用TRAP PCR ELISA及TRAP PCR PAGE测定鼻咽癌端粒酶活性的比较
作者：文忠 肖健云 李运斌 唐发清 田勇泉 赵素萍 谭柏林
单位：肖健云 李运斌 田勇泉 赵素萍(湖南医科大学湘雅医院耳鼻咽喉科 长沙 410008)；唐发清(湘雅医院中心实验室)；谭柏林(湘雅医院血液科)
关键词：鼻咽癌；HNE1细胞株；端粒酶；聚合酶链反应
中国现代医学杂志000906 目的：比较TRAP PCR ELISA及TRAP PCR PAGE检测鼻咽癌端粒酶的 活性。方法：分别采用TRAP PCR ELISA及TRAP PCR PAGE检测了38例鼻咽癌(NPC)、15例癌旁 组织、19例慢性鼻咽炎和鼻咽癌HNE1细胞株、其它2种癌细胞株及3种正常细胞的端粒酶 表达。并探讨了在不同数量的HNE1细胞中端粒酶表达的灵敏度及HNE1细胞株、5例NPC 活检组织经热灭活后端粒酶检测的特异性。结果：两种方法在NPC、癌旁、慢性鼻咽炎及HNE 1细胞株端粒酶表达的阳性率非常接近，分别为84.29%和85.29%、73.3%和69.2%、5.3%和 12.1%及95.5%和91.2%。ELISA间接定量法能很好地反映不同程度的端粒酶活性状态。在10 2HNE1细胞中仍能检测到端粒酶活性，而热灭活后测不出其活性。结论：两种方法均能 很好地显示鼻咽部不同组织及细胞中的端粒酶活性状态，有较高的灵敏度和特异性。
, 百拇医药
分类号 R739.6
COMPARISON BETWEEN TRAP PCR ELISA ANS TRAP PCR PAGE TO DETECT TELOMERASE ACTIVITY IN NASOPHARYNGEAL CARCINOMAS
Wen Zhong Xiao Jianyun Li Yuanbin, et al.
(Department of ENT, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
[Abstract]Objective: To compare the telomerase activity of nasopharyngeal carci nomas detected by TRAP PCR ELISA coith that by TRAP PCR PAGE. Methods:[ WTBZ〗 Telomeras e activity was detected in 38 cases of NPC, 15 cases of PNC adjacent tissues and 19 cases of chronic nasopharyngitis as well as in NHE1 cell lines, two other ca ncer cell lines and three other normal control cell lines by TRAP PCR ELISA and TRAP PCR PAGE respectively. The sensitivity and specificity of telomerase assay were also analyzed. Results: The positive rates of telomerase as say by the two m ethods in NPC, NPC adjacent tissues, chronic nasopharyngitis and HNE1 cell lines were 84.2% to 85.2%, 73.3% to 69.2%, 5.3% to 12.1% and 95.5% to 91.2%, respecti vely. The different activity levels of telomerase were revealed using ELISA indi rect quantitative assays. Telomerase activity was detected in 1×102 HNE1 cells, but was not or very little after heat-inactivation. Conclusions: Telomerase act ivity in different nasopharyngeal biopsies is well revealed when using both meth ods in which have high telomerase assay sensitivity and specificity also.
, 百拇医药
Key words:Carcinomas; Nasopharyngeal HNE1 Cell Lines; Telomeras e Polymerase Chain Reaction (PCR)
我们首次采用TRAP PCR ELISA间接定量及TRAP PCR PAGE凝胶电泳两种方法测定了鼻咽癌组 织及鼻咽癌HNE2细胞株中端粒酶的表达并比较了两种方法的优缺点，现报道如下：
1 材料与方法
1.1 研究对象
NPC 38例，其中男28例，女10例，年龄25～26岁，平均40.6岁，按1992年福州会议分期法分 为：Ⅰ期7例，Ⅱ期15例，Ⅲ期12例，Ⅳ期4例。以NPC癌旁组织15例，慢性鼻咽炎19例作对 照。所有病例均经病理证实。36例为低分化鳞癌，2例为泡状核细胞癌。
, 百拇医药
鼻咽癌HNE1细胞株由我校细胞中心提供。常规RPMI1640培养基(含10%小牛血清)、饱和湿 度及5% CO2培养箱中培养，3～4d传代，细胞生长达90%汇合时，用于端粒酶测定。同时 用①白血病细胞株(HL60)；②TUL1肺癌细胞株；③2例正常骨髓细胞；④血管平滑肌细胞 株；⑤外周血单个核细胞作对照。以上材料分别由血液实验室(①、③)，学校细胞中心(②) 、学校临床药理中心(④)及本院中心实验室(⑤)提供。
1.2 试剂及仪器
端粒酶TRAP PCR ELISA试剂盒及TRAP PCR PAGE试剂盒分别为德国宝灵曼公司和美国Oncor公 司产品。1640培养基粉购自美国GIBGOBRL公司，小牛血清及胰蛋白酶购自威地公司，PAGE凝 胶电泳试剂、硝酸银染色试剂、D-Hank's液及其它试剂均为同产分析纯。
TDGC2J-1型超净工作台为国产品，倒置显微 镜为CK Olympus公司产品，CO2培养箱为Ikem oto Ri-Ka-kogyo产品，5415 C型高速离心机为 Eppendorf产品，THZ-82A型台式恒温振荡器 由上海跃进医疗器械一厂生产，U85-13型低温冰箱为美国环境设备公司产品，DG3022A型酶 联 免疫检测仪则由国营华东电子管厂生产，AvantiTM30型低温离心机及DU-640型紫外 分光光度仪均为Beckman公司产品，DNA热循环仪为美国Perkin Elmer(PE)公司产品。
, 百拇医药
1.3 测定方法
戴口罩、手套、冰浴上操作，以防RNA酶污染及端粒酶降解。
1.3.1 标本处理 鼻咽部活检标本迅速放入液氮中冷冻后，转-80℃低温冰箱贮存待测。HNE1细胞
株及正常人血管平滑肌细胞株均用胰蛋白酶消化、吹打、计数 ，低速离心，细胞沉淀迅速放-80℃。HL60及正常人骨髓细胞加入D-Hank's液混匀，离心 ， 取中间白血病细胞或正常白细胞层，-80 ℃贮存。TUL1细胞株直接离心，细胞沉淀-80℃ 贮存待测。外周血单个核细胞采用常规密度梯度离心，取单个核细胞层，D-Hank's液洗3次 ，细胞沉淀放-80℃。
1.3.2 测定步骤 TRAP PCR ELISA测定程序：-80℃组织加裂解液冰浴上匀 浆(细胞沉淀中直接加裂解液冻融1～2次)，4℃离心，取2～5μl上清加入PCR反应管中(含引 物、dNTP、Taq DNA多聚酶)，加做阳性、灭活(加热86℃，10min)及空白对照，RT-PCR程序 为25℃，30min；94℃ 5min；94℃ 30s,50℃ 30s,72℃ 90s;72℃ 10min，共35个循环。将 PCR产物、ELISA变性液、含地高辛标记的探针杂交液混匀后加入包被有抗生素抗体的微滴定 孔中，反应2h后，先后加入酶标抗地高辛抗体、TMB底物，在酶标仪上测定吸光度(A)值(测2 次取均值)，进行间接定量反应(A值>0.3U为端粒酶阳性)。同时在12%非变性聚丙烯酰胺(PA GE )凝胶中电泳，硝酸银染色。以出现6bp重复的梯状带(50，56，62，68，74及80bp)为端粒酶 (+)。
, 百拇医药
非同位素TRAP PAGE电泳测定程度：-80℃组织加ChAPs冰浴上匀浆(105～106细胞直 接加ChAPs冰浴上反复冻融1～2次)，4℃离心，取2μl上清加入PCR反应管中[含10×TRAP缓 冲液，50×dNTPs混合液、TS引物、TRAP引物混合液(内标引物)、Taq DNA多聚酶]，同时加 测阳性、空白、热灭活对照。按2步法PCR(94℃ 30s;60℃ 30s;共35个循环)扩增。在12%非 变性PAGE胶上电泳，硝酸银染色，以出现6bp梯状带为(+)。
2 结果
2.1 TRAP PCR ELISA测定结果
TRAP PCR ELISA间接定量测定结果：表1显示NPC、癌旁组织及慢性鼻咽炎端粒酶测定的间接 定量结果。
表1 鼻咽癌、癌旁及慢性鼻咽炎端粒酶活性 (
±s) 分组
, 百拇医药
例数
A值
鼻咽癌
38
1.09±0.76*
癌旁组织
15
0.99±0.17*
慢性鼻咽炎
19
0.19±0.09
注：+鼻咽癌、癌旁组织分别与慢性鼻咽炎比较P<0.01
, 百拇医药
表2显示鼻咽癌HNE1细胞株、TUL1细胞株及HL60细胞株及几种正常细胞端粒酶测定的 间接定量结果。
表2 几种癌细胞及正常细胞中端粒酶活性 (±s) 分组
例数
A值
HNE1
22
1.21±0.961)
HL60
6
, 百拇医药
1.15±0.781)
TUL1
3
0.96±0.692)
血管平滑肌细胞株
6
0.12±0.05
培养的外周血单个核细胞
6
0.37±0.10
正常人骨髓细胞
, 百拇医药 2
0.25±0.17
注：1)HNE1、HL60分别与血管平滑肌细胞株、培养的外周血单个核细胞、正常人骨髓细胞比较P<0.01
2)TUL1分别与血管平滑肌细胞株、培养的外周血单个核细胞、正常人骨髓细胞比较P <0.05
TPAP PCR ELISA定性结果：表3示鼻咽癌组织及HNE1细胞、癌旁组织、慢性鼻咽炎组织及其它几种细胞中端粒酶表达 的阳性率。
表3 鼻咽癌组织、细胞及对照组中端粒酶表达的阳性率 例(%) 分组
例数
阳性
, http://www.100md.com
鼻咽癌
38
32(84.2)1)
癌旁组织
15
11(73.3)1)
慢性鼻咽炎组织
19
1(5.3)
HNE1
22
21(95.5)2)
, 百拇医药
HL60
6
5(83.3)2)
TUL1
3
2(66.7)2)
血管平滑肌细胞株
6
0(0)
外周血单个核细胞
6
0(0)
, 百拇医药
正常人骨髓细胞
2
0(0)
注：1)鼻咽癌、癌旁组织分别与慢性鼻咽炎组织比较P<0.01
2)HNE1、HL60、TUL1分别与血管平滑肌细胞株、培养的外周血单个核细胞、 正常骨髓细胞比较P<0.05
图1示部分鼻咽癌组织、细胞及对照组中端粒酶表达结果。
1.阴性对照(一) 2.阳性对照(+) 3.鼻咽癌(+) 4.慢性鼻咽炎(一) 5、6.HNE 1(+) 7. HL60(+) 8、9.TVL1(+) 10、11.血管平滑肌细胞(一)
, 百拇医药
图1 鼻咽癌组织、细胞及对照组端粒酶表达PAGE电泳图
2.2 TRAP PCR PAGE测定结果
TRAP PCR PAGE测定鼻咽癌端粒酶的阳性率基本同TRAP PCR ELISA。即NPC 85.2%，癌旁组织 69.2%，慢性鼻咽炎12.1%，HNE191.2%，HL6088%，外周血单个核细胞6.4%，部分 结果见图2。
.阳性对照(一) 2.阴性对照(+) 3、4、5.为血管平滑肌细胞、外周血单个核 细胞及正常骨髓细胞(一) 6.HNE1(+) 7. HL60(+) 8.慢性鼻咽炎(一) 9.鼻咽癌(+) 10.癌旁(+) 11.TUL1(+)
图2 鼻咽癌活检组织及细胞中端粒酶活性的TRAP PCR PAGE凝胶电泳图
, 百拇医药
2.3 为了了解端粒酶测定的灵敏度与特异性，对不同数量的HNE1细胞(106，105 ，104，103及102)的端粒酶活性进行了检测。另对5例鼻咽癌组织、10个HNE1细胞 株进行热灭活前、后的端粒酶活性检测对比。结果见表4及表5。
表4 不同数量HNE1细胞端粒酶活性(±s) 细胞数
A值
106
0.98±0.29
105
, http://www.100md.com
0.86±0.19
104
0.60±0.33
103
0.66±0.24
102
0.39±0.17
表5 鼻咽癌组织及细胞热灭活后端粒酶活性检测(x±s) 分组
n
A值
, http://www.100md.com
NPC灭活前
5
1.08±0.79*
NPC灭活后
0.12±0.08
HNE1灭活前
10
0.74±0.27*
HNE1灭活后
0.14±0.07
注：配对t检验P<0.053 讨论
, 百拇医药
自TRAP法后，方法学的不断进步，为更广泛、深入地探讨端粒酶的功能及表达发挥了重要的推动 作用。Cheng等[1]及陈小君等[2]采用TRAP PCR PAGE同位素法发现NPC 及NPC细胞株中有较高的端粒酶表达，该法虽然灵敏度高，但由于同位素可能对人体产生危 害作用，限制了其使用；此外，同位素有受半衰期限制及对环境的污染等不足。而非同位素 方 法的推出，极大地推动了端粒酶检测的开展及应用。郑伟等[3]、张莉萍等[ 4]、彭剑雄等[5]及卫立辛等[6]分别采用非同位素法检测了人生殖 道肿瘤、癌细胞株、白血病及肝癌细胞株中的端粒酶活性，并获得了可靠的阳性结果。我们 采用两种非同位素方法(TRAP PCR ELISA和TRAP PCR PAGE)同时检测了鼻咽癌、癌旁组织及 鼻咽癌HNE1细胞株中的端粒酶活性，发现无论是NPC活检组织或NPC细胞株中均有较高的 端粒酶表达。在癌旁组织或其它2种癌细胞株中亦有较高的端粒酶活性，而在慢性鼻咽炎及 其它3种正常对照细胞中端粒酶活性很低，甚至测不出。
, 百拇医药
从以上资料可以看出，两种方法均能准确地反应不同组织、细胞中的端粒酶活性状态，结果 可靠并具有较高的灵敏度及特异性。且试剂盒中已列出操作程序，不需花太多时间去摸索 方法。TRAP ELISA法在定量方面更显出其独特的优点。其定量灵敏度高达102细胞，能更 好地反映、比较不同程度的端粒酶活性状态。缺点是操作较费时。TRAP PAGE法定量比较麻 烦，需借助图像分析仪处理，但定性操作简单，2步法PCR大大缩短了反应时间，能准确、快 速出结果。且试剂盒中配有36bp的内标引物，可以了解操作过程中有无RNA酶污染。该法也 可采用同位素操作。
总之，随着端粒酶检测方法的改进及完善将极大地推动其应用范围，从而为全面深入地了解 端粒酶的功能而发挥关键作用。
本课题为湖南省科委基金项目(编号98SSY1008(2))并受到 国家自然科学基金的部分资助(编号39770933)
, 百拇医药 参考文献
1，Chen RYS,Yuen PW,Nicholls JM,et al.Telomerase activtion in nasopharyng eal carcinomas.British J.of Cancer,1998;77(3):456～460
2，陈小君，陈巧伦，黄奕俊，等.鼻咽癌组织端粒酶活性的研究.癌症，1998；17(5 )：328～330
3，郑 伟，石一复，谢 幸，等.端粒酶RNA和端粒酶活性在人生殖道癌细胞株中的 表达.细胞生物学杂志，1998；20(1)：25～29
4，张莉萍，蒋纪恺，刘祥贵.聚合酶链反应检测肿瘤细胞株的端粒酶活性.中华医学 检验杂志，1998；21(3)：139～141
5，彭剑雄，陈正炎，李志坚，等.急性白血病端粒酶的表达.湖南医科大学学报，19 98；23(3)：289～294
6，卫立辛，郭亚军，闫振林，等.检测人端粒酶活性的端粒酶TRAP ELISA法的建立. 中华肿瘤杂志，1998；20(4)：264～266
1999-10-30收稿, http://www.100md.com
单位：肖健云 李运斌 田勇泉 赵素萍(湖南医科大学湘雅医院耳鼻咽喉科 长沙 410008)；唐发清(湘雅医院中心实验室)；谭柏林(湘雅医院血液科)
关键词：鼻咽癌；HNE1细胞株；端粒酶；聚合酶链反应
中国现代医学杂志000906 目的：比较TRAP PCR ELISA及TRAP PCR PAGE检测鼻咽癌端粒酶的 活性。方法：分别采用TRAP PCR ELISA及TRAP PCR PAGE检测了38例鼻咽癌(NPC)、15例癌旁 组织、19例慢性鼻咽炎和鼻咽癌HNE1细胞株、其它2种癌细胞株及3种正常细胞的端粒酶 表达。并探讨了在不同数量的HNE1细胞中端粒酶表达的灵敏度及HNE1细胞株、5例NPC 活检组织经热灭活后端粒酶检测的特异性。结果：两种方法在NPC、癌旁、慢性鼻咽炎及HNE 1细胞株端粒酶表达的阳性率非常接近，分别为84.29%和85.29%、73.3%和69.2%、5.3%和 12.1%及95.5%和91.2%。ELISA间接定量法能很好地反映不同程度的端粒酶活性状态。在10 2HNE1细胞中仍能检测到端粒酶活性，而热灭活后测不出其活性。结论：两种方法均能 很好地显示鼻咽部不同组织及细胞中的端粒酶活性状态，有较高的灵敏度和特异性。
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分类号 R739.6
COMPARISON BETWEEN TRAP PCR ELISA ANS TRAP PCR PAGE TO DETECT TELOMERASE ACTIVITY IN NASOPHARYNGEAL CARCINOMAS
Wen Zhong Xiao Jianyun Li Yuanbin, et al.
(Department of ENT, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
[Abstract]Objective: To compare the telomerase activity of nasopharyngeal carci nomas detected by TRAP PCR ELISA coith that by TRAP PCR PAGE. Methods:[ WTBZ〗 Telomeras e activity was detected in 38 cases of NPC, 15 cases of PNC adjacent tissues and 19 cases of chronic nasopharyngitis as well as in NHE1 cell lines, two other ca ncer cell lines and three other normal control cell lines by TRAP PCR ELISA and TRAP PCR PAGE respectively. The sensitivity and specificity of telomerase assay were also analyzed. Results: The positive rates of telomerase as say by the two m ethods in NPC, NPC adjacent tissues, chronic nasopharyngitis and HNE1 cell lines were 84.2% to 85.2%, 73.3% to 69.2%, 5.3% to 12.1% and 95.5% to 91.2%, respecti vely. The different activity levels of telomerase were revealed using ELISA indi rect quantitative assays. Telomerase activity was detected in 1×102 HNE1 cells, but was not or very little after heat-inactivation. Conclusions: Telomerase act ivity in different nasopharyngeal biopsies is well revealed when using both meth ods in which have high telomerase assay sensitivity and specificity also.
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Key words:Carcinomas; Nasopharyngeal HNE1 Cell Lines; Telomeras e Polymerase Chain Reaction (PCR)
我们首次采用TRAP PCR ELISA间接定量及TRAP PCR PAGE凝胶电泳两种方法测定了鼻咽癌组 织及鼻咽癌HNE2细胞株中端粒酶的表达并比较了两种方法的优缺点，现报道如下：
1 材料与方法
1.1 研究对象
NPC 38例，其中男28例，女10例，年龄25～26岁，平均40.6岁，按1992年福州会议分期法分 为：Ⅰ期7例，Ⅱ期15例，Ⅲ期12例，Ⅳ期4例。以NPC癌旁组织15例，慢性鼻咽炎19例作对 照。所有病例均经病理证实。36例为低分化鳞癌，2例为泡状核细胞癌。
, 百拇医药
鼻咽癌HNE1细胞株由我校细胞中心提供。常规RPMI1640培养基(含10%小牛血清)、饱和湿 度及5% CO2培养箱中培养，3～4d传代，细胞生长达90%汇合时，用于端粒酶测定。同时 用①白血病细胞株(HL60)；②TUL1肺癌细胞株；③2例正常骨髓细胞；④血管平滑肌细胞 株；⑤外周血单个核细胞作对照。以上材料分别由血液实验室(①、③)，学校细胞中心(②) 、学校临床药理中心(④)及本院中心实验室(⑤)提供。
1.2 试剂及仪器
端粒酶TRAP PCR ELISA试剂盒及TRAP PCR PAGE试剂盒分别为德国宝灵曼公司和美国Oncor公 司产品。1640培养基粉购自美国GIBGOBRL公司，小牛血清及胰蛋白酶购自威地公司，PAGE凝 胶电泳试剂、硝酸银染色试剂、D-Hank's液及其它试剂均为同产分析纯。
TDGC2J-1型超净工作台为国产品，倒置显微 镜为CK Olympus公司产品，CO2培养箱为Ikem oto Ri-Ka-kogyo产品，5415 C型高速离心机为 Eppendorf产品，THZ-82A型台式恒温振荡器 由上海跃进医疗器械一厂生产，U85-13型低温冰箱为美国环境设备公司产品，DG3022A型酶 联 免疫检测仪则由国营华东电子管厂生产，AvantiTM30型低温离心机及DU-640型紫外 分光光度仪均为Beckman公司产品，DNA热循环仪为美国Perkin Elmer(PE)公司产品。
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1.3 测定方法
戴口罩、手套、冰浴上操作，以防RNA酶污染及端粒酶降解。
1.3.1 标本处理 鼻咽部活检标本迅速放入液氮中冷冻后，转-80℃低温冰箱贮存待测。HNE1细胞
株及正常人血管平滑肌细胞株均用胰蛋白酶消化、吹打、计数 ，低速离心，细胞沉淀迅速放-80℃。HL60及正常人骨髓细胞加入D-Hank's液混匀，离心 ， 取中间白血病细胞或正常白细胞层，-80 ℃贮存。TUL1细胞株直接离心，细胞沉淀-80℃ 贮存待测。外周血单个核细胞采用常规密度梯度离心，取单个核细胞层，D-Hank's液洗3次 ，细胞沉淀放-80℃。
1.3.2 测定步骤 TRAP PCR ELISA测定程序：-80℃组织加裂解液冰浴上匀 浆(细胞沉淀中直接加裂解液冻融1～2次)，4℃离心，取2～5μl上清加入PCR反应管中(含引 物、dNTP、Taq DNA多聚酶)，加做阳性、灭活(加热86℃，10min)及空白对照，RT-PCR程序 为25℃，30min；94℃ 5min；94℃ 30s,50℃ 30s,72℃ 90s;72℃ 10min，共35个循环。将 PCR产物、ELISA变性液、含地高辛标记的探针杂交液混匀后加入包被有抗生素抗体的微滴定 孔中，反应2h后，先后加入酶标抗地高辛抗体、TMB底物，在酶标仪上测定吸光度(A)值(测2 次取均值)，进行间接定量反应(A值>0.3U为端粒酶阳性)。同时在12%非变性聚丙烯酰胺(PA GE )凝胶中电泳，硝酸银染色。以出现6bp重复的梯状带(50，56，62，68，74及80bp)为端粒酶 (+)。
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非同位素TRAP PAGE电泳测定程度：-80℃组织加ChAPs冰浴上匀浆(105～106细胞直 接加ChAPs冰浴上反复冻融1～2次)，4℃离心，取2μl上清加入PCR反应管中[含10×TRAP缓 冲液，50×dNTPs混合液、TS引物、TRAP引物混合液(内标引物)、Taq DNA多聚酶]，同时加 测阳性、空白、热灭活对照。按2步法PCR(94℃ 30s;60℃ 30s;共35个循环)扩增。在12%非 变性PAGE胶上电泳，硝酸银染色，以出现6bp梯状带为(+)。
2 结果
2.1 TRAP PCR ELISA测定结果
TRAP PCR ELISA间接定量测定结果：表1显示NPC、癌旁组织及慢性鼻咽炎端粒酶测定的间接 定量结果。
表1 鼻咽癌、癌旁及慢性鼻咽炎端粒酶活性 (
±s) 分组, 百拇医药
例数
A值
鼻咽癌
38
1.09±0.76*
癌旁组织
15
0.99±0.17*
慢性鼻咽炎
19
0.19±0.09
注：+鼻咽癌、癌旁组织分别与慢性鼻咽炎比较P<0.01
, 百拇医药
表2显示鼻咽癌HNE1细胞株、TUL1细胞株及HL60细胞株及几种正常细胞端粒酶测定的 间接定量结果。
表2 几种癌细胞及正常细胞中端粒酶活性 (
±s) 分组例数
A值
HNE1
22
1.21±0.961)
HL60
6
, 百拇医药
1.15±0.781)
TUL1
3
0.96±0.692)
血管平滑肌细胞株
6
0.12±0.05
培养的外周血单个核细胞
6
0.37±0.10
正常人骨髓细胞
, 百拇医药 2
0.25±0.17
注：1)HNE1、HL60分别与血管平滑肌细胞株、培养的外周血单个核细胞、正常人骨髓细胞比较P<0.01
2)TUL1分别与血管平滑肌细胞株、培养的外周血单个核细胞、正常人骨髓细胞比较P <0.05
TPAP PCR ELISA定性结果：表3示鼻咽癌组织及HNE1细胞、癌旁组织、慢性鼻咽炎组织及其它几种细胞中端粒酶表达 的阳性率。
表3 鼻咽癌组织、细胞及对照组中端粒酶表达的阳性率 例(%) 分组
例数
阳性
, http://www.100md.com
鼻咽癌
38
32(84.2)1)
癌旁组织
15
11(73.3)1)
慢性鼻咽炎组织
19
1(5.3)
HNE1
22
21(95.5)2)
, 百拇医药
HL60
6
5(83.3)2)
TUL1
3
2(66.7)2)
血管平滑肌细胞株
6
0(0)
外周血单个核细胞
6
0(0)
, 百拇医药
正常人骨髓细胞
2
0(0)
注：1)鼻咽癌、癌旁组织分别与慢性鼻咽炎组织比较P<0.01
2)HNE1、HL60、TUL1分别与血管平滑肌细胞株、培养的外周血单个核细胞、 正常骨髓细胞比较P<0.05
图1示部分鼻咽癌组织、细胞及对照组中端粒酶表达结果。
1.阴性对照(一) 2.阳性对照(+) 3.鼻咽癌(+) 4.慢性鼻咽炎(一) 5、6.HNE 1(+) 7. HL60(+) 8、9.TVL1(+) 10、11.血管平滑肌细胞(一), 百拇医药
图1 鼻咽癌组织、细胞及对照组端粒酶表达PAGE电泳图
2.2 TRAP PCR PAGE测定结果
TRAP PCR PAGE测定鼻咽癌端粒酶的阳性率基本同TRAP PCR ELISA。即NPC 85.2%，癌旁组织 69.2%，慢性鼻咽炎12.1%，HNE191.2%，HL6088%，外周血单个核细胞6.4%，部分 结果见图2。
.阳性对照(一) 2.阴性对照(+) 3、4、5.为血管平滑肌细胞、外周血单个核 细胞及正常骨髓细胞(一) 6.HNE1(+) 7. HL60(+) 8.慢性鼻咽炎(一) 9.鼻咽癌(+) 10.癌旁(+) 11.TUL1(+)图2 鼻咽癌活检组织及细胞中端粒酶活性的TRAP PCR PAGE凝胶电泳图
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2.3 为了了解端粒酶测定的灵敏度与特异性，对不同数量的HNE1细胞(106，105 ，104，103及102)的端粒酶活性进行了检测。另对5例鼻咽癌组织、10个HNE1细胞 株进行热灭活前、后的端粒酶活性检测对比。结果见表4及表5。
表4 不同数量HNE1细胞端粒酶活性(
±s) 细胞数A值
106
0.98±0.29
105
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0.86±0.19
104
0.60±0.33
103
0.66±0.24
102
0.39±0.17
表5 鼻咽癌组织及细胞热灭活后端粒酶活性检测(
x±s) 分组n
A值
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NPC灭活前
5
1.08±0.79*
NPC灭活后
0.12±0.08
HNE1灭活前
10
0.74±0.27*
HNE1灭活后
0.14±0.07
注：配对t检验P<0.053 讨论
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自TRAP法后，方法学的不断进步，为更广泛、深入地探讨端粒酶的功能及表达发挥了重要的推动 作用。Cheng等[1]及陈小君等[2]采用TRAP PCR PAGE同位素法发现NPC 及NPC细胞株中有较高的端粒酶表达，该法虽然灵敏度高，但由于同位素可能对人体产生危 害作用，限制了其使用；此外，同位素有受半衰期限制及对环境的污染等不足。而非同位素 方 法的推出，极大地推动了端粒酶检测的开展及应用。郑伟等[3]、张莉萍等[ 4]、彭剑雄等[5]及卫立辛等[6]分别采用非同位素法检测了人生殖 道肿瘤、癌细胞株、白血病及肝癌细胞株中的端粒酶活性，并获得了可靠的阳性结果。我们 采用两种非同位素方法(TRAP PCR ELISA和TRAP PCR PAGE)同时检测了鼻咽癌、癌旁组织及 鼻咽癌HNE1细胞株中的端粒酶活性，发现无论是NPC活检组织或NPC细胞株中均有较高的 端粒酶表达。在癌旁组织或其它2种癌细胞株中亦有较高的端粒酶活性，而在慢性鼻咽炎及 其它3种正常对照细胞中端粒酶活性很低，甚至测不出。
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从以上资料可以看出，两种方法均能准确地反应不同组织、细胞中的端粒酶活性状态，结果 可靠并具有较高的灵敏度及特异性。且试剂盒中已列出操作程序，不需花太多时间去摸索 方法。TRAP ELISA法在定量方面更显出其独特的优点。其定量灵敏度高达102细胞，能更 好地反映、比较不同程度的端粒酶活性状态。缺点是操作较费时。TRAP PAGE法定量比较麻 烦，需借助图像分析仪处理，但定性操作简单，2步法PCR大大缩短了反应时间，能准确、快 速出结果。且试剂盒中配有36bp的内标引物，可以了解操作过程中有无RNA酶污染。该法也 可采用同位素操作。
总之，随着端粒酶检测方法的改进及完善将极大地推动其应用范围，从而为全面深入地了解 端粒酶的功能而发挥关键作用。
本课题为湖南省科委基金项目(编号98SSY1008(2))并受到 国家自然科学基金的部分资助(编号39770933)
, 百拇医药 参考文献
1，Chen RYS,Yuen PW,Nicholls JM,et al.Telomerase activtion in nasopharyng eal carcinomas.British J.of Cancer,1998;77(3):456～460
2，陈小君，陈巧伦，黄奕俊，等.鼻咽癌组织端粒酶活性的研究.癌症，1998；17(5 )：328～330
3，郑 伟，石一复，谢 幸，等.端粒酶RNA和端粒酶活性在人生殖道癌细胞株中的 表达.细胞生物学杂志，1998；20(1)：25～29
4，张莉萍，蒋纪恺，刘祥贵.聚合酶链反应检测肿瘤细胞株的端粒酶活性.中华医学 检验杂志，1998；21(3)：139～141
5，彭剑雄，陈正炎，李志坚，等.急性白血病端粒酶的表达.湖南医科大学学报，19 98；23(3)：289～294
6，卫立辛，郭亚军，闫振林，等.检测人端粒酶活性的端粒酶TRAP ELISA法的建立. 中华肿瘤杂志，1998；20(4)：264～266
1999-10-30收稿, http://www.100md.com