血管生成抑制剂TNP-470抗肿瘤作用的研究进展
作者：杜琳琳 陈意生 史景泉 卞修武
单位：杜琳琳(第三军医大学附属西南医院病理学研究所，重庆 400038)；陈意生(第三军医大学附属西南医院病理学研究所，重庆 400038)；史景泉(第三军医大学附属西南医院病理学研究所，重庆 400038)；卞修武(第三军医大学附属西南医院病理学研究所，重庆 400038)
关键词：血管生成抑制剂；TNP-470；抗肿瘤作用
第三军医大学学报000928
中图法分类号： R979.1 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)09-0908-04
Progress on the antitumor effect of angiogenesis inhibitor TNP-470
, http://www.100md.com
原发性实体肿瘤的生长和转移依赖于血管生成(Angiogenesis)。肿瘤细胞既可通过肿瘤血管从宿主获得营养和氧气，又可通过肿瘤血管源源不断地向宿主输送肿瘤细胞，并在机体的其它部位继续生长和诱导血管生成，导致肿瘤转移[1]。因此，若能阻止肿瘤血管的形成，也就可能抑制肿瘤的生长。近年来人们已开发和研究能破坏和抑制血管生成、有效地阻止肿瘤生长和转移的药物[2,3]。TNP-470以其高效低毒的特性被认为是目前最有前途的血管生成抑制剂之一，本研究拟对TNP-470的抗肿瘤作用研究进展作一综述。
1 烟曲霉素的发现和TNP-470的合成
1990年Ingber[4]在牛毛细血管内皮细胞的常规培养中，发现一种霉菌污染，这种霉菌能明显地抑制血管内皮细胞的生长和增殖。随后他们将其分离、鉴定为烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)，并发现可抑制生长中的鸡胚绒毛膜尿囊膜的血管生成。从大量的该霉菌培养物中提纯其活性成分，经鉴定为烟曲霉素(Fumagillin)。纯化的烟曲霉素可完全抑制碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)存在状态下的血管内皮细胞的生长，对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)50%抑制剂量(IC50)为0.5 ng/ml。烟曲霉素亦能抑制小鼠肿瘤血管生成，但可引起体重减轻等明显的毒副作用。为改良烟曲霉素，Folkman与日本Takeda Chemical Industries, Ltd.合作，人工合成了一百多种烟曲霉素的类似物，并从中筛选出高效低毒的O-(氯乙酰-氨甲酰基)烟曲霉醇[O-(chloroacetylcarbamoyl) fumagillol]或称AGM-1470，即TNP-470。这种血管抑制素(Angioinhibin)对内皮细胞增殖的50%抑制浓度为10 pg/ml，较烟曲霉素强50倍以上，并能抑制多种鼠肿瘤细胞系的体外增殖和实体瘤的生长，且无明显的毒副作用。
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2 TNP-470对内皮细胞生长的影响[4]
体外试验表明，TNP-470对多种内皮细胞的增殖、迁徙和毛细血管腔形成均有明显抑制作用，包括HUVEC、牛主动脉内皮
细胞以及来自大鼠血管内皮细胞[3]。对于由于生长因子激活的内皮细胞生长,TNP-470的抑制作用存在剂量依赖性，IC50为15 pg/ml。完全抑制内皮细胞增殖所需的浓度为300 pg/ml至3 μg/ml，而这一浓度范围的抑制作用是可逆的；从培养基中撤除TNP-470 4 d后，内皮细胞便开始恢复增殖，在此期间DNA合成受到选择性的抑制。当TNP-470的浓度大于30 μg/ml时，对内皮细胞增殖的抑制性就转变为不可逆的细胞毒性作用，内皮细胞所有DNA、RNA及蛋白质合成均被抑制。这显示TNP-470对血管内皮细胞的作用是一种双阶段作用，浓度低时以抑制细胞生长为主，浓度高时以细胞毒性为主；但高浓度在临床应用上是达不到的。
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3 TNP-470对肿瘤生长和转移的作用
3.1 TNP-470对啮齿动物肿瘤模型的抗肿瘤作用
Osawa[2]应用TNP-470对N-β-N-(4-羟基丁酰)-亚硝胺(BBN)诱发大鼠膀胱癌的抗肿瘤作用进行了研究。结果显示，腹腔注入TNP-470(30 mg/kg体重)后肿瘤平均数目、体积和微血管数目显著减少,癌的发生率显著降低表明TNP-470可抑制BBN诱发的大鼠膀胱癌的生长和恶性进程，这种抑制作用主要是由于抑制了肿瘤的血管形成。Ahmed等[5]研究显示，TNP-470可显著抑制大鼠AH-130细胞系肝转移结节的数目和体积,TNP-470治疗后，转移结节的细胞表现为坏死和凋亡。
Bergers等[6]最近的研究显示，在RI PI-Tag2转基因小鼠诱发胰岛细胞癌的不同阶段应用TNP-470、血管抑制素、BB-94(Batimastat)和内皮抑制素(Endostatin)4种血管生成抑制剂，观察其对肿瘤血管生成与肿瘤体积的影响。从5～10.5周后,TNP-470对血管生成没有影响,从10～13.5周， TNP-470可使肿瘤生成率降低达82%；从12周开始，未经血管生成抑制剂处理的小鼠在13.5周全部死亡，应用血管生成抑制剂组其生存时间至少超过2周，TNP-470、血管抑制素合用内皮抑制素可使肿瘤体积显著减小。
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Matsumoto等[7]对兔舌癌VX2移植瘤的研究发现，静脉注射TNP-470对肿瘤生长的抑制呈剂量依赖性,20 mg/kg体重和40 mg/kg体重TNP-470对肿瘤生长的抑制率分别为23%和53%;肿瘤内注射TNP-470可显著抑制肿瘤的生长，5 mg/kg体重对肿瘤生长的抑制率为71%，10 mg/kg体重或20 mg/kg体重剂量使肿瘤完全消退，肿瘤微血管密度显著减小，转移灶数目显著减少。
3.2 TNP-470对人源性肿瘤的治疗作用
TNP-470可在动物体内抑制多种人肿瘤细胞系的生长。不同的肿瘤细胞对TNP-470有不同的敏感性。TNP-470对肿瘤的生长抑制作用不但存在剂量依赖性，还存在时相依赖性。Konno[3]对人胃癌细胞系(MT-2和MT-5)及结肠癌细胞系(TK-4和TK-13)的研究发现，肿瘤细胞接种至裸小鼠10 d后皮下注射30 mg/kg体重剂量TNP-470对肿瘤的生长没有影响；而MT-2和MT-5细胞接种后7 d应用同等剂量的TNP-470可显著抑制肿瘤的生长。
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Yoshida等[8]发现，TNP-470(20 mg/kg体重)可显著抑制PLC/PRF/5肝细胞瘤细胞移植瘤的生长，治疗的第3～4周，肿瘤体积明显小于对照组。TNP-470抑制肿瘤形成，同时微血管形成和巨噬细胞浸润显著减少。体外试验发现TNP-470可抑制肝细胞瘤的生长和有丝分裂，IC50为2 μg/ml，而抑制血管内皮细胞(VE)的IC50为200 ng/ml，提示肝细胞瘤细胞系对TNP-470相对不敏感。Tsukamoto等[9]亦发现皮下注射TNP-470(30 mg/kg体重)可显著抑制人肝细胞癌细胞系PLC皮下移植瘤的肿瘤体积，并抑制PLC和Huh7肝细胞瘤细胞系的微血管数目。
Qian等[10]对人鼻咽癌细胞系CNE-2移植瘤，应用TNP-470(30 mg/kg体重)皮下注射后15 d，肿瘤体积明显减小、T/C比率(治疗组肿瘤体积/对照组肿瘤体积)为0.73，组织学检查示肿瘤中心坏死明显。对人鼻咽癌细胞系NPC/HK1的研究发现，TNP-470对NPC/HK1细胞的IC50是人皮肤微血管内皮细胞(Human dermal microvascular endothelial cells,HDMEC)的3.8倍。体内试验结果显示，TNP-470可显著降低肿瘤的体积和肿瘤重量，组织学检查显示对照组肿瘤坏死的面积占肿瘤面积的0%～5%，TNP-470治疗后坏死面积占总面积的20%～40%[11]。
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TNP-470对神经源性肿瘤也有抑制作用。Wassberg等[12]对人神经母细胞瘤SH-SY5Y的研究发现，TNP-470(0～1 μg/ml)对成神经细胞瘤的体外增殖和嗜铬细胞分化没有作用。肿瘤血管生成定量研究显示，TNP-470可显著抑制移植瘤肿瘤的血管长度(Lv)、肿瘤血管的体积(Vv)和肿瘤血管的表面积(Sv)。与对照组相比，TNP-470可使移植瘤的凋亡指数增加3倍以上，经TNP-470治疗的移植瘤，瘤细胞围绕血管中心呈袖套样重构，形成10～15层细胞的血管周套。增殖细胞主要位于血管周套的内层和中层，凋亡细胞位于外层。血管周套中层和外层的瘤细胞呈典型的肾上腺外嗜铬细胞分化，IGF-2和酪氨酸羟化酶(TH)表达明显增加。相关分析显示，IGF-2和TH表达、凋亡指数与各种血管分析参数呈负相关。
3.3 TNP-470对肿瘤转移的抑制作用
癌细胞转移需要血管生成。由于新生毛细血管的渗漏性，增加了肿瘤细胞进入循环的机会。原发灶新生血管的早期抑制可防止肿瘤细胞进入循环；阻断血管生成可使肿瘤细胞休眠，使肉眼能见的转移得到抑制。Watson等[13]将大鼠结肠腺癌K12/TRb细胞注入BD-Ⅸ大鼠脾脏，发现皮下注射TNP-470可抑制结肠癌的肝转移。Yatsunami等[14]的研究也发现，TNP-470可显著抑制B16BL6黑色素瘤细胞的体外增殖，对黑色素瘤移植瘤生长和血管生成以及肺内转移结节均有明显抑制作用。Ohta等[15]以人纤维肉瘤细胞株HT-1080建立裸小鼠淋巴结转移模型，以PCR检测和Sourthern印迹技术分析人珠蛋白相关基因片段来鉴定肿瘤淋巴结转移，发现TNP-470对淋巴结转移有显著抑制作用，且存在剂量依赖性。作者还发现TNP-470对淋巴结转移的抑制效果比对原发瘤生长的抑制更为明显。Qin等[16]对人转移性肝细胞癌细胞系(LCI-D20)裸鼠模型的研究发现,在肿瘤接种后1～15 d，每两天皮下注射30 mg/kg体重剂量的TNP-470后，可显著抑制肿瘤的生长和肺转移。
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4 与其它肿瘤治疗模式联合应用
虽然血管生成是肿瘤生长所必须的，但单凭这种治疗模式很可能不能治愈肿瘤。如何将抗血管生成治疗与现行的其它治疗模式有机地结合，进行多靶攻击以提高抗肿瘤治疗的疗效，已成为目前研究的热点。
动物体内实验已发现TNP-470可增强丝裂霉素(MMC)、阿霉素(ADM)、环磷酰胺(CTX)、顺铂(CDDP)、BCNU和5-FU对部分肿瘤的疗效。TNP-470合用米诺环素后可增加化疗药物的抗肿瘤作用，移植瘤皮下注射TNP-470和米诺环素4～8 d后，再用单剂量CTX，虽对原发瘤的生长没有影响，但能使肝和肺内EMT-6肿瘤细胞杀伤增加10～100倍，骨髓中增加5～8倍，脑内增加2～5倍。Satoh等[17]研究发现，TNP-470对人非小细胞癌细胞系TKB-13和TKB-30的增殖有抑制作用，其IC50分别为50 μmol/L和62.5 μmol/L。TNP-470合用紫杉酚后对这两个细胞系可产生协同或加成性抑制作用。Shishido等[18]的研究发现，TNP-470合用CDDP后可显著抑制人胰腺癌细胞系HPC-3H4皮下移植瘤的肿瘤生长;90 mg/kg体重 TNP-470合用CDDP(0.25 mg/kg体重)可显著抑制小鼠肿瘤肝转移的数目;且未观察到体重减轻，肝、肾、肺和心脏无明显组织学异常，也未发现由于药物副作用引起的死亡。
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Kakeji等[19]研究数种血管生成抑制剂(TNP-470、米诺环素、苏拉明、5，7，4-三羟基异黄酮)与化疗联合应用，发现当联合两种血管生成抑制剂作为化疗辅助剂时，抗癌作用明显增强，且TNP-470和米诺环素组合最佳。TNP-470和米诺环素及环磷酰胺合用可治愈40%的Lewis肺癌鼠。
5 TNP-470的作用机制
TNP-470对内皮细胞增殖抑制作用的确切机理尚未阐明。有研究表明，TNP-470的主要作用靶点是正常内皮细胞的细胞周期。流式细胞计数分析证实，TNP-470特异性阻滞正常内皮细胞进入周期的G1期，使G0期细胞所占百分数上升。TNP-470处理的HUVEC孵育超过21 h后，G0/G1期细胞比例上升，而G2/M期和S期细胞比例下降。TNP-470可完全阻滞血管生长因子bFGF诱导的内皮细胞增生，而转化后的内皮细胞Ea.hy926和cEnd.1对TNP-470不敏感，说明TNP-470可能影响一种在正常内皮细胞进入G1期的过程中起关键作用的细胞周期调控通道，而转化的细胞可通过其它旁路绕开这种抑制作用。TNP-470可抑制内皮细胞周期素依赖性激酶cdc2、cdk2的激活及Rb蛋白磷酸化，但不影响早期有丝分裂因素如细胞蛋白酪氨酰基磷酸化、c-fos、c-myc、cdk4、cdk2及CyclinD1的表达。因而认为TNP-470的作用点在G1晚期。而Hori等[20]报道以bFGF诱导HUVEC后2～6 h给予TNP-470可抑制其DNA合成及CyclinD1 mRNA的表达而不影响c-myc mRNA表达。在TNP-470不敏感的Wipr细胞，刺激后2～6 h给予TNP-470并不抑制CyclinD1 mRNA表达，由此认为TNP-470对HUVEC增殖的抑制作用是通过G1中期CyclinD1 mRNA表达而实现的。这些结果的差异可能与实验设计方法有关，包括刺激时间以及接种时间的差异，表明TNP-470作用的复杂性。有关TNP-470对内皮细胞周期的调节尚有待进一步研究。
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近来的研究表明，TNP-470可与Ⅱ型蛋氨酸氨基肽酶(MetAP2)结合而抑制MetAP2的蛋氨酸氨基肽酶活性，却不影响MetAP2对ELF-2α磷酸化的抑制作用。在烟曲霉素类似物中，同时测定其对MetAP2的抑制活性及对内皮细胞增殖的抑制活性发现二者间有明显相关性，提示TNP-470作用机制可能与MetAP-2有关。
另有作者报道，TNP-470可抑制细胞端粒酶活性并诱导细胞凋亡。Yamamoto等[21]用二十碳五烯酸(EPA)联合TNP-470对5个人乳腺癌细胞系的研究发现， TNP-470处理60 h后，出现G1亚群，合用EPA后G1亚群进一步增加。在72 h，G0/G1期细胞比率增加，S期和G2+M期细胞减少。电镜观察示TNP-470处理24 h后，可见细胞皱缩，核碎裂，微绒毛消失，胞膜泡状化，邻近的肿瘤细胞胞浆内可见被吞噬的凋亡细胞。用流式细胞仪对Bcl-2、Bax蛋白表达的研究发现，TNP-470可使Bcl-2表达显著下降，Bax表达显著增加。Western blot分析显示TNP-470处理60 h后Bcl-Xs表达显著上调，Bcl-XL表达显著下降。
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Fujimoto等[22]应用酶联免疫吸附技术和RT-PCR技术，观察了TNP-470对子宫内膜癌细胞系bFGF的影响，发现TNP-470可使未分化的子宫内膜癌细胞系AN3CA的bFGF mRNA表达降低，而对分化好的子宫内膜癌细胞系Ishikawa没有影响，提示在未分化的子宫内膜癌中，TNP-470可能通过抑制肿瘤源性bFGF而间接抑制血管生成。
6 存在的问题
有关TNP-470的抗肿瘤作用的研究已有不少报道，并显示了其良好的应用前景，但也存在不少问题。TNP-470对宿主组织的作用知道尚少，早期的研究显示，抑制内皮细胞增殖的浓度亦可抑制正常成纤维细胞的增殖。TNP-470对免疫系统作用的研究结果显示其可调节体外培养的小鼠和人T细胞功能，且具有时间依赖性[ 1]。研究亦表明TNP-470可诱导人和小鼠B淋巴细胞增殖能力，但对T细胞的增殖作用不明显，而且TNP-470需T淋巴细胞的参与(T细胞与B细胞直接接触)以启动B淋巴细胞的增殖，进而引起其数量的增加。皮下或腹腔内注射药物学剂量的TNP-470，分别导致腋窝和肠系膜淋巴结显著增大。TNP-470亦可明显减低荷瘤小鼠的脾重。
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由于TNP-470没有高度选择性，它不仅抑制肿瘤血管生成，也抑制正常血管生成。初步研究显示，TNP-470对伤口愈合的影响存在一定的时间范围，给非妊娠小鼠长期用药会抑制黄体和子宫内膜的成熟；给妊娠小鼠用药则会干扰蜕膜化、抑制胎盘和卵黄囊的形成、抑制胚胎血管发育，最终阻断胚胎生长[1]。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570295)
作者简介：杜琳琳(1969-)，女，山西省介休市人，博士，助教，主要从事胶质瘤诱导分化和血管生成方面的研究。电话：(023)68752246
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收稿日期：2000-02-25；修回日期：2000-04-02, http://www.100md.com
单位：杜琳琳(第三军医大学附属西南医院病理学研究所，重庆 400038)；陈意生(第三军医大学附属西南医院病理学研究所，重庆 400038)；史景泉(第三军医大学附属西南医院病理学研究所，重庆 400038)；卞修武(第三军医大学附属西南医院病理学研究所，重庆 400038)
关键词：血管生成抑制剂；TNP-470；抗肿瘤作用
第三军医大学学报000928
中图法分类号： R979.1 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)09-0908-04
Progress on the antitumor effect of angiogenesis inhibitor TNP-470
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原发性实体肿瘤的生长和转移依赖于血管生成(Angiogenesis)。肿瘤细胞既可通过肿瘤血管从宿主获得营养和氧气，又可通过肿瘤血管源源不断地向宿主输送肿瘤细胞，并在机体的其它部位继续生长和诱导血管生成，导致肿瘤转移[1]。因此，若能阻止肿瘤血管的形成，也就可能抑制肿瘤的生长。近年来人们已开发和研究能破坏和抑制血管生成、有效地阻止肿瘤生长和转移的药物[2,3]。TNP-470以其高效低毒的特性被认为是目前最有前途的血管生成抑制剂之一，本研究拟对TNP-470的抗肿瘤作用研究进展作一综述。
1 烟曲霉素的发现和TNP-470的合成
1990年Ingber[4]在牛毛细血管内皮细胞的常规培养中，发现一种霉菌污染，这种霉菌能明显地抑制血管内皮细胞的生长和增殖。随后他们将其分离、鉴定为烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)，并发现可抑制生长中的鸡胚绒毛膜尿囊膜的血管生成。从大量的该霉菌培养物中提纯其活性成分，经鉴定为烟曲霉素(Fumagillin)。纯化的烟曲霉素可完全抑制碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)存在状态下的血管内皮细胞的生长，对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)50%抑制剂量(IC50)为0.5 ng/ml。烟曲霉素亦能抑制小鼠肿瘤血管生成，但可引起体重减轻等明显的毒副作用。为改良烟曲霉素，Folkman与日本Takeda Chemical Industries, Ltd.合作，人工合成了一百多种烟曲霉素的类似物，并从中筛选出高效低毒的O-(氯乙酰-氨甲酰基)烟曲霉醇[O-(chloroacetylcarbamoyl) fumagillol]或称AGM-1470，即TNP-470。这种血管抑制素(Angioinhibin)对内皮细胞增殖的50%抑制浓度为10 pg/ml，较烟曲霉素强50倍以上，并能抑制多种鼠肿瘤细胞系的体外增殖和实体瘤的生长，且无明显的毒副作用。
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2 TNP-470对内皮细胞生长的影响[4]
体外试验表明，TNP-470对多种内皮细胞的增殖、迁徙和毛细血管腔形成均有明显抑制作用，包括HUVEC、牛主动脉内皮
细胞以及来自大鼠血管内皮细胞[3]。对于由于生长因子激活的内皮细胞生长,TNP-470的抑制作用存在剂量依赖性，IC50为15 pg/ml。完全抑制内皮细胞增殖所需的浓度为300 pg/ml至3 μg/ml，而这一浓度范围的抑制作用是可逆的；从培养基中撤除TNP-470 4 d后，内皮细胞便开始恢复增殖，在此期间DNA合成受到选择性的抑制。当TNP-470的浓度大于30 μg/ml时，对内皮细胞增殖的抑制性就转变为不可逆的细胞毒性作用，内皮细胞所有DNA、RNA及蛋白质合成均被抑制。这显示TNP-470对血管内皮细胞的作用是一种双阶段作用，浓度低时以抑制细胞生长为主，浓度高时以细胞毒性为主；但高浓度在临床应用上是达不到的。
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3 TNP-470对肿瘤生长和转移的作用
3.1 TNP-470对啮齿动物肿瘤模型的抗肿瘤作用
Osawa[2]应用TNP-470对N-β-N-(4-羟基丁酰)-亚硝胺(BBN)诱发大鼠膀胱癌的抗肿瘤作用进行了研究。结果显示，腹腔注入TNP-470(30 mg/kg体重)后肿瘤平均数目、体积和微血管数目显著减少,癌的发生率显著降低表明TNP-470可抑制BBN诱发的大鼠膀胱癌的生长和恶性进程，这种抑制作用主要是由于抑制了肿瘤的血管形成。Ahmed等[5]研究显示，TNP-470可显著抑制大鼠AH-130细胞系肝转移结节的数目和体积,TNP-470治疗后，转移结节的细胞表现为坏死和凋亡。
Bergers等[6]最近的研究显示，在RI PI-Tag2转基因小鼠诱发胰岛细胞癌的不同阶段应用TNP-470、血管抑制素、BB-94(Batimastat)和内皮抑制素(Endostatin)4种血管生成抑制剂，观察其对肿瘤血管生成与肿瘤体积的影响。从5～10.5周后,TNP-470对血管生成没有影响,从10～13.5周， TNP-470可使肿瘤生成率降低达82%；从12周开始，未经血管生成抑制剂处理的小鼠在13.5周全部死亡，应用血管生成抑制剂组其生存时间至少超过2周，TNP-470、血管抑制素合用内皮抑制素可使肿瘤体积显著减小。
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Matsumoto等[7]对兔舌癌VX2移植瘤的研究发现，静脉注射TNP-470对肿瘤生长的抑制呈剂量依赖性,20 mg/kg体重和40 mg/kg体重TNP-470对肿瘤生长的抑制率分别为23%和53%;肿瘤内注射TNP-470可显著抑制肿瘤的生长，5 mg/kg体重对肿瘤生长的抑制率为71%，10 mg/kg体重或20 mg/kg体重剂量使肿瘤完全消退，肿瘤微血管密度显著减小，转移灶数目显著减少。
3.2 TNP-470对人源性肿瘤的治疗作用
TNP-470可在动物体内抑制多种人肿瘤细胞系的生长。不同的肿瘤细胞对TNP-470有不同的敏感性。TNP-470对肿瘤的生长抑制作用不但存在剂量依赖性，还存在时相依赖性。Konno[3]对人胃癌细胞系(MT-2和MT-5)及结肠癌细胞系(TK-4和TK-13)的研究发现，肿瘤细胞接种至裸小鼠10 d后皮下注射30 mg/kg体重剂量TNP-470对肿瘤的生长没有影响；而MT-2和MT-5细胞接种后7 d应用同等剂量的TNP-470可显著抑制肿瘤的生长。
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Yoshida等[8]发现，TNP-470(20 mg/kg体重)可显著抑制PLC/PRF/5肝细胞瘤细胞移植瘤的生长，治疗的第3～4周，肿瘤体积明显小于对照组。TNP-470抑制肿瘤形成，同时微血管形成和巨噬细胞浸润显著减少。体外试验发现TNP-470可抑制肝细胞瘤的生长和有丝分裂，IC50为2 μg/ml，而抑制血管内皮细胞(VE)的IC50为200 ng/ml，提示肝细胞瘤细胞系对TNP-470相对不敏感。Tsukamoto等[9]亦发现皮下注射TNP-470(30 mg/kg体重)可显著抑制人肝细胞癌细胞系PLC皮下移植瘤的肿瘤体积，并抑制PLC和Huh7肝细胞瘤细胞系的微血管数目。
Qian等[10]对人鼻咽癌细胞系CNE-2移植瘤，应用TNP-470(30 mg/kg体重)皮下注射后15 d，肿瘤体积明显减小、T/C比率(治疗组肿瘤体积/对照组肿瘤体积)为0.73，组织学检查示肿瘤中心坏死明显。对人鼻咽癌细胞系NPC/HK1的研究发现，TNP-470对NPC/HK1细胞的IC50是人皮肤微血管内皮细胞(Human dermal microvascular endothelial cells,HDMEC)的3.8倍。体内试验结果显示，TNP-470可显著降低肿瘤的体积和肿瘤重量，组织学检查显示对照组肿瘤坏死的面积占肿瘤面积的0%～5%，TNP-470治疗后坏死面积占总面积的20%～40%[11]。
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TNP-470对神经源性肿瘤也有抑制作用。Wassberg等[12]对人神经母细胞瘤SH-SY5Y的研究发现，TNP-470(0～1 μg/ml)对成神经细胞瘤的体外增殖和嗜铬细胞分化没有作用。肿瘤血管生成定量研究显示，TNP-470可显著抑制移植瘤肿瘤的血管长度(Lv)、肿瘤血管的体积(Vv)和肿瘤血管的表面积(Sv)。与对照组相比，TNP-470可使移植瘤的凋亡指数增加3倍以上，经TNP-470治疗的移植瘤，瘤细胞围绕血管中心呈袖套样重构，形成10～15层细胞的血管周套。增殖细胞主要位于血管周套的内层和中层，凋亡细胞位于外层。血管周套中层和外层的瘤细胞呈典型的肾上腺外嗜铬细胞分化，IGF-2和酪氨酸羟化酶(TH)表达明显增加。相关分析显示，IGF-2和TH表达、凋亡指数与各种血管分析参数呈负相关。
3.3 TNP-470对肿瘤转移的抑制作用
癌细胞转移需要血管生成。由于新生毛细血管的渗漏性，增加了肿瘤细胞进入循环的机会。原发灶新生血管的早期抑制可防止肿瘤细胞进入循环；阻断血管生成可使肿瘤细胞休眠，使肉眼能见的转移得到抑制。Watson等[13]将大鼠结肠腺癌K12/TRb细胞注入BD-Ⅸ大鼠脾脏，发现皮下注射TNP-470可抑制结肠癌的肝转移。Yatsunami等[14]的研究也发现，TNP-470可显著抑制B16BL6黑色素瘤细胞的体外增殖，对黑色素瘤移植瘤生长和血管生成以及肺内转移结节均有明显抑制作用。Ohta等[15]以人纤维肉瘤细胞株HT-1080建立裸小鼠淋巴结转移模型，以PCR检测和Sourthern印迹技术分析人珠蛋白相关基因片段来鉴定肿瘤淋巴结转移，发现TNP-470对淋巴结转移有显著抑制作用，且存在剂量依赖性。作者还发现TNP-470对淋巴结转移的抑制效果比对原发瘤生长的抑制更为明显。Qin等[16]对人转移性肝细胞癌细胞系(LCI-D20)裸鼠模型的研究发现,在肿瘤接种后1～15 d，每两天皮下注射30 mg/kg体重剂量的TNP-470后，可显著抑制肿瘤的生长和肺转移。
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4 与其它肿瘤治疗模式联合应用
虽然血管生成是肿瘤生长所必须的，但单凭这种治疗模式很可能不能治愈肿瘤。如何将抗血管生成治疗与现行的其它治疗模式有机地结合，进行多靶攻击以提高抗肿瘤治疗的疗效，已成为目前研究的热点。
动物体内实验已发现TNP-470可增强丝裂霉素(MMC)、阿霉素(ADM)、环磷酰胺(CTX)、顺铂(CDDP)、BCNU和5-FU对部分肿瘤的疗效。TNP-470合用米诺环素后可增加化疗药物的抗肿瘤作用，移植瘤皮下注射TNP-470和米诺环素4～8 d后，再用单剂量CTX，虽对原发瘤的生长没有影响，但能使肝和肺内EMT-6肿瘤细胞杀伤增加10～100倍，骨髓中增加5～8倍，脑内增加2～5倍。Satoh等[17]研究发现，TNP-470对人非小细胞癌细胞系TKB-13和TKB-30的增殖有抑制作用，其IC50分别为50 μmol/L和62.5 μmol/L。TNP-470合用紫杉酚后对这两个细胞系可产生协同或加成性抑制作用。Shishido等[18]的研究发现，TNP-470合用CDDP后可显著抑制人胰腺癌细胞系HPC-3H4皮下移植瘤的肿瘤生长;90 mg/kg体重 TNP-470合用CDDP(0.25 mg/kg体重)可显著抑制小鼠肿瘤肝转移的数目;且未观察到体重减轻，肝、肾、肺和心脏无明显组织学异常，也未发现由于药物副作用引起的死亡。
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Kakeji等[19]研究数种血管生成抑制剂(TNP-470、米诺环素、苏拉明、5，7，4-三羟基异黄酮)与化疗联合应用，发现当联合两种血管生成抑制剂作为化疗辅助剂时，抗癌作用明显增强，且TNP-470和米诺环素组合最佳。TNP-470和米诺环素及环磷酰胺合用可治愈40%的Lewis肺癌鼠。
5 TNP-470的作用机制
TNP-470对内皮细胞增殖抑制作用的确切机理尚未阐明。有研究表明，TNP-470的主要作用靶点是正常内皮细胞的细胞周期。流式细胞计数分析证实，TNP-470特异性阻滞正常内皮细胞进入周期的G1期，使G0期细胞所占百分数上升。TNP-470处理的HUVEC孵育超过21 h后，G0/G1期细胞比例上升，而G2/M期和S期细胞比例下降。TNP-470可完全阻滞血管生长因子bFGF诱导的内皮细胞增生，而转化后的内皮细胞Ea.hy926和cEnd.1对TNP-470不敏感，说明TNP-470可能影响一种在正常内皮细胞进入G1期的过程中起关键作用的细胞周期调控通道，而转化的细胞可通过其它旁路绕开这种抑制作用。TNP-470可抑制内皮细胞周期素依赖性激酶cdc2、cdk2的激活及Rb蛋白磷酸化，但不影响早期有丝分裂因素如细胞蛋白酪氨酰基磷酸化、c-fos、c-myc、cdk4、cdk2及CyclinD1的表达。因而认为TNP-470的作用点在G1晚期。而Hori等[20]报道以bFGF诱导HUVEC后2～6 h给予TNP-470可抑制其DNA合成及CyclinD1 mRNA的表达而不影响c-myc mRNA表达。在TNP-470不敏感的Wipr细胞，刺激后2～6 h给予TNP-470并不抑制CyclinD1 mRNA表达，由此认为TNP-470对HUVEC增殖的抑制作用是通过G1中期CyclinD1 mRNA表达而实现的。这些结果的差异可能与实验设计方法有关，包括刺激时间以及接种时间的差异，表明TNP-470作用的复杂性。有关TNP-470对内皮细胞周期的调节尚有待进一步研究。
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近来的研究表明，TNP-470可与Ⅱ型蛋氨酸氨基肽酶(MetAP2)结合而抑制MetAP2的蛋氨酸氨基肽酶活性，却不影响MetAP2对ELF-2α磷酸化的抑制作用。在烟曲霉素类似物中，同时测定其对MetAP2的抑制活性及对内皮细胞增殖的抑制活性发现二者间有明显相关性，提示TNP-470作用机制可能与MetAP-2有关。
另有作者报道，TNP-470可抑制细胞端粒酶活性并诱导细胞凋亡。Yamamoto等[21]用二十碳五烯酸(EPA)联合TNP-470对5个人乳腺癌细胞系的研究发现， TNP-470处理60 h后，出现G1亚群，合用EPA后G1亚群进一步增加。在72 h，G0/G1期细胞比率增加，S期和G2+M期细胞减少。电镜观察示TNP-470处理24 h后，可见细胞皱缩，核碎裂，微绒毛消失，胞膜泡状化，邻近的肿瘤细胞胞浆内可见被吞噬的凋亡细胞。用流式细胞仪对Bcl-2、Bax蛋白表达的研究发现，TNP-470可使Bcl-2表达显著下降，Bax表达显著增加。Western blot分析显示TNP-470处理60 h后Bcl-Xs表达显著上调，Bcl-XL表达显著下降。
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Fujimoto等[22]应用酶联免疫吸附技术和RT-PCR技术，观察了TNP-470对子宫内膜癌细胞系bFGF的影响，发现TNP-470可使未分化的子宫内膜癌细胞系AN3CA的bFGF mRNA表达降低，而对分化好的子宫内膜癌细胞系Ishikawa没有影响，提示在未分化的子宫内膜癌中，TNP-470可能通过抑制肿瘤源性bFGF而间接抑制血管生成。
6 存在的问题
有关TNP-470的抗肿瘤作用的研究已有不少报道，并显示了其良好的应用前景，但也存在不少问题。TNP-470对宿主组织的作用知道尚少，早期的研究显示，抑制内皮细胞增殖的浓度亦可抑制正常成纤维细胞的增殖。TNP-470对免疫系统作用的研究结果显示其可调节体外培养的小鼠和人T细胞功能，且具有时间依赖性[ 1]。研究亦表明TNP-470可诱导人和小鼠B淋巴细胞增殖能力，但对T细胞的增殖作用不明显，而且TNP-470需T淋巴细胞的参与(T细胞与B细胞直接接触)以启动B淋巴细胞的增殖，进而引起其数量的增加。皮下或腹腔内注射药物学剂量的TNP-470，分别导致腋窝和肠系膜淋巴结显著增大。TNP-470亦可明显减低荷瘤小鼠的脾重。
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由于TNP-470没有高度选择性，它不仅抑制肿瘤血管生成，也抑制正常血管生成。初步研究显示，TNP-470对伤口愈合的影响存在一定的时间范围，给非妊娠小鼠长期用药会抑制黄体和子宫内膜的成熟；给妊娠小鼠用药则会干扰蜕膜化、抑制胎盘和卵黄囊的形成、抑制胚胎血管发育，最终阻断胚胎生长[1]。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570295)
作者简介：杜琳琳(1969-)，女，山西省介休市人，博士，助教，主要从事胶质瘤诱导分化和血管生成方面的研究。电话：(023)68752246
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收稿日期：2000-02-25；修回日期：2000-04-02, http://www.100md.com