HSV1-TK/GCV系统对人肺腺癌细胞A549生物学特性的影响
作者：何祥梁 郭先健 黄桂君
单位：何祥梁(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；郭先健(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；黄桂君(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)
关键词：肺肿瘤；基因转移；基因治疗；丙氧鸟苷
第三军医大学学报000916
提 要： 目的 观察转TK基因肺癌细胞对丙氧鸟苷(GCV)的敏感性及TK/GCV系统杀灭肿瘤细胞机制。方法 观察转TK基因、转空载体A549细胞(下分别简称A549-TK、A549-pLXSN)和A549细胞形态学改变、生长增殖特性。GCV对3种细胞生长抑制(MTT法)。电镜、流式细胞仪观察A549-TK、A549细胞经50 μmol/L GCV作用3 d后细胞凋亡。结果 转基因细胞变为不规则，呈多角型，透亮度下降，体外增殖能力下降，A549-TK，A549-pLXSN，A549 3种细胞倍增时间分别为42.35、41.75、36.18 h。依据IC50，A549-TK细胞对GCV敏感性比A549细胞提高46倍，电镜发现A549-TK细胞有凋亡小体，核呈半月征等，流式细胞仪发现A549-TK 、A549细胞亚G0G1期分别为(12.21±1.76)%、(1.32±0.47)%，两者比较P<0.01。结论 A549-TK细胞获得了对GCV敏感性，TK/GCV杀灭肿瘤细胞与诱导凋亡有关。
, http://www.100md.com
中图法分类号： R394.2;R734.2 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)07-0872-03
Effects of HSVl-TK/GCV system on biological characters of human pulmonary adenocarcinoma cell A549
HE Xiang-liang
(Research Institute of Respiratory Diseases, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
GUO Xian-jian
, 百拇医药
(Research Institute of Respiratory Diseases, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
HUANG Gui-jun
(Research Institute of Respiratory Diseases, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
Abstract： Objective To observe the sensitivity of TK gene-transferred pulmonary carcinoma cells to GCV and study the mechanism of TK/GCV system killing carcinoma cells. Methods The morphism and reproduction competency of A549 cell, A549 cell transferred with TK gene (A549-TK) and A549 cell transferred with vacant vector (A549-pLXSN) were observed. The inhibitory effect of GCV on the 3 cells was studied with MTT assay. The apoptosis of A549-TK cell and A549 cell the treated with 50 μmol/L GCV for 3 days was observed with electron microscope and flow cytometer. Results Under the effect of GCV, A549-TK and A549-pLXSN cells became irregular, polyangular, and opaque. The reproduction competency decreased and the doubling time of cells of A549-TK, A549-pLXSN and A549 cell were 42.35, 41.75 and 36.18 h respectively, and the sensitivity of A549-TK cell to GCV was 46 times higher than that of A549 cell. Apoptotic bodies and semilunar features of cell nucleus were found under electron microscope. Flow cytometer revealed that G0G1 subphase of A549-TK, A549 cells were (12.21±1.76)%, (1.32±0.47)% respectively (P<0.01). Conclusion A540-TK cell have acquired sensitivity to GCV and TK/GCV killing carcinoma cell was relative to induced cell apoptosis.
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Key words: pulmonary carcinoma; gene transferring; gene therapy; ganciclovir
HSV1-TK(Herpes simplex virus type-Ⅰ thymine kinase)基因是目前药敏基因中研究最多的一个，已被广泛应用于多种肿瘤，如脑胶质瘤、黑色素瘤，卵巢癌等。本实验应用该基因转染人肺腺癌细胞A549,观察了转基因细胞生物学特性变化，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料 人肺腺癌细胞A549购自上海细胞所，A549-TK、A549-pLXSN均由作者本人在构建含TK基因逆转录病毒表载体后用电穿孔法转化筛选及保存。细胞培养基RPMI-1640、胰蛋白酶购自GIBCO公司，MTT(Sigma)，丙氧鸟苷(Ganciclovir,GCV)购自瑞士Roche公司。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1将A549-TK、A549-pLXSN、A549 3种细胞按104/孔接种在2块24孔培养板,各15个孔,观察细胞形态学、生长增殖特性，每天取每种细胞3个孔胰酶消化，苔盼兰染色计数活细胞，倍增时间Td(h)＝(T.lg2)/( lgN/No)。
1.2.2 3种细胞对GCV敏感性观察，分别将A549-TK，A549-pLXSN，A549 3种细胞按2 500/孔，接种于96孔板上培养1～2 d后，设GCV 0、0.1、1、10、100、1 000、2 000、3 000、3 500、4 500 μmol/L 10个浓度点，每点设3复孔，加GCV培养5 d，用MTT法测活细胞数，并设不加药对照，细胞生长抑制率＝(1-对照组Dλ/实验组Dλ)×100%。
1.2.3 取70%融合的A549-TK、A549两种细胞各1瓶，换含50 μmol/L GCV培养3 d后，收集细胞沉淀，加入戊二醛4 ℃固定4 h，1% OSO4溶液再固定，环氧树脂Epon812包埋，Reichert-Jung.E型超薄切片机切片，醋酸铀染色，Philip EM400型电镜观察细胞超微结构变化。
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1.2.4 取50%～60%融合的A549-TK、A549两种细胞各1瓶，去旧培养基，换含50 μmol/L GCV培养4 d后收集细胞，70%乙醇固定后，用碘化丙啶进行荧光染色，经180目尼龙网过滤，用FACS400型流式细胞仪测定每个细胞的荧光强度。数据经微机用细胞周期分析COTFT分析求出。统计学分析采用配对计量资料Student's t test。
2 结果
转基因细胞A549-TK，A549-pLXSN与亲代细胞A549比较，生物学特性有些差别，转基因细胞外观变为不规则，呈多角型，易空泡化，透亮度下降，体外增殖速度减慢，上述3种细胞倍增时间分别为42.35、41.75、36.18 h。
A549-TK，A549-pLXSN，A549细胞对GCV敏感性用IC50表示分别为90.82、4 157.24、4 176.17 μmol/L ,从IC50看，A549-TK细胞比A549细胞对GCV敏感性提高46倍，转空载体、亲代细胞基本相同。
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电镜观察结果显示，A549-TK细胞有凋亡变化特征，如细胞核皱缩，半月征，凋亡小体形成等改变，A549细胞无这些变化,见图1。
图1 A549-TK细胞凋亡特征，凋亡小体，胞核半月征均同时存在 (TEM×8 000)
Fig 1 Apoptotic feature of A549-TK cell, showed apoptotic body,semilunar feature in cell nucleus (TEM×8 000)
流式细胞仪检测结果显示A549-TK细胞经50 μmol/L GCV作用3 d后在直方图上出现亚G0G1峰，该峰由凋亡细胞形成;A549细胞无该峰出现。A549-TK、A549细胞亚G0G1期分别为(12.21±1.76)%、(1.32±0.47)%，两者比较，差异非常显著(P<0.01)。
, 百拇医药
3 讨论
HSV1-TK基因作用为众多药敏基因之一，目前研究应用最多，它主要用于肿瘤和AIDS的治疗研究，有些国家已批准进入临床治疗试验，如脑胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌等。到1997年底，全世界有超过40个临床应用该基因治疗患者的记录[1]。肺癌应用该基因治疗国外也有不少报道。我们体外观察到A549-TK、A549-pLXSN细胞生物学特性发生改变，如外形变为不规则，呈多角形，易空泡化，细胞透亮度下降，增殖速度减慢，这与Smythe[2]报道相同，可能与转入的外源基因由于随机整合对细胞本身相邻基因发生影响，或者是由于其表达产物的作用。
TK基因杀灭肿瘤细胞的机制为，TK基因表达产物TK酶能将前药GCV磷酸化为一磷酸化物，后者在体内磷酸激酶等作用下转变为二磷酸化物，并进一步磷酸化为三磷酸化物,为细胞毒性药物，抑制DNA合成，导致细胞死亡。观察A549-TK细胞对GCV的敏感性，我们发现当GCV浓度1 μmol/L时，培养3 d后出现部分细胞漂浮、脱落，聚集成团，最后死亡，当浓度为10 μmol/L或以上时，这一现象更加明显，而对照细胞不受GCV浓度升高而变化。通过MTT法测活细胞数，我们发现GCV对A549-TK、A549-pLXSN、A549 3种细胞的半数抑制浓度IC50分别为90.82、4157.24、4176.17 μmol/L，A549-TK细胞对GCV敏感性比A549细胞提高了46倍。Smythe[3]报道GCV对A549细胞转TK基因后的IC50为75 μmol/L，而亲代细胞IC50>2 000 μmol/L以上。与我们的结果较为接近，他也发现转TK基因的卵巢癌细胞对GCV仍很抵抗，他解释这种差异可能是细胞膜对病毒的结合力不同，导致进入细胞的病毒量差异，所以TK基因在不同细胞中拷贝数不同，表达产物产量差别很大，导致不同细胞类型转基因后对GCV敏感性差别很大。
, 百拇医药
为了探讨TK/GCV杀灭肿瘤细胞的机制，我们用电镜观察A549-TK、A549两种细胞经GCV作用3 d后细胞超微结构变化及流式细胞仪检测细胞周期、直方图等。因为目前认为该系统杀灭肿瘤的机制之一是诱导了细胞凋亡，TK+细胞凋亡时产生的凋亡小体被邻近TKˉ细胞吞噬，导致后者也被杀灭[4，5]。我们的实验结果也确实发现了A549-TK细胞出现了凋亡，如电镜发现有凋亡小体、核呈半月征，核浓缩等，对照细胞无这些发现。流式细胞仪发现A549-TK细胞直方图上有亚G0G1峰，该峰由凋亡细胞形成，而A549细胞无该峰。说明了A549-TK细胞出现了凋亡变化，因此我们的实验结果也支持TK/GCV系统杀灭肿瘤细胞与诱导细胞凋亡有关。
作者简介：何祥梁(1964-)，男，江苏省瑞昌县人，博士，主治医师，讲师，主要从事肺癌基因治疗方面的研究，发表论文10篇，现在第一军医大学附属珠江医院呼吸科，广州 510282。电话：(020)85143373
, 百拇医药
参考文献：
[1] K-H plate. Foreilling. Suicide gene against brain tumors[J]. Hum Gene Ther, 1998,9(1):3-5.
[2] Smythe W R, Hwang H C, Amin K M， et al. Use of recombinant adenovirus to transfer the herpes simplex virus thymidine kinase gene to thoracic neoplasms: an effective in vitro drug sensitization system[J]. Cancer Res, 1994,50(12):2 055-2 061.
[3] Smythe W R, Hwang H C, Elshami A A， et al. Differential sensitiviy of thoracic malignant tumors to adenovirus mediated drug sensitizations gene therapy[J]. J Thorac Cardiovasc Surg，1995,109(6):626-632.
[4] Wolfgang H, Lucia M, Vincenzo P, et al. HSV-TK/GCV mediated apoptotic death of bystander cells[J]. Cancer Res,1996,56(15):2 679-2 684.
收稿日期：1999-11-15；修回日期：2000-04-14, 百拇医药
单位：何祥梁(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；郭先健(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；黄桂君(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)
关键词：肺肿瘤；基因转移；基因治疗；丙氧鸟苷
第三军医大学学报000916
提 要： 目的 观察转TK基因肺癌细胞对丙氧鸟苷(GCV)的敏感性及TK/GCV系统杀灭肿瘤细胞机制。方法 观察转TK基因、转空载体A549细胞(下分别简称A549-TK、A549-pLXSN)和A549细胞形态学改变、生长增殖特性。GCV对3种细胞生长抑制(MTT法)。电镜、流式细胞仪观察A549-TK、A549细胞经50 μmol/L GCV作用3 d后细胞凋亡。结果 转基因细胞变为不规则，呈多角型，透亮度下降，体外增殖能力下降，A549-TK，A549-pLXSN，A549 3种细胞倍增时间分别为42.35、41.75、36.18 h。依据IC50，A549-TK细胞对GCV敏感性比A549细胞提高46倍，电镜发现A549-TK细胞有凋亡小体，核呈半月征等，流式细胞仪发现A549-TK 、A549细胞亚G0G1期分别为(12.21±1.76)%、(1.32±0.47)%，两者比较P<0.01。结论 A549-TK细胞获得了对GCV敏感性，TK/GCV杀灭肿瘤细胞与诱导凋亡有关。
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中图法分类号： R394.2;R734.2 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)07-0872-03
Effects of HSVl-TK/GCV system on biological characters of human pulmonary adenocarcinoma cell A549
HE Xiang-liang
(Research Institute of Respiratory Diseases, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
GUO Xian-jian
, 百拇医药
(Research Institute of Respiratory Diseases, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
HUANG Gui-jun
(Research Institute of Respiratory Diseases, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
Abstract： Objective To observe the sensitivity of TK gene-transferred pulmonary carcinoma cells to GCV and study the mechanism of TK/GCV system killing carcinoma cells. Methods The morphism and reproduction competency of A549 cell, A549 cell transferred with TK gene (A549-TK) and A549 cell transferred with vacant vector (A549-pLXSN) were observed. The inhibitory effect of GCV on the 3 cells was studied with MTT assay. The apoptosis of A549-TK cell and A549 cell the treated with 50 μmol/L GCV for 3 days was observed with electron microscope and flow cytometer. Results Under the effect of GCV, A549-TK and A549-pLXSN cells became irregular, polyangular, and opaque. The reproduction competency decreased and the doubling time of cells of A549-TK, A549-pLXSN and A549 cell were 42.35, 41.75 and 36.18 h respectively, and the sensitivity of A549-TK cell to GCV was 46 times higher than that of A549 cell. Apoptotic bodies and semilunar features of cell nucleus were found under electron microscope. Flow cytometer revealed that G0G1 subphase of A549-TK, A549 cells were (12.21±1.76)%, (1.32±0.47)% respectively (P<0.01). Conclusion A540-TK cell have acquired sensitivity to GCV and TK/GCV killing carcinoma cell was relative to induced cell apoptosis.
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Key words: pulmonary carcinoma; gene transferring; gene therapy; ganciclovir
HSV1-TK(Herpes simplex virus type-Ⅰ thymine kinase)基因是目前药敏基因中研究最多的一个，已被广泛应用于多种肿瘤，如脑胶质瘤、黑色素瘤，卵巢癌等。本实验应用该基因转染人肺腺癌细胞A549,观察了转基因细胞生物学特性变化，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料 人肺腺癌细胞A549购自上海细胞所，A549-TK、A549-pLXSN均由作者本人在构建含TK基因逆转录病毒表载体后用电穿孔法转化筛选及保存。细胞培养基RPMI-1640、胰蛋白酶购自GIBCO公司，MTT(Sigma)，丙氧鸟苷(Ganciclovir,GCV)购自瑞士Roche公司。
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1.2 方法
1.2.1将A549-TK、A549-pLXSN、A549 3种细胞按104/孔接种在2块24孔培养板,各15个孔,观察细胞形态学、生长增殖特性，每天取每种细胞3个孔胰酶消化，苔盼兰染色计数活细胞，倍增时间Td(h)＝(T.lg2)/( lgN/No)。
1.2.2 3种细胞对GCV敏感性观察，分别将A549-TK，A549-pLXSN，A549 3种细胞按2 500/孔，接种于96孔板上培养1～2 d后，设GCV 0、0.1、1、10、100、1 000、2 000、3 000、3 500、4 500 μmol/L 10个浓度点，每点设3复孔，加GCV培养5 d，用MTT法测活细胞数，并设不加药对照，细胞生长抑制率＝(1-对照组Dλ/实验组Dλ)×100%。
1.2.3 取70%融合的A549-TK、A549两种细胞各1瓶，换含50 μmol/L GCV培养3 d后，收集细胞沉淀，加入戊二醛4 ℃固定4 h，1% OSO4溶液再固定，环氧树脂Epon812包埋，Reichert-Jung.E型超薄切片机切片，醋酸铀染色，Philip EM400型电镜观察细胞超微结构变化。
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1.2.4 取50%～60%融合的A549-TK、A549两种细胞各1瓶，去旧培养基，换含50 μmol/L GCV培养4 d后收集细胞，70%乙醇固定后，用碘化丙啶进行荧光染色，经180目尼龙网过滤，用FACS400型流式细胞仪测定每个细胞的荧光强度。数据经微机用细胞周期分析COTFT分析求出。统计学分析采用配对计量资料Student's t test。
2 结果
转基因细胞A549-TK，A549-pLXSN与亲代细胞A549比较，生物学特性有些差别，转基因细胞外观变为不规则，呈多角型，易空泡化，透亮度下降，体外增殖速度减慢，上述3种细胞倍增时间分别为42.35、41.75、36.18 h。
A549-TK，A549-pLXSN，A549细胞对GCV敏感性用IC50表示分别为90.82、4 157.24、4 176.17 μmol/L ,从IC50看，A549-TK细胞比A549细胞对GCV敏感性提高46倍，转空载体、亲代细胞基本相同。
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电镜观察结果显示，A549-TK细胞有凋亡变化特征，如细胞核皱缩，半月征，凋亡小体形成等改变，A549细胞无这些变化,见图1。
图1 A549-TK细胞凋亡特征，凋亡小体，胞核半月征均同时存在 (TEM×8 000)
Fig 1 Apoptotic feature of A549-TK cell, showed apoptotic body,semilunar feature in cell nucleus (TEM×8 000)
流式细胞仪检测结果显示A549-TK细胞经50 μmol/L GCV作用3 d后在直方图上出现亚G0G1峰，该峰由凋亡细胞形成;A549细胞无该峰出现。A549-TK、A549细胞亚G0G1期分别为(12.21±1.76)%、(1.32±0.47)%，两者比较，差异非常显著(P<0.01)。
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3 讨论
HSV1-TK基因作用为众多药敏基因之一，目前研究应用最多，它主要用于肿瘤和AIDS的治疗研究，有些国家已批准进入临床治疗试验，如脑胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌等。到1997年底，全世界有超过40个临床应用该基因治疗患者的记录[1]。肺癌应用该基因治疗国外也有不少报道。我们体外观察到A549-TK、A549-pLXSN细胞生物学特性发生改变，如外形变为不规则，呈多角形，易空泡化，细胞透亮度下降，增殖速度减慢，这与Smythe[2]报道相同，可能与转入的外源基因由于随机整合对细胞本身相邻基因发生影响，或者是由于其表达产物的作用。
TK基因杀灭肿瘤细胞的机制为，TK基因表达产物TK酶能将前药GCV磷酸化为一磷酸化物，后者在体内磷酸激酶等作用下转变为二磷酸化物，并进一步磷酸化为三磷酸化物,为细胞毒性药物，抑制DNA合成，导致细胞死亡。观察A549-TK细胞对GCV的敏感性，我们发现当GCV浓度1 μmol/L时，培养3 d后出现部分细胞漂浮、脱落，聚集成团，最后死亡，当浓度为10 μmol/L或以上时，这一现象更加明显，而对照细胞不受GCV浓度升高而变化。通过MTT法测活细胞数，我们发现GCV对A549-TK、A549-pLXSN、A549 3种细胞的半数抑制浓度IC50分别为90.82、4157.24、4176.17 μmol/L，A549-TK细胞对GCV敏感性比A549细胞提高了46倍。Smythe[3]报道GCV对A549细胞转TK基因后的IC50为75 μmol/L，而亲代细胞IC50>2 000 μmol/L以上。与我们的结果较为接近，他也发现转TK基因的卵巢癌细胞对GCV仍很抵抗，他解释这种差异可能是细胞膜对病毒的结合力不同，导致进入细胞的病毒量差异，所以TK基因在不同细胞中拷贝数不同，表达产物产量差别很大，导致不同细胞类型转基因后对GCV敏感性差别很大。
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作者简介：何祥梁(1964-)，男，江苏省瑞昌县人，博士，主治医师，讲师，主要从事肺癌基因治疗方面的研究，发表论文10篇，现在第一军医大学附属珠江医院呼吸科，广州 510282。电话：(020)85143373
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参考文献：
[1] K-H plate. Foreilling. Suicide gene against brain tumors[J]. Hum Gene Ther, 1998,9(1):3-5.
[2] Smythe W R, Hwang H C, Amin K M， et al. Use of recombinant adenovirus to transfer the herpes simplex virus thymidine kinase gene to thoracic neoplasms: an effective in vitro drug sensitization system[J]. Cancer Res, 1994,50(12):2 055-2 061.
[3] Smythe W R, Hwang H C, Elshami A A， et al. Differential sensitiviy of thoracic malignant tumors to adenovirus mediated drug sensitizations gene therapy[J]. J Thorac Cardiovasc Surg，1995,109(6):626-632.
[4] Wolfgang H, Lucia M, Vincenzo P, et al. HSV-TK/GCV mediated apoptotic death of bystander cells[J]. Cancer Res,1996,56(15):2 679-2 684.
收稿日期：1999-11-15；修回日期：2000-04-14, 百拇医药