rhG-CSF增强Ara-C诱导白血病细胞凋亡作用的实验研究
作者：任波 齐振华 张国平
单位：任波(湖南省岳阳市二医院 414000)；齐振华 张国平(湖南医科大学附属湘雅医院 410008)
关键词：白血病细胞；凋亡；rhG-CSF；
中国现代医学杂志000959 分类号 R446
本实验观察了重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)与阿糖胞苷(Ara-C )联合应用对白血病细胞凋亡的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
人白血病细胞取自28例初治的急性髓性白血病(AML)病人骨髓。取2ml骨髓，分离后吸取单个 核细胞层细胞作培养用。HL-60细胞株转增后取指数生长期细胞同时实验。实验前3%台盼蓝 染色检查细胞活力 ，细胞活力大于85%时选作进一步实验用。人白血病细胞及HL-60细胞分别培养。分为5个实 验 组：空白对照组(第1组)；Ara-C 40ug/ml(第2组)；Ara-C 40ug/ml+G-GSF 0.12ug/ml(第3组 );Ara-C 80ug/ml(第4组);Ara-C 80ug/ml+G-CSF 0.12ug/ml(第5组)。在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24h，收集细 胞作检测。
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1.2 细胞存活及形态学检查
细胞活力用台盼蓝试验。拒色者为活细胞，着色者为死亡细胞。计算死亡细胞百分数。细胞 形态学采用光镜及电镜观察，凡细胞体积缩小、核固缩或碎裂、凋亡小体形成者视为凋亡细 胞。
1.3 DNA凝胶电泳
细胞洗涤，加入细胞裂解液。收集上清，并加入10%SDS及蛋白酶K。37℃温育12h，加入(1)/(2)体积10M乙 酸铵及2.5倍体积无水乙醇。-20℃置24h，离心。加入TE缓冲液及RN aseA酶，消化4h。1.5% 琼脂糖，50V电泳4h。紫外发射仪上照相。
1.4 DNA片段百分率测定
细胞离心洗涤后加入裂解液，离心。上清及沉淀分开。分别加入25%TCA。4℃沉淀12h。离心 。沉淀中加入5%TCA，90℃加热10min。冷却。加入1.5%二苯胺。温育12h后测定样品的吸光 度值(A570nm)。
, 百拇医药
1.5 统计学处理
计数资料采用(
±s)表示，检测结果采用成组设计资料的t检验处理。
2 结果
2.1 形态学改变及凋亡细胞计数
实验组中均出现了明显的细胞凋亡形态学改变。表现为细胞缩小，胞核浓缩或碎裂 ，凋亡小体形成。
台盼蓝试验显示，加入G-CSF后，与单独应用Ara-C相比，明显增加细胞凋亡细胞数量。统计 学处理，差异有显著性意义(见表1)。
表1 不同剂量、不同药物处理对细胞凋亡的影响 (±s) 组别
, 百拇医药
人白血病细胞凋亡细胞数%
(n=28)
HL-60细胞株凋亡细胞数%
(n=3)
第1组
11.01±1.24
10.02±1.68
第2组
23.30±1.86+
30.76±2.02+
第3组
, 百拇医药
41.29±2.97+
40.84±2.78+
第4组
42.78±3.12+
40.77±3.02+
第5组
50.02±2.83+
49.12±3.14+
注：与第1组相比，均P<0.05；第3组与第2组相比，均P<0.05；第4组与 第2组相比，均P<0.05；第5组与第4组相比，均P<0.05
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2.2 DNA凝胶电泳
对照组无明显的DNA带出现，而实验组均可见特征的梯状带。
2.3 DNA片段百分率测定
测定样品中DNA的吸光度值，加入G-CSF后，与单独应用Ara-C相比，明显增加DNA片段的百分 率(见表2)。
表2 不同药物、不同剂量处理后DNA片段百分率 (±s) 组别
人白血病细胞(%)
(n=28)
HL-60细胞株(%)
, http://www.100md.com (n=3)
第1组
20.19±4.23
18.16±20.28
第2组
36.42±3.62+
35.29±2.46+
第3组
45.25±3.84+
47.17±2.87+
第4组
, 百拇医药
42.78±4.16+
42.12±1.98+
第5组
62.23±3.82+
50.86±2.98+
注： 与第1组相比，均P<0.05；第3组与第2组相比，均P<0.05；第4组与 第2组相比，均P<0.05；第5组与第4组相比，均P<0.053 讨论
目前已经发现，多数抗肿瘤药物可激活肿瘤细胞的凋亡[1，4]。我们的研究发现 ，Ara-C对人白血病细胞及HL-60细胞株均具有促进凋亡的作用。
, http://www.100md.com 虽然有研究表明，G-CSF等造血生长因子在体外能刺激AML的白血病细胞增殖，认为G-CSF应 用于AML是不安全的。但是，已经有许多报道认为，G-CSF应用于AML病人并不引起白血病细 胞的增殖和疾病的恶化。有人研究了正常造血细胞与白血病细胞上的G-CSF受体，发现正常 细胞上的受体数量是白血病细胞的10～100倍，故短期应用G-CSF不会引起AML细胞的增殖 [2]。 有人报道，G-CSF对人白血病细胞能够抑制增殖，促进分化。沈氏[3]等应用rhG-C SF与DA方案联 合治疗AML病人，结果缓解率高于文献报导的单一应用DA方案。还有研究表明[4，5 ]，造血生长因 子与Ara-C等化疗药物联合应用，能够增强化疗药物的细胞毒性。这些资料表明，G-CSF应用 于AML病人是相对安全的。我们的研究表明，G-CSF与Ara-C联合应用，增强了Ara-C促进白血 病细胞凋亡的作用，与单独应用Ara-C相比，其差异有显著性意义。这为两者联合应用于AML 病人治疗的可能性提供了理论依据。
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参考文献
1，Gorczyca W,Gong J,Ardelt B,et al.The cell cycle related differences in suscepfibility of hlto cells to apoptosis induced by variousantifumor agents.Ca ncer Res,1993;53:3186～3192
2，Souza LM,Boone TC,Laip H,et al.Recombinant ruman granlocyfe colony sti mulating factor:effects on nornal and leukemic myeloid cells Science,1986;232:61 ～64
3，沈志祥，武承告，卡秦庚，等.DA方案和粒细胞集落刺激因子联合应用治疗急性 髓细胞白血病疗效观察.中华血液杂志，1997；18：211～213
, 百拇医药
4，Kerr JEB,Winterord CM,Biol ADA,et al.Aptosis its significance in cance r and cancer therpy.Cancer,1994;73:2013～2026
5，Dombret H,Chaston C,Feraux P,et al.A controlled study of recombinant h uman granulocyte colony stimulating factor in elderly patiencts after featment f oracute myclogenous leukemia.N Engl J Med,1995;332:1678～1683
2000-03-21收稿, 百拇医药
单位：任波(湖南省岳阳市二医院 414000)；齐振华 张国平(湖南医科大学附属湘雅医院 410008)
关键词：白血病细胞；凋亡；rhG-CSF；
中国现代医学杂志000959 分类号 R446
本实验观察了重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)与阿糖胞苷(Ara-C )联合应用对白血病细胞凋亡的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
人白血病细胞取自28例初治的急性髓性白血病(AML)病人骨髓。取2ml骨髓，分离后吸取单个 核细胞层细胞作培养用。HL-60细胞株转增后取指数生长期细胞同时实验。实验前3%台盼蓝 染色检查细胞活力 ，细胞活力大于85%时选作进一步实验用。人白血病细胞及HL-60细胞分别培养。分为5个实 验 组：空白对照组(第1组)；Ara-C 40ug/ml(第2组)；Ara-C 40ug/ml+G-GSF 0.12ug/ml(第3组 );Ara-C 80ug/ml(第4组);Ara-C 80ug/ml+G-CSF 0.12ug/ml(第5组)。在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24h，收集细 胞作检测。
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1.2 细胞存活及形态学检查
细胞活力用台盼蓝试验。拒色者为活细胞，着色者为死亡细胞。计算死亡细胞百分数。细胞 形态学采用光镜及电镜观察，凡细胞体积缩小、核固缩或碎裂、凋亡小体形成者视为凋亡细 胞。
1.3 DNA凝胶电泳
细胞洗涤，加入细胞裂解液。收集上清，并加入10%SDS及蛋白酶K。37℃温育12h，加入(1)/(2)体积10M乙 酸铵及2.5倍体积无水乙醇。-20℃置24h，离心。加入TE缓冲液及RN aseA酶，消化4h。1.5% 琼脂糖，50V电泳4h。紫外发射仪上照相。
1.4 DNA片段百分率测定
细胞离心洗涤后加入裂解液，离心。上清及沉淀分开。分别加入25%TCA。4℃沉淀12h。离心 。沉淀中加入5%TCA，90℃加热10min。冷却。加入1.5%二苯胺。温育12h后测定样品的吸光 度值(A570nm)。
, 百拇医药
1.5 统计学处理
计数资料采用(
±s)表示，检测结果采用成组设计资料的t检验处理。2 结果
2.1 形态学改变及凋亡细胞计数
实验组中均出现了明显的细胞凋亡形态学改变。表现为细胞缩小，胞核浓缩或碎裂 ，凋亡小体形成。
台盼蓝试验显示，加入G-CSF后，与单独应用Ara-C相比，明显增加细胞凋亡细胞数量。统计 学处理，差异有显著性意义(见表1)。
表1 不同剂量、不同药物处理对细胞凋亡的影响 (
±s) 组别, 百拇医药
人白血病细胞凋亡细胞数%
(n=28)
HL-60细胞株凋亡细胞数%
(n=3)
第1组
11.01±1.24
10.02±1.68
第2组
23.30±1.86+
30.76±2.02+
第3组
, 百拇医药
41.29±2.97+
40.84±2.78+
第4组
42.78±3.12+
40.77±3.02+
第5组
50.02±2.83+
49.12±3.14+
注：与第1组相比，均P<0.05；第3组与第2组相比，均P<0.05；第4组与 第2组相比，均P<0.05；第5组与第4组相比，均P<0.05
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2.2 DNA凝胶电泳
对照组无明显的DNA带出现，而实验组均可见特征的梯状带。
2.3 DNA片段百分率测定
测定样品中DNA的吸光度值，加入G-CSF后，与单独应用Ara-C相比，明显增加DNA片段的百分 率(见表2)。
表2 不同药物、不同剂量处理后DNA片段百分率 (
±s) 组别人白血病细胞(%)
(n=28)
HL-60细胞株(%)
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第1组
20.19±4.23
18.16±20.28
第2组
36.42±3.62+
35.29±2.46+
第3组
45.25±3.84+
47.17±2.87+
第4组
, 百拇医药
42.78±4.16+
42.12±1.98+
第5组
62.23±3.82+
50.86±2.98+
注： 与第1组相比，均P<0.05；第3组与第2组相比，均P<0.05；第4组与 第2组相比，均P<0.05；第5组与第4组相比，均P<0.053 讨论
目前已经发现，多数抗肿瘤药物可激活肿瘤细胞的凋亡[1，4]。我们的研究发现 ，Ara-C对人白血病细胞及HL-60细胞株均具有促进凋亡的作用。
, http://www.100md.com 虽然有研究表明，G-CSF等造血生长因子在体外能刺激AML的白血病细胞增殖，认为G-CSF应 用于AML是不安全的。但是，已经有许多报道认为，G-CSF应用于AML病人并不引起白血病细 胞的增殖和疾病的恶化。有人研究了正常造血细胞与白血病细胞上的G-CSF受体，发现正常 细胞上的受体数量是白血病细胞的10～100倍，故短期应用G-CSF不会引起AML细胞的增殖 [2]。 有人报道，G-CSF对人白血病细胞能够抑制增殖，促进分化。沈氏[3]等应用rhG-C SF与DA方案联 合治疗AML病人，结果缓解率高于文献报导的单一应用DA方案。还有研究表明[4，5 ]，造血生长因 子与Ara-C等化疗药物联合应用，能够增强化疗药物的细胞毒性。这些资料表明，G-CSF应用 于AML病人是相对安全的。我们的研究表明，G-CSF与Ara-C联合应用，增强了Ara-C促进白血 病细胞凋亡的作用，与单独应用Ara-C相比，其差异有显著性意义。这为两者联合应用于AML 病人治疗的可能性提供了理论依据。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Gorczyca W,Gong J,Ardelt B,et al.The cell cycle related differences in suscepfibility of hlto cells to apoptosis induced by variousantifumor agents.Ca ncer Res,1993;53:3186～3192
2，Souza LM,Boone TC,Laip H,et al.Recombinant ruman granlocyfe colony sti mulating factor:effects on nornal and leukemic myeloid cells Science,1986;232:61 ～64
3，沈志祥，武承告，卡秦庚，等.DA方案和粒细胞集落刺激因子联合应用治疗急性 髓细胞白血病疗效观察.中华血液杂志，1997；18：211～213
, 百拇医药
4，Kerr JEB,Winterord CM,Biol ADA,et al.Aptosis its significance in cance r and cancer therpy.Cancer,1994;73:2013～2026
5，Dombret H,Chaston C,Feraux P,et al.A controlled study of recombinant h uman granulocyte colony stimulating factor in elderly patiencts after featment f oracute myclogenous leukemia.N Engl J Med,1995;332:1678～1683
2000-03-21收稿, 百拇医药