人CTLA-4胞外区cDNA的克隆及Ig融合蛋白表达载体的构建
作者：易绍萱 吴军 姜庆 王锡华 李彦 刘志刚 张宁 肖光夏
单位：易绍萱(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)；吴军(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)；姜庆(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)；王锡华(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)；李彦(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)；刘志刚(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)
关键词：CTLA-4； 融合蛋白；基因表达
第三军医大学学报000906 提 要： 目的 克隆人CTLA-4胞外区cDNA、构建人CTLA-4胞外区与人免疫球蛋白IgG Fc融合蛋白表达载体，为研究CTLA-4/Ig融合蛋白及其临床应用奠定基础。方法 从抗人CD3单克隆抗体和PMA活化的健康中国人外周血淋巴细胞总RNA中，扩增人CTLA-4基因胞外区cDNA片段，经HindⅢ+BclⅠ双酶切后定向插入Ig融合蛋白表达载体。结果 从活化人T细胞中扩增出人CTLA-4胞外区cDNA片段，并将其正确插入Ig融合蛋白表达载体，成功构建了CTLA-4/Ig融合蛋白表达载体，表达载体的构建与预期设计相符；CTLA-4基因胞外区cDNA序列与文献报道一致。结论 本研究成功地克隆了人CTLA-4胞外区cDNA片段，构建了CTLA-4/Ig融合蛋白表达载体，为进一步在哺乳动物细胞中表达CTLA-4/Ig融合蛋白、探讨其在实验室及临床的应用奠定了基础。
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中图法分类号： R394-3;R394.3 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)09-0834-04
Cloning of extracellular region of human CTLA-4 and construction of Ig fusion protein expression vector
YI Shao-xuan
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
WU Jun
, 百拇医药
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
JIANG Qing
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
WANG Xi-hua
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
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LI Yan
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
LIU Zhi-gang
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
ZHANG Ning
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
, 百拇医药
XIAO Guang-xia
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
Abstract： Objective To clone an extracellular region of human CTLA-4 and construct an immunoglobulin IgG Fc fusion protein expression vector for the study of potential clinical usage of sduble CTLA-4. Methods Three PCR primers were designed based on the published CTLA-4 cDNA, a cDNA fragment was amplified by reverse-transcription methods followed by two cycles of PCR from the total RNA of anti-CD3 antibody and PMA activated human peripheral blood mononuclear cells, this fragment was then cloned into a transient expression vector containing human IgG1 Fc (including the hinge, CH2 and CH3 domain of IgG Cγ1) which was restricted by HindⅢ+BclⅠ. Results A 470 bp cDNA fragment was amplified and cloned into IgG Fc fusion protein expression vector successfully. Nucleotide sequence analysis verified that the amplifed cDNA fragment was identical to human CTLA-4 extracellular region. Conclusion Human CTLA-4/Ig fusion protein expression vector is successfully constructed. These results lay the foundation for further research in expression of CTLA-4/Ig fusion protein in mammal cells and its clinical trial.
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Key words： CTLA-4; fusion protein; gene expression
CTLA-4(Cytotoxic T lymphocyte associated antigen )是主要表达于活化T细胞表面的一种跨膜糖蛋白分子，与B7和CD28同属免疫球蛋白超家族成员，是T细胞活化中重要的负调节分子[1]。可溶性CTLA-4是人CTLA-4分子胞外区与人免疫球蛋γ1绞链区、CH2、CH3区组成的融合蛋白 ，与B7有高度的亲和力，可以阻断B7与CD28或CTLA-4结合[2]。在TCR识别外来抗原的同时给予可溶性CTLA-4，在体外可诱导T细胞无应答，在体内则可诱导特异性免疫耐受。由于其在抗器官移植排斥和治疗自身免疫病等方面的广阔应用前景，正越来越引起人们的重视。为了进一步研究可溶性CTLA-4作为特异性免疫抑制剂或免疫耐受诱导剂的作用及其机制，本研究采用基因工程的方法，克隆中国人CTLA-4基因胞外区cDNA片段，构建人CTLA-4胞外区融合蛋白表达载体，为表达、纯化CTLA-4/Ig融合蛋白，进一步探讨其在实验室及临床应用的可行性奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 质粒、菌株和细胞
融合蛋白表达载体pX/Ig由美国耶鲁大学尹志楠博士惠赠，pUC19质粒、大肠杆菌MC1061由本校分子生物学教研室保存，健康人外周血由西南医院血库提供。
1.2 试剂 鼠抗人CD3单抗(北京帮定)，PMA(Sigma)，100bpDNALadder(Gibco)，总RNA提取、cDNA合成、质粒提取、凝胶片段回收、DNA快速连接等Kit(Roche)。
1.3 引物设计合成 根据基因库中人CTLA-4基因序列，设计如下3条引物：
引物1#：CTCAGTCTGGTCCTTGACCTCCTGTTTCCAAGCATGG-CGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC
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引物2#：TTTGGGCTCCTGATCABclⅠGAATCTGGGCACGGTTC
引物3#：GCAAGCTTHindⅢCAATGGGTTGACTGCTCACACAGAGGA-
CGCTGCTCAGTTCGGTCCTTGCATCT
引物由中科院上海细胞所合成，PAGE纯化。
1.4 外周血单个核细胞(PBMC)的分离、活化及细胞总RNA的提取、鉴定
常规分离新鲜健康人PBMC， RPMI1640调节细胞密度为1ⅹ106/ml，加入PMA(15 nmol/ml)和抗CD3单抗(10 μg/ml)，37℃ 5% CO2 6 h。Tripure试剂提取活化PBMC总RNA，甲醛变性琼脂糖凝胶检测RNA完整性，紫外分光光度仪鉴定其纯度和浓度。
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1.5 cDNA第一链合成及PCR扩增以活化PBMC总RNA为模板，每20μl逆转录体系含总RNA1.0μg，5ⅹ缓冲液5μl，1.25mmol/LdNTP4μl，Oligo(dT12)0.1μg，100mmol/LDTT1μl,65℃水浴变性10min，迅速置冰上，再加入RNasin40U，AMV40U，42℃1h，沸水浴10min后进行PCR反应。先以cDNA第一链为模板，以引物1#和2#进行第一轮扩增，条件为：cDNA第一链5 μl，10ⅹPCR buffer 5 μl，10 mmol/L dNTP 4 μl，引物1#和2#各1 μl(终浓度100 nmol/L)，ddH2O 29.5 μl，95 ℃变性 7 min，加Taq 酶0.5 μl，总体积50 μl，循环条件：94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环后72 ℃ 7 min；随后以第一轮PCR反应产物为模板，以引物2#和3#进行第二轮扩增，反应条件同前，扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳分析。
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1.6 融合蛋白表达载体构建
用琼脂糖凝胶片段回收试剂盒回收目的片段，经HindⅢ、 BcⅠ双酶切后，与经同样酶切的pX/Ig载体以片段∶载体为3∶1的比例，按DNA快速连接kit说明连接，即用5ⅹDNA稀释缓冲液将片段和载体DNA稀释至10μl，加入2倍连接缓冲液10μl，混匀后加入1μlT4DNA连接酶，室温连接1 h，取2 μl连接产物转化大肠杆菌MC1061，挑选阳性转化菌落，HindⅢ、 XbaⅠ酶切鉴定重组质粒。
1.7 序列测定
酶切鉴定插入片段大小正确的重组质粒，经HindⅢ 、XbaⅠ双酶切后定向插入pUC19质粒中，采用Sanger双脱氧测序法，以质粒双链DNA为模板,在pUC19通用引物引导下,ABIPrism377全自动测序仪自动测序。
2 结果
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2.1 RT-PCR扩增CTLA-4胞外区cDNA片段 从两批活化PBMC提取的总RNA，清晰可见其内对照标准28S、18S和5SRNA条带，说明所提RNA分子完整(照片略)；所提RNA经紫外分光光度计测得D260/D280比值为1.8，纯度符合要求，可作为逆转录反应的模板。由引物2#、3#引导的第一轮PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下未观察到明显的目的条带，仅见一些微弱的DNA阳性区域；以第一轮PCR产物为模板，由引物1#、3#引导的第二轮PCR产物，2%琼脂糖凝胶上可见大小约470 bp的扩增带，与预期大小相符，见图1。
图1 RT-PCR扩增产物
M：100 bp DNA 标准；1：第二轮PCR扩增CTLA-4基因片段
, 百拇医药
Fig 1 Amplification of extracellular region of human
CTLA-4 gene by RT-PCR
M：100 bp DNA marker；1：PCR amplified CTLA-4 gene fragment
2.2 CTLA-4胞外区与人IgG Fc融合蛋白表达载体的构建
融合蛋白表达载体构建策略如图2所示，即：将第二轮PCR扩增片段经HindⅢ、 BclⅠ双酶切后，与经同样酶切的pX/Ig载体连接，提取阳性转化菌落质粒DNA，HindⅢ、XbaⅠ酶切，能切出扩增片段与IgG Fc cDNA融合的1.2 Kb片段,与预期设计相符，将阳性质粒命名为pCTLA-4/Ig，图3为质粒构建和酶切鉴定图谱。
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图2 pCTLA-4/Ig 融合蛋白表达载体构建示意图
Fig 2 Diagram of the construction of recombinant expressionvector of pCTLA-4/Ig
图3 pCTLA-4/Ig质粒构建及酶切鉴定
M：λDNA/HindⅢ marker；1：pCTLA-4/Ig HindⅢ酶切；2：pCTLA-4/Ig HindⅢ、XbaⅠ双酶切；3：RT-PCR扩增CTLA-4胞外区片段HindⅢ、BclⅠ双酶切；4:pX-4/Ig载体HindⅢ、BclⅠ双酶切
Fig 3 Construction and identification of recombinantplasmid pCTLA-4/Ig
, 百拇医药
M：λDNA/HindⅢ marker；1：pCTLA-4/Ig/HindⅢ；2：pCTLA-4/Ig HindⅢ，XbaⅠ; 3：PCR amplified CTLA-4 gene fragment /HindⅢ，BclⅠ； 4：Expression vector pX-4/Ig/HindⅢ，BclⅠ
2.3 CTLA-4融合蛋白cDNA序列测定
将pCTLA-4/Ig质粒中包括CTLA-4胞外区cDNA片段和IgG Fc cDNA的1.2 Kb HindⅢ-XbaⅠ片段定向亚克隆入经同样酶切的pUC19质粒，采用双链质粒DNA双向测序，经测序结果分析软件分析表明，在所测片段上下游分别找到HindⅢ和XbaⅠ酶切位点，以及CTLA-4胞外区cDNA与IgG Fc cDNA 交界处的BclⅠ酶切位点，经同源性比较分析证实，与文献[2]报道CTLA-4胞外区cDNA序列一致。
3 讨论
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CTLA-4蛋白是主要表达于活化T细胞表面的跨膜糖蛋白，多种因素刺激T细胞活化均可上调CTLA-4 mRNA及膜表面蛋白表达[3～6]。在抗CD3单抗处理PBMC时，早在活化1 h即可检测到CTLA-4 mRNA，6 h即达高峰，膜表面蛋白的表达则在24～48 h达高峰；CD28受体交联、蛋白激酶C活化剂、钙离子通道剂、以及粘附分子ICAM-1、VCAM-1等均可诱导或增强CTLA-4的表达；活化T细胞还可通过细胞与细胞直接接触的方式诱导B细胞表达高水平的膜表面CTLA-4[7]；在胸腺细胞中也发现有CTLA-4蛋白[8]。我们用抗CD3单抗(10 μg/ml)和PMA(15 nmol/L)刺激人PBMC，在共培养6 h后的细胞总RNA抽提物中，成功地扩增出CTLA-4胞外区片段。我们也曾用抗CD3单抗和PMA与人PBMC共培养，再用mRNA capture kit提取mRNA，经RT-PCR反应后并未得到预期大小的扩增带，其原因可能与CD3单抗和PMA处理诱导细胞CTLA-4表达早在6 h即可达高峰，而在24 h时，细胞mRNA水平已下降[3]；还可能与mRNA capture kit捕获mRNA的量有限，大量高丰度的mRNA占据了有限的Oligo dT结合位点，使低丰度的CTLA-4 mRNA不能有效被固定，从而不能有效扩增目的片段。
, 百拇医药
本研究通过计算机辅助分析，根据人CTLA-4基因序列，设计了3条引物，其中引物1#包括CTLA-4胞外区N’末端7个氨基酸残基和致瘤素M信号肽C端15个氨基酸残基；引物2#对应于CTLA-4 119-125位氨基酸残基，引物3#包含致瘤素M信号肽其余氨基酸残基并与引物1#的致瘤素M信号肽部分重叠，并在引物2#、3#的5’端分别引入BclⅠ、HindⅢ酶切位点，以使扩增产物能以粘性末端定向插入Ig融合蛋白表达载体；引物设计还满足了真核细胞基因表达“-3，+4效应理论”[9]，即：起始密码 ATG上游-3位的A和下游+4位的G可使真核基因从该ATG高效起始翻译，若-3位不是A则+4位必须是G才能进行有效翻译；致瘤素M信号肽序列可使融合蛋白高效分泌至细胞培养上清中[10]，有利于融合蛋白产物的鉴定和分离、纯化。
融合蛋白表达载体pX/Ig是将人IgG Cγ1 cDNA部分序列(含铰链区及CH2, CH3)克隆入pCDM8构建而成,将待克隆片段以正确的阅读框架插入其多克隆位点和BclⅠ位点之间，即可构建目的蛋白与IgG Fc的融合蛋白表达载体[11]。这不但能利用金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)与IgG Fc端特异结合的特性，达到从表达系统中一步纯化目的蛋白的目的；目的蛋白与人IgG的融合蛋白作为人类治疗制剂还有如下优点：CTLA-4蛋白属于免疫球蛋白超家族成员，由于结构上的同源，在体内的半寿期可能与人源抗体相似，它与抗体一样可以和靶分子特异结合，影响病理过程中起主要作用的一些反应，还可以避免由于目前临床上常用的鼠源单克隆抗体引起的异种蛋白反应。
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因此，我们选择并构建了CTLA-4/Ig融合蛋白表达载体，为进一步在哺乳动物细胞中表达CTLA-4/Ig融合蛋白，探讨其在实验室及临床的应用奠定了基础。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39993430-2)；国家科技部重点项目(96-920-20-10)；军队杰出人才基金(1996)
作者简介：易绍萱(1966-)，女，重庆市万州区人，博士，讲师，主要从事分子生物学和移植免疫学方面的研究，发表论文9篇。电话：(023)68752688
作者单位:张宁(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)
肖光夏(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)
参考文献：
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[1] Walunas T L, Lenschow D J, Bakker C Y, et al. CTLA-4 can function as a negative regulator of T cell activation[J]. Immunity, 1994,1(5):405-413.
[2] Linsley P S, Brady W, Urnes M , et al. CTLA-4 is a second receptor for the B cell activation antigen B7[J].J Exp Med, 1991 ,174(3): 561-569.
[3] Perkins D, Wang Z, Donovan C, et al. Regulation of CTLA-4 expression during T cell activation[J]. J Immunol, 1996, 156(11): 4 154-4 159.
, 百拇医药
[4] Finn P W, He H, Wang Y, et al. Synergistic induction of CTLA-4 expression by costimulation with TCR plus CD28 signals mediated by increased transcription and messenger ribonucleic acid stability[J]. J Immunol, 1997, 158(9): 4 074-4 081.
[5] Linsley P S, Greene J L, Tan P, et al. Coexpression and functional cooperation of CTLA-4 and CD28 on activated T lymphocytes [J]. J Exp Med, 1992,176(6): 1 595-1 604.
[6] Freeman G J, Lombard D B, Gimmi C D, et al. CTLA-4 and CD28 mRNA are coexpressed in most T cells after activation: Expression of CTLA-4 and CD28 mRNA does not correlate with the pattern of lymphokine production [J]. J Immunol, 1992, 149(12): 3 795-3 801.
, 百拇医药
[7] Kuiper H M, Brouwer M, Linsley P S ,et al. Activated T cells can induce high levels of CTLA-4 expression on B cells[J]. J Immunol, 1995,155(4): 1 776-1 783.
[8] Castan J, Klauenberg U, Kalmar P, et al. Expression of CTLA-4 (CD152) on human medullary CD4+ thymocytes[J]. Med Microbiol Immunol Berl, 1998, 187(1): 49-52.
[9] Kozak M. The scanning model for translation: An update [J]. J Cell Biol, 1989,108(2): 229.
, 百拇医药
[10] Malik N,Kallestad J C,Junderson N L,et al.Molecular cloning, sequence analysis and functional expression of the growth regulator, oncostatin M [J]. Mol Cell Biol, 1989, 9(7):2 847-2 852.
[11] Seidman M M, Calos M P. The development of transient SV40 based shuttle vector[J]. Mol Cell Biol, 1989，9(1): 55-60.
收稿日期：1999-11-12；修回日期：2000-05-18, http://www.100md.com
单位：易绍萱(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)；吴军(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)；姜庆(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)；王锡华(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)；李彦(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)；刘志刚(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)
关键词：CTLA-4； 融合蛋白；基因表达
第三军医大学学报000906 提 要： 目的 克隆人CTLA-4胞外区cDNA、构建人CTLA-4胞外区与人免疫球蛋白IgG Fc融合蛋白表达载体，为研究CTLA-4/Ig融合蛋白及其临床应用奠定基础。方法 从抗人CD3单克隆抗体和PMA活化的健康中国人外周血淋巴细胞总RNA中，扩增人CTLA-4基因胞外区cDNA片段，经HindⅢ+BclⅠ双酶切后定向插入Ig融合蛋白表达载体。结果 从活化人T细胞中扩增出人CTLA-4胞外区cDNA片段，并将其正确插入Ig融合蛋白表达载体，成功构建了CTLA-4/Ig融合蛋白表达载体，表达载体的构建与预期设计相符；CTLA-4基因胞外区cDNA序列与文献报道一致。结论 本研究成功地克隆了人CTLA-4胞外区cDNA片段，构建了CTLA-4/Ig融合蛋白表达载体，为进一步在哺乳动物细胞中表达CTLA-4/Ig融合蛋白、探讨其在实验室及临床的应用奠定了基础。
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中图法分类号： R394-3;R394.3 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)09-0834-04
Cloning of extracellular region of human CTLA-4 and construction of Ig fusion protein expression vector
YI Shao-xuan
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
WU Jun
, 百拇医药
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
JIANG Qing
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
WANG Xi-hua
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
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LI Yan
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
LIU Zhi-gang
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
ZHANG Ning
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
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XIAO Guang-xia
(Research Institute of Burn Injury, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
Abstract： Objective To clone an extracellular region of human CTLA-4 and construct an immunoglobulin IgG Fc fusion protein expression vector for the study of potential clinical usage of sduble CTLA-4. Methods Three PCR primers were designed based on the published CTLA-4 cDNA, a cDNA fragment was amplified by reverse-transcription methods followed by two cycles of PCR from the total RNA of anti-CD3 antibody and PMA activated human peripheral blood mononuclear cells, this fragment was then cloned into a transient expression vector containing human IgG1 Fc (including the hinge, CH2 and CH3 domain of IgG Cγ1) which was restricted by HindⅢ+BclⅠ. Results A 470 bp cDNA fragment was amplified and cloned into IgG Fc fusion protein expression vector successfully. Nucleotide sequence analysis verified that the amplifed cDNA fragment was identical to human CTLA-4 extracellular region. Conclusion Human CTLA-4/Ig fusion protein expression vector is successfully constructed. These results lay the foundation for further research in expression of CTLA-4/Ig fusion protein in mammal cells and its clinical trial.
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Key words： CTLA-4; fusion protein; gene expression
CTLA-4(Cytotoxic T lymphocyte associated antigen )是主要表达于活化T细胞表面的一种跨膜糖蛋白分子，与B7和CD28同属免疫球蛋白超家族成员，是T细胞活化中重要的负调节分子[1]。可溶性CTLA-4是人CTLA-4分子胞外区与人免疫球蛋γ1绞链区、CH2、CH3区组成的融合蛋白 ，与B7有高度的亲和力，可以阻断B7与CD28或CTLA-4结合[2]。在TCR识别外来抗原的同时给予可溶性CTLA-4，在体外可诱导T细胞无应答，在体内则可诱导特异性免疫耐受。由于其在抗器官移植排斥和治疗自身免疫病等方面的广阔应用前景，正越来越引起人们的重视。为了进一步研究可溶性CTLA-4作为特异性免疫抑制剂或免疫耐受诱导剂的作用及其机制，本研究采用基因工程的方法，克隆中国人CTLA-4基因胞外区cDNA片段，构建人CTLA-4胞外区融合蛋白表达载体，为表达、纯化CTLA-4/Ig融合蛋白，进一步探讨其在实验室及临床应用的可行性奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 质粒、菌株和细胞
融合蛋白表达载体pX/Ig由美国耶鲁大学尹志楠博士惠赠，pUC19质粒、大肠杆菌MC1061由本校分子生物学教研室保存，健康人外周血由西南医院血库提供。
1.2 试剂 鼠抗人CD3单抗(北京帮定)，PMA(Sigma)，100bpDNALadder(Gibco)，总RNA提取、cDNA合成、质粒提取、凝胶片段回收、DNA快速连接等Kit(Roche)。
1.3 引物设计合成 根据基因库中人CTLA-4基因序列，设计如下3条引物：
引物1#：CTCAGTCTGGTCCTTGACCTCCTGTTTCCAAGCATGG-CGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC
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引物2#：TTTGGGCTCCTGATCABclⅠGAATCTGGGCACGGTTC
引物3#：GCAAGCTTHindⅢCAATGGGTTGACTGCTCACACAGAGGA-
CGCTGCTCAGTTCGGTCCTTGCATCT
引物由中科院上海细胞所合成，PAGE纯化。
1.4 外周血单个核细胞(PBMC)的分离、活化及细胞总RNA的提取、鉴定
常规分离新鲜健康人PBMC， RPMI1640调节细胞密度为1ⅹ106/ml，加入PMA(15 nmol/ml)和抗CD3单抗(10 μg/ml)，37℃ 5% CO2 6 h。Tripure试剂提取活化PBMC总RNA，甲醛变性琼脂糖凝胶检测RNA完整性，紫外分光光度仪鉴定其纯度和浓度。
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1.5 cDNA第一链合成及PCR扩增以活化PBMC总RNA为模板，每20μl逆转录体系含总RNA1.0μg，5ⅹ缓冲液5μl，1.25mmol/LdNTP4μl，Oligo(dT12)0.1μg，100mmol/LDTT1μl,65℃水浴变性10min，迅速置冰上，再加入RNasin40U，AMV40U，42℃1h，沸水浴10min后进行PCR反应。先以cDNA第一链为模板，以引物1#和2#进行第一轮扩增，条件为：cDNA第一链5 μl，10ⅹPCR buffer 5 μl，10 mmol/L dNTP 4 μl，引物1#和2#各1 μl(终浓度100 nmol/L)，ddH2O 29.5 μl，95 ℃变性 7 min，加Taq 酶0.5 μl，总体积50 μl，循环条件：94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环后72 ℃ 7 min；随后以第一轮PCR反应产物为模板，以引物2#和3#进行第二轮扩增，反应条件同前，扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳分析。
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1.6 融合蛋白表达载体构建
用琼脂糖凝胶片段回收试剂盒回收目的片段，经HindⅢ、 BcⅠ双酶切后，与经同样酶切的pX/Ig载体以片段∶载体为3∶1的比例，按DNA快速连接kit说明连接，即用5ⅹDNA稀释缓冲液将片段和载体DNA稀释至10μl，加入2倍连接缓冲液10μl，混匀后加入1μlT4DNA连接酶，室温连接1 h，取2 μl连接产物转化大肠杆菌MC1061，挑选阳性转化菌落，HindⅢ、 XbaⅠ酶切鉴定重组质粒。
1.7 序列测定
酶切鉴定插入片段大小正确的重组质粒，经HindⅢ 、XbaⅠ双酶切后定向插入pUC19质粒中，采用Sanger双脱氧测序法，以质粒双链DNA为模板,在pUC19通用引物引导下,ABIPrism377全自动测序仪自动测序。
2 结果
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2.1 RT-PCR扩增CTLA-4胞外区cDNA片段 从两批活化PBMC提取的总RNA，清晰可见其内对照标准28S、18S和5SRNA条带，说明所提RNA分子完整(照片略)；所提RNA经紫外分光光度计测得D260/D280比值为1.8，纯度符合要求，可作为逆转录反应的模板。由引物2#、3#引导的第一轮PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下未观察到明显的目的条带，仅见一些微弱的DNA阳性区域；以第一轮PCR产物为模板，由引物1#、3#引导的第二轮PCR产物，2%琼脂糖凝胶上可见大小约470 bp的扩增带，与预期大小相符，见图1。
图1 RT-PCR扩增产物
M：100 bp DNA 标准；1：第二轮PCR扩增CTLA-4基因片段
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Fig 1 Amplification of extracellular region of human
CTLA-4 gene by RT-PCR
M：100 bp DNA marker；1：PCR amplified CTLA-4 gene fragment
2.2 CTLA-4胞外区与人IgG Fc融合蛋白表达载体的构建
融合蛋白表达载体构建策略如图2所示，即：将第二轮PCR扩增片段经HindⅢ、 BclⅠ双酶切后，与经同样酶切的pX/Ig载体连接，提取阳性转化菌落质粒DNA，HindⅢ、XbaⅠ酶切，能切出扩增片段与IgG Fc cDNA融合的1.2 Kb片段,与预期设计相符，将阳性质粒命名为pCTLA-4/Ig，图3为质粒构建和酶切鉴定图谱。
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图2 pCTLA-4/Ig 融合蛋白表达载体构建示意图
Fig 2 Diagram of the construction of recombinant expressionvector of pCTLA-4/Ig
图3 pCTLA-4/Ig质粒构建及酶切鉴定
M：λDNA/HindⅢ marker；1：pCTLA-4/Ig HindⅢ酶切；2：pCTLA-4/Ig HindⅢ、XbaⅠ双酶切；3：RT-PCR扩增CTLA-4胞外区片段HindⅢ、BclⅠ双酶切；4:pX-4/Ig载体HindⅢ、BclⅠ双酶切
Fig 3 Construction and identification of recombinantplasmid pCTLA-4/Ig
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M：λDNA/HindⅢ marker；1：pCTLA-4/Ig/HindⅢ；2：pCTLA-4/Ig HindⅢ，XbaⅠ; 3：PCR amplified CTLA-4 gene fragment /HindⅢ，BclⅠ； 4：Expression vector pX-4/Ig/HindⅢ，BclⅠ
2.3 CTLA-4融合蛋白cDNA序列测定
将pCTLA-4/Ig质粒中包括CTLA-4胞外区cDNA片段和IgG Fc cDNA的1.2 Kb HindⅢ-XbaⅠ片段定向亚克隆入经同样酶切的pUC19质粒，采用双链质粒DNA双向测序，经测序结果分析软件分析表明，在所测片段上下游分别找到HindⅢ和XbaⅠ酶切位点，以及CTLA-4胞外区cDNA与IgG Fc cDNA 交界处的BclⅠ酶切位点，经同源性比较分析证实，与文献[2]报道CTLA-4胞外区cDNA序列一致。
3 讨论
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CTLA-4蛋白是主要表达于活化T细胞表面的跨膜糖蛋白，多种因素刺激T细胞活化均可上调CTLA-4 mRNA及膜表面蛋白表达[3～6]。在抗CD3单抗处理PBMC时，早在活化1 h即可检测到CTLA-4 mRNA，6 h即达高峰，膜表面蛋白的表达则在24～48 h达高峰；CD28受体交联、蛋白激酶C活化剂、钙离子通道剂、以及粘附分子ICAM-1、VCAM-1等均可诱导或增强CTLA-4的表达；活化T细胞还可通过细胞与细胞直接接触的方式诱导B细胞表达高水平的膜表面CTLA-4[7]；在胸腺细胞中也发现有CTLA-4蛋白[8]。我们用抗CD3单抗(10 μg/ml)和PMA(15 nmol/L)刺激人PBMC，在共培养6 h后的细胞总RNA抽提物中，成功地扩增出CTLA-4胞外区片段。我们也曾用抗CD3单抗和PMA与人PBMC共培养，再用mRNA capture kit提取mRNA，经RT-PCR反应后并未得到预期大小的扩增带，其原因可能与CD3单抗和PMA处理诱导细胞CTLA-4表达早在6 h即可达高峰，而在24 h时，细胞mRNA水平已下降[3]；还可能与mRNA capture kit捕获mRNA的量有限，大量高丰度的mRNA占据了有限的Oligo dT结合位点，使低丰度的CTLA-4 mRNA不能有效被固定，从而不能有效扩增目的片段。
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本研究通过计算机辅助分析，根据人CTLA-4基因序列，设计了3条引物，其中引物1#包括CTLA-4胞外区N’末端7个氨基酸残基和致瘤素M信号肽C端15个氨基酸残基；引物2#对应于CTLA-4 119-125位氨基酸残基，引物3#包含致瘤素M信号肽其余氨基酸残基并与引物1#的致瘤素M信号肽部分重叠，并在引物2#、3#的5’端分别引入BclⅠ、HindⅢ酶切位点，以使扩增产物能以粘性末端定向插入Ig融合蛋白表达载体；引物设计还满足了真核细胞基因表达“-3，+4效应理论”[9]，即：起始密码 ATG上游-3位的A和下游+4位的G可使真核基因从该ATG高效起始翻译，若-3位不是A则+4位必须是G才能进行有效翻译；致瘤素M信号肽序列可使融合蛋白高效分泌至细胞培养上清中[10]，有利于融合蛋白产物的鉴定和分离、纯化。
融合蛋白表达载体pX/Ig是将人IgG Cγ1 cDNA部分序列(含铰链区及CH2, CH3)克隆入pCDM8构建而成,将待克隆片段以正确的阅读框架插入其多克隆位点和BclⅠ位点之间，即可构建目的蛋白与IgG Fc的融合蛋白表达载体[11]。这不但能利用金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)与IgG Fc端特异结合的特性，达到从表达系统中一步纯化目的蛋白的目的；目的蛋白与人IgG的融合蛋白作为人类治疗制剂还有如下优点：CTLA-4蛋白属于免疫球蛋白超家族成员，由于结构上的同源，在体内的半寿期可能与人源抗体相似，它与抗体一样可以和靶分子特异结合，影响病理过程中起主要作用的一些反应，还可以避免由于目前临床上常用的鼠源单克隆抗体引起的异种蛋白反应。
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因此，我们选择并构建了CTLA-4/Ig融合蛋白表达载体，为进一步在哺乳动物细胞中表达CTLA-4/Ig融合蛋白，探讨其在实验室及临床的应用奠定了基础。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39993430-2)；国家科技部重点项目(96-920-20-10)；军队杰出人才基金(1996)
作者简介：易绍萱(1966-)，女，重庆市万州区人，博士，讲师，主要从事分子生物学和移植免疫学方面的研究，发表论文9篇。电话：(023)68752688
作者单位:张宁(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)
肖光夏(第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038)
参考文献：
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[1] Walunas T L, Lenschow D J, Bakker C Y, et al. CTLA-4 can function as a negative regulator of T cell activation[J]. Immunity, 1994,1(5):405-413.
[2] Linsley P S, Brady W, Urnes M , et al. CTLA-4 is a second receptor for the B cell activation antigen B7[J].J Exp Med, 1991 ,174(3): 561-569.
[3] Perkins D, Wang Z, Donovan C, et al. Regulation of CTLA-4 expression during T cell activation[J]. J Immunol, 1996, 156(11): 4 154-4 159.
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[4] Finn P W, He H, Wang Y, et al. Synergistic induction of CTLA-4 expression by costimulation with TCR plus CD28 signals mediated by increased transcription and messenger ribonucleic acid stability[J]. J Immunol, 1997, 158(9): 4 074-4 081.
[5] Linsley P S, Greene J L, Tan P, et al. Coexpression and functional cooperation of CTLA-4 and CD28 on activated T lymphocytes [J]. J Exp Med, 1992,176(6): 1 595-1 604.
[6] Freeman G J, Lombard D B, Gimmi C D, et al. CTLA-4 and CD28 mRNA are coexpressed in most T cells after activation: Expression of CTLA-4 and CD28 mRNA does not correlate with the pattern of lymphokine production [J]. J Immunol, 1992, 149(12): 3 795-3 801.
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[7] Kuiper H M, Brouwer M, Linsley P S ,et al. Activated T cells can induce high levels of CTLA-4 expression on B cells[J]. J Immunol, 1995,155(4): 1 776-1 783.
[8] Castan J, Klauenberg U, Kalmar P, et al. Expression of CTLA-4 (CD152) on human medullary CD4+ thymocytes[J]. Med Microbiol Immunol Berl, 1998, 187(1): 49-52.
[9] Kozak M. The scanning model for translation: An update [J]. J Cell Biol, 1989,108(2): 229.
, 百拇医药
[10] Malik N,Kallestad J C,Junderson N L,et al.Molecular cloning, sequence analysis and functional expression of the growth regulator, oncostatin M [J]. Mol Cell Biol, 1989, 9(7):2 847-2 852.
[11] Seidman M M, Calos M P. The development of transient SV40 based shuttle vector[J]. Mol Cell Biol, 1989，9(1): 55-60.
收稿日期：1999-11-12；修回日期：2000-05-18, http://www.100md.com