性，临床应用无明显副作用，因此临床广泛应用于一些细胞免 疫功能低下，有细菌或病毒感染的患者[2]，改善他们的免疫水平，达到治疗疾病 的目的。临床应用表明，特异性转移因子(Specific Transfer Factor,STF)的疗效优于非特 异性转移因子(Non-specific Transfer Factor,NTF)。
通常人们用体内免疫法制备STF。本实验采用体外免疫法，即卡介苗(Bacilli Calmetre Gue rin,BCG)与淋巴细胞共同培养，使淋巴细胞致敏，细胞经超声粉碎后超滤，制备CS-STF TB。
, http://www.100md.com
本实验的目的在于探讨体外细胞免疫的可能性，为生产特异性转移因子提供一种新方法。
1 方法
1.1 CS-STFTB制备
取健康狗脾，在无菌条件下剪成约10mm3小块，轻轻研磨，过100目钢筛，离心，弃上清 ，用1640培 养液配成4～10×105/ml的脾淋巴细胞悬液，在37℃，5%CO2条件下培养5～7d， 超声粉碎细胞，用截留分子量10000Dalton的中空纤维超滤柱超滤，滤液经0.2μm微 孔膜滤过除菌后分装，保存在4℃冰箱中备用。
1.2 理化指标检测
1.2.1 多肽含量测定(Folin-酚试剂法) 以牛血清白蛋白为标准品，作标 准曲线，用UV-1601紫外分光光度计在波长500nm处测OD值，换算出多肽含量。
, 百拇医药
1.2.2 核糖含量测定 按生物制品规程[3]规定方法进行含量测 定。
1.2.3 蛋白质反应 取1ml CS-STFTB，加入20%磺基水杨酸试剂1m l，观察有无絮状沉淀物形成。
1.2.4 紫外分光光度计扫描 测定最大吸收峰。
1.3 白细胞粘附抑制试验(LAI试验)
试验分为PPD组，CS-STFTB组，CS-STFTB组+PPD组，NTF+PPD组。每组分别 加入白细胞悬液0.05ml放入CO2培养箱内37℃孵育2h。
1.4 CS-STFTB拮抗氢化可的松(HC)的免疫抑制作用
, 百拇医药
取20g左右小白鼠30只，雌雄各半，随机分为3组。HC组：HC肌注100μg/只，1次/d，连续7d 。HC+CS-STFTB(im)组：HC用法同上，但从第2天起开始肌注CS-STFTB0.5m l/只，1次/2d，共3次。HC+CS-SFTTB(po)组：HC用法同上，CS-STFTB改 为灌胃，余用法同上。各组在试验给药前及末次给药后分别称重，剪尾取血，计算T淋巴细 胞百分数(ANAE[3]法)。
1.5 测脾重指数
依次称取各组小鼠脾重与体重，脾重指数=脾重/体重×100%。
1.6 小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能试验
, http://www.100md.com
每鼠腹腔注射5%鸡红细胞0.4ml，7h后动物脱颈椎处死，经腹腔注入生理盐水2ml。抽取腹腔 洗液1ml，滴涂于干净载玻片上，4%Giemsa-Wright染液染色，按下式计算吞噬指数 及吞噬百分数。
2 结果
2.1 理化指标检测结果
该制剂为淡黄色、澄清透明液体。多肽含量1.03mg/ml，核糖含量87μg/ml，蛋白质反 应阴性，最高吸收峰258nm，OD值等于3.5，E260nm/280nm为2.667。
2.2 白细胞粘附抑制(LAI)试验
表1 白细胞粘附抑制试验 (%，
±s) 组别
, http://www.100md.com
未粘附率
PPD组
42.5±17.6*
CS-TFTB组
34.9±13.2*
CS-TFTB+PPD组
85.9±11.6
NTF+PPD组
29.3±9.6*
注：各组分别与CS-TFTB+PPD组比较均P<0.001
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结果表明CS-STFTB具有针对PPD的LAI效应，说明CS-STFTB的LA I效应具有抗原依赖性。
2.3 CS-STFTB拮抗HC免疫抑制作用
表2 CS-TFTB对HC免疫抑制作用的影响 (±s，%) 组别
T细胞
脾重指数
给药前
给药后
HC组
, http://www.100md.com 55.1±23.6
32.6±6.9
0.38±0.15
HC+CS-STFTB(im)组
46.7±15.8
47.7±10.3
0.53±0.11
HC+CS-STFTB(po)组
53.3±5.8
51.9±6.7
, 百拇医药
0.68±0.16
注： HC+CS-STFTBim组、HC+CS-STFTBpo组分别与HC组比较P<0.05
结果表明灌胃与肌注CS-TFTB均可阻断HC引起的免疫抑制。
2.4 小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能试验
表3 CS-STFTB对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 (±s，%) 组别
吞噬百分率
吞噬指数
, 百拇医药
HC组
28.5±11.6
0.76±0.32
HC+CS-STFTB(im)组
46.2±21.4
1.28±0.47*
HC+CS-STFTB(po)组
57.5±17.7
1.97±0.72*
注：HC+CS-STFTB(im)组、HC+CS-STFTB(po)组分别与HC组比较P<0.05
, http://www.100md.com
结果表明，CS-STFTB无论采取灌胃或肌注给药，均可明显促进巨噬细胞的吞 噬功能。
3 讨论
目前，特异性转移因子的制备，主要是选取经天然免疫或人工免疫的供体(人或动物)的脾细 胞和白细胞，经反复冻融、透析制得。CS-STF是用卡介苗与狗脾淋巴细胞共同孵育，淋巴细 胞致敏后，超声粉碎细胞，超滤制得。本法制备CS-STF具有抗用量少、周期短(1周左右)、 节省动物、试验条件易于控制等优点，为针对特异抗原制备STF提供一条新的途径。
本实验采用目前较先进的超滤技术，它具有过滤速度较快，便于无菌处理的优点。且核糖含 量、E260nm/280nm比值均比透析产物为高。
由于结核病患者存在细胞免疫和体液免疫分离现象，细胞免疫功能低下[4]。近年 来研究表明，STF作为一种免疫调节剂确能转移细胞免疫反应。本实验证明了CS-STFT B能够有效地拮抗HC引起的免疫抑制，促进巨噬细胞的吞噬和消化能力，在结核病的防治 上可发挥一定作用。
, 百拇医药
辽宁省教育委员会资助课题
参考文献
1，Lawrence HS.A New phenomenonof immuen.Pro.Soci Exp Bilo Med,1949;7(15) :16
2，刘洪庆.转移因子的临床作用.泰安医学院学报，1990；11：314～317
3，于俊阁，管远志.陈诗书主编.T淋巴细胞ANAE染色法.上海：上海医科大学出版社 、现代医学出版社，1996：63～65
4，马学玉.肺结核临床免疫的研究现状.临床荟萃，1997；12(16)：723～726
2000-04-15收稿, 百拇医药
单位：杨卉 王倩(山东省烟台市台山医院药剂科 264000)；王化洲 齐志敏(锦州医学院药理教研室王化洲)
关键词：特异性转移因子；体外免疫；狗脾淋巴细胞；卡介苗
中国现代医学杂志000907 目的：本实验旨在探索体外细胞免疫的可行性，即脾淋巴细胞与卡介苗 在体外培养条件下能否使淋巴细胞致敏，产生抗结核特异性转移因子(STFTB)。方法 ：采用狗脾淋巴细胞与卡介苗共同孵育培养，收集培养后的细胞，用超声粉碎法破碎 细胞，中空纤维超滤器超滤，收集超滤液即为狗脾抗结核特异性转移因子(CS-STFTB) 。 对该制剂进行理化指标及相关的免疫学试验。结果：该制剂为淡黄色澄清黄色澄清透明液体 ，多肽含量1.03mg/ml，核糖含量87μg/ml。蛋白质反应(-)。紫外最大吸收峰在258nm，E26 0nm/280nm为2.667。CS-STFTB与白细胞、PPD共同孵育数减低。能够拮抗HC引 起的 吞噬功能下降。结论：用体外免疫法制备的CS-STFTB符合转移因子制检标准，可提 高机体的特异性和非特异性免疫功能。
, 百拇医药
分类号 R392-33
STUDY ON ANTI-TUBERCULOSIS SPECIFIC TRANSFER FACTOR MADE FROM CANINE SPLEEN CELLS BY IMMUNIZATION IN VITRO
Yang Hui Wang Huazhou Qi Zhimin
(Department of Pharmacology, Jinzhou Medical College, Jinzhou 121001)
Abstract:In the research, the canice spleen cells were immun ized with BCG in vi tro collected by centrifugation, pulverized by ultrasonic pulverizer and ultrafi ltrated by fiber ultrafilter. The liquid we got was the Anti-Tuberculosis Specif ic Transfer Factor solution. Then we did a series of experiments to judge its bi ochemical and immune qualities. The solution was yellow and transparent. The con centration of peptide and ribose is 1.03 milligram per milliliter and 87 ug per milliliter respectively. The protein reaction was negative. The peak detection o f ultraviolet ray was 258 nm. Delayed Type Hypersensitivity (DTH) test showed th at the mice immunized with CS-STFTB had delayed type hypersensitivity to PPD. Le ukocyte Adhesion Inhibition test showed that the white cells incubated with CS-S TFTB and PPD could result in a significant adhesion inhibition. In the test to c ounteract the immunity inhibition caused by hydrocortisone, CS-STFTB could signi ficantly counteract the effect of hydrocortisone. All experimental results come to the following conclusion that immunization in vitro is a practical way to sti mulate leukocytes to produce CS-STFTB.
, 百拇医药
Key words:Specific Transfer Factor; Immunization in Vitro; Cani ne Spleen Cells; BCG
自从1949年Lawrence[1]发现白细胞可透析的裂解产物-- 转移因子(Transfer Factor,TF)具有转移细胞免疫的能力，转移因子得到广泛重视。由于转 移因子无种属特异性，无抗原性，临床应用无明显副作用，因此临床广泛应用于一些细胞免 疫功能低下，有细菌或病毒感染的患者[2]，改善他们的免疫水平，达到治疗疾病 的目的。临床应用表明，特异性转移因子(Specific Transfer Factor,STF)的疗效优于非特 异性转移因子(Non-specific Transfer Factor,NTF)。
通常人们用体内免疫法制备STF。本实验采用体外免疫法，即卡介苗(Bacilli Calmetre Gue rin,BCG)与淋巴细胞共同培养，使淋巴细胞致敏，细胞经超声粉碎后超滤，制备CS-STF TB。
, http://www.100md.com
本实验的目的在于探讨体外细胞免疫的可能性，为生产特异性转移因子提供一种新方法。
1 方法
1.1 CS-STFTB制备
取健康狗脾，在无菌条件下剪成约10mm3小块，轻轻研磨，过100目钢筛，离心，弃上清 ，用1640培 养液配成4～10×105/ml的脾淋巴细胞悬液，在37℃，5%CO2条件下培养5～7d， 超声粉碎细胞，用截留分子量10000Dalton的中空纤维超滤柱超滤，滤液经0.2μm微 孔膜滤过除菌后分装，保存在4℃冰箱中备用。
1.2 理化指标检测
1.2.1 多肽含量测定(Folin-酚试剂法) 以牛血清白蛋白为标准品，作标 准曲线，用UV-1601紫外分光光度计在波长500nm处测OD值，换算出多肽含量。
, 百拇医药
1.2.2 核糖含量测定 按生物制品规程[3]规定方法进行含量测 定。
1.2.3 蛋白质反应 取1ml CS-STFTB，加入20%磺基水杨酸试剂1m l，观察有无絮状沉淀物形成。
1.2.4 紫外分光光度计扫描 测定最大吸收峰。
1.3 白细胞粘附抑制试验(LAI试验)
试验分为PPD组，CS-STFTB组，CS-STFTB组+PPD组，NTF+PPD组。每组分别 加入白细胞悬液0.05ml放入CO2培养箱内37℃孵育2h。
1.4 CS-STFTB拮抗氢化可的松(HC)的免疫抑制作用
, 百拇医药
取20g左右小白鼠30只，雌雄各半，随机分为3组。HC组：HC肌注100μg/只，1次/d，连续7d 。HC+CS-STFTB(im)组：HC用法同上，但从第2天起开始肌注CS-STFTB0.5m l/只，1次/2d，共3次。HC+CS-SFTTB(po)组：HC用法同上，CS-STFTB改 为灌胃，余用法同上。各组在试验给药前及末次给药后分别称重，剪尾取血，计算T淋巴细 胞百分数(ANAE[3]法)。
1.5 测脾重指数
依次称取各组小鼠脾重与体重，脾重指数=脾重/体重×100%。
1.6 小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能试验
, http://www.100md.com
每鼠腹腔注射5%鸡红细胞0.4ml，7h后动物脱颈椎处死，经腹腔注入生理盐水2ml。抽取腹腔 洗液1ml，滴涂于干净载玻片上，4%Giemsa-Wright染液染色，按下式计算吞噬指数 及吞噬百分数。
2 结果
2.1 理化指标检测结果
该制剂为淡黄色、澄清透明液体。多肽含量1.03mg/ml，核糖含量87μg/ml，蛋白质反 应阴性，最高吸收峰258nm，OD值等于3.5，E260nm/280nm为2.667。
2.2 白细胞粘附抑制(LAI)试验
表1 白细胞粘附抑制试验 (%，
±s) 组别, http://www.100md.com
未粘附率
PPD组
42.5±17.6*
CS-TFTB组
34.9±13.2*
CS-TFTB+PPD组
85.9±11.6
NTF+PPD组
29.3±9.6*
注：各组分别与CS-TFTB+PPD组比较均P<0.001
, http://www.100md.com
结果表明CS-STFTB具有针对PPD的LAI效应，说明CS-STFTB的LA I效应具有抗原依赖性。
2.3 CS-STFTB拮抗HC免疫抑制作用
表2 CS-TFTB对HC免疫抑制作用的影响 (
±s，%) 组别T细胞
脾重指数
给药前
给药后
HC组
, http://www.100md.com 55.1±23.6
32.6±6.9
0.38±0.15
HC+CS-STFTB(im)组
46.7±15.8
47.7±10.3
0.53±0.11
HC+CS-STFTB(po)组
53.3±5.8
51.9±6.7
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0.68±0.16
注： HC+CS-STFTBim组、HC+CS-STFTBpo组分别与HC组比较P<0.05
结果表明灌胃与肌注CS-TFTB均可阻断HC引起的免疫抑制。
2.4 小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能试验
表3 CS-STFTB对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 (
±s，%) 组别吞噬百分率
吞噬指数
, 百拇医药
HC组
28.5±11.6
0.76±0.32
HC+CS-STFTB(im)组
46.2±21.4
1.28±0.47*
HC+CS-STFTB(po)组
57.5±17.7
1.97±0.72*
注：HC+CS-STFTB(im)组、HC+CS-STFTB(po)组分别与HC组比较P<0.05
, http://www.100md.com
结果表明，CS-STFTB无论采取灌胃或肌注给药，均可明显促进巨噬细胞的吞 噬功能。
3 讨论
目前，特异性转移因子的制备，主要是选取经天然免疫或人工免疫的供体(人或动物)的脾细 胞和白细胞，经反复冻融、透析制得。CS-STF是用卡介苗与狗脾淋巴细胞共同孵育，淋巴细 胞致敏后，超声粉碎细胞，超滤制得。本法制备CS-STF具有抗用量少、周期短(1周左右)、 节省动物、试验条件易于控制等优点，为针对特异抗原制备STF提供一条新的途径。
本实验采用目前较先进的超滤技术，它具有过滤速度较快，便于无菌处理的优点。且核糖含 量、E260nm/280nm比值均比透析产物为高。
由于结核病患者存在细胞免疫和体液免疫分离现象，细胞免疫功能低下[4]。近年 来研究表明，STF作为一种免疫调节剂确能转移细胞免疫反应。本实验证明了CS-STFT B能够有效地拮抗HC引起的免疫抑制，促进巨噬细胞的吞噬和消化能力，在结核病的防治 上可发挥一定作用。
, 百拇医药
辽宁省教育委员会资助课题
参考文献
1，Lawrence HS.A New phenomenonof immuen.Pro.Soci Exp Bilo Med,1949;7(15) :16
2，刘洪庆.转移因子的临床作用.泰安医学院学报，1990；11：314～317
3，于俊阁，管远志.陈诗书主编.T淋巴细胞ANAE染色法.上海：上海医科大学出版社 、现代医学出版社，1996：63～65
4，马学玉.肺结核临床免疫的研究现状.临床荟萃，1997；12(16)：723～726
2000-04-15收稿, 百拇医药