大剂量Bcl-2反义硫代磷酸寡核苷酸对细胞系的毒性作用
作者：林艳娟 吕联煌 陈志哲
单位：350001 福州，福建医科大学附属协和医院 福建省血液病研究所
关键词：寡核苷酸类；反义；毒性试验；细胞系
中华医学杂志000921 【摘要】 目的 探讨大剂量Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(AS-PS-ODN, ASPO)对HL60细胞系的毒性作用，同时了解毒性与剂量的关系。方法 应用四氮唑蓝比色法、台盼蓝拒染试验，CFU-HL60克隆培养法观察大剂量Bcl-2 ASPO对HL60细胞的毒性作用，同时应用免疫细胞化学染色及流式细胞仪检测 P26 Bcl-2蛋白表达，吖啶橙染色及DNA片段电泳对细胞凋亡的观察。并以其正义PS-ODN(SPO)为反义序列非特异性毒性对照。用SPSS软件包进行剂量-效应曲线直线化回归分析。结果 (1)当ASPO、SPO剂量为20 μmol/L时，即出现对HL60细胞生长的非特异性毒性作用；在160 μmol/L时，其非特异性毒性出现明显增加。对HL60细胞生长的抑制率分别为40%、18%。(2)量效曲线回归分析表明当剂量为262 μmol/L时，ASPO与SPO的毒性作用无差别。(3) 160 μmol/L ASPO、SPO对Bcl-2蛋白表达率分别为28%、78%，将ASPO、SPO作用后的HL60细胞进行克隆传代发现Bcl-2表达阳性率反跳分别达 99.6%、97.8%。结论 Bcl-2 ASPO虽为低毒药物，但仍存在剂量依赖性毒性作用。其对HL60细胞作用的适合剂量以不超过134 μmol/L为宜。
, http://www.100md.com
The toxic effects of high-dose Bcl-2 antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides incubation on cell line
LIN Yanjuan
(Union Hospital Affiliate to Fujian Medical University, Fujian Insititute of Hematology, Fuzhou 350001, China)
L
Lianhuang
(Union Hospital Affiliate to Fujian Medical University, Fujian Insititute of Hematology, Fuzhou 350001, China)
, http://www.100md.com
CHEN Zhizhe.
(Union Hospital Affiliate to Fujian Medical University, Fujian Insititute of Hematology, Fuzhou 350001, China)
【Abstract】 Objective To investigate the toxic effects of high-dose Bcl-2 antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides (AS-PS-ODN, ASPO) incubation on HL60 cells and to understand the relationship between the dose of ASPO and the toxicity. Methods Cellular viability and toxicity were detected by trypan blue exclusion, colony-forming unit HL60 cells and MTT assay. The expression of Bcl-2 protein was determined by immunocytochemistry and flow cytometry analysis. The proportion of apoptosis cells was tested by acridine orange (AO) standing. The sense (PS-ODN, SPO) was chosen for the toxic control of independent sequence. The curves of dose-effect and dose-toxicity were transfered into straight line and the reguession analysis was done by computer with the SPSS soften-ware. Results When the dose of Bcl-2 PS-ODN was higher than 20 μmol/L, the non-specific effect of suppressing cell proliferation could occur. When the dose of Bcl-2 PS-ODN was more than 160 μmol/L, the non-specific effect (toxic effect) increased significantly. When the dose of Bcl-2 ASPO was higher than 80 μmol/L, the specific effect of inhibitting the expression of Bcl-2 proteion increased slowly. When the dose of PS-ODN reached 262 μmol/L, the toxic effect had no significant differences between Bcl-2 ASPO and Bcl-2 SPO. In the presence of ASPO or SPO at 160 μmol/L, the expression of Bcl-2 protein in the two groups of HL60 was decreased to 28% and 78% respectively, after 72 hours of incubation. The expression of Bcl-2 protein in the groups of HL60 which were passaged after incubation with ASPO or SPO was reinereased to 99.6% and 97.8%, respectively. Conclusion Although ASPO is a kind of low-toxic drug, the toxic effects of Bcl-2 ASPO seem to be dependent on the dose increasing to a certain extent. It is clear that it can be used over a wide range of doses, however. Our results may also provide some referring concentrations of Bcl-2 ASPO for the pharmacodynamic and toxicological study in vivo in future.
, http://www.100md.com
【Key words】 Oligodeoxynucleotides, antisense； Toxicity, tests； Cell line
国外仅有少数对反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(AS-PS-ODN,ASPO)的毒性进行了研究，发现均可产生不同程度的毒副作用，且相同程度的副作用，所要求的不同反义寡核苷酸的浓度不同[1]。关于Bcl-2 ASPO的药效学作用在国内、外文献中均有较为肯定的报道，然而对其毒性的研究，目前尚少见报道。为此我们应用大剂量ASPO作用于HL60细胞，观察其产生特异性效应的同时产生细胞毒性作用的程度和剂量范围。
材料和方法
1.细胞及培养体系：HL60细胞株(由福建省医学科学研究所提供)。用含体积分数0.1的胎牛血清(美国Gibco-BRL)的RPMI 1640培养液，置37℃、体积分数0.05的CO2、饱和湿度的培养箱中培养，2 d传代1次。实验用的细胞均保持在(0.1～0.5)×106/ml密度，处于对数生长期。
, 百拇医药
2.PS-ODN的合成：反义PS-ODN(ASPO)序列[2]为5′-CAGCGTGCGCCATCCTTCCC-3′为Bcl-2的mRNA开放阅读框架(-7～+13)的 20个碱基，并以20nt正义PS-ODN(SPO)为反义序列非特异性毒性对照，序列为5′-GGGAAGGATGGCGCACGCTG-3′。均由美国ABI公司392型DNA/RNA合成仪合成，合成过程严格按说明书进行，合成物用OPC柱纯化，于紫外分光光度分析仪 (DU 640型，美国BECKMAN公司)定量，分装冻干后保存于-40℃。
3.检测ASPO和SPO对HL60细胞的毒性作用：按文献[3，4]方法略加改良简述如下：HL60细胞的终浓度1×105/ml种于96孔培养板，50 μl/孔，设对照组(细胞+培养液)，反义组加ASPO使终浓度分别为5、20、40、80、160、320 μmol/L；正义组加SPO使终浓度同反义组、零点组(全培养液无细胞)，每个浓度同时设2个平行孔。于37℃、体积分数0.05 CO2的饱和湿度的培养箱中培养72 h后，加入MTT (上海华美公司)(0.01 mol/L、pH 7.4、PBS溶解5 mg/ml)10 μl/孔，零点组不加MTT溶液。培养4 h后，加二甲基亚砜(DMSO)150 μl/孔终止反应，在微量振荡器上振摇使甲颗粒充分溶解，以零点组校正零点，在Bil-TEKEL311型酶标仪上测490 nm波长的吸光度(A)值，取各浓度组平均A值分别计算细胞抑制率(细胞毒性)和细胞存活率。
, 百拇医药
细胞抑制率＝(1-正义组、反义组A值/对照组A值)×100%
细胞存活率＝(正义组、反义组A值/对照组A值)×100%
4.细胞免疫化学法检测Bcl-2蛋白表达：于培养72 h收集各组细胞，细胞免疫化学染色方法及分级标准参照文献[5]介绍的方法。
5.大剂量ASPO和SPO与HL60细胞共培养：HL60细胞终浓度为1×105/ml，培养设对照组、正义组、反义组。ASPO、SPO终浓度均为160 μmol/L，种于96孔培养板(Costar)，每孔50 μl，同时做3孔，培养过程不换液。于培养72 h做以下实验观察：(1)台盼蓝拒染试验及HL60细胞克隆(CFU-HL60)培养方法参见文献[6]方法，将克隆细胞的换液传代后用流式细胞仪检测P26 Bcl-2蛋白表达；(2)流式细胞仪检测 P26 Bcl-2 蛋白表达按文献[5]方法；(3)活细胞悬液吖啶橙染色检测细胞凋亡率。方法及结果判断按文献[7]方法。
, 百拇医药
HL60细胞终浓度为5×105/ml的培养：设对照组、反义组、正义组，ASPO、SPO终浓度均为160 μmol/L，于培养48 h收集细胞做DNA抽提和电泳，观察DNA降解片段[7]。
6.统计学处理：用SPSS软件包进行t检验和量效曲线直线化回归分析。
结果
1.ASPO和SPO对HL60细胞毒性作用及量效分析：HL60细胞分别经不同浓度ASPO，SPO作用后发现随着浓度的增大，对HL60细胞生长的抑制率增大，当ASPO、SPO剂量在20 μmol/L时，出现非特异性毒性作用，对HL60细胞生长的抑制率分别为10%、1%。当160 μmol/L时非特异性毒作用显著增加抑制率分别为40%、18%(图1)。应用SPSS软件系统进行量效曲线直线化回归分析，不同剂量ASPO对HL60细胞作用的存活率，不同剂量SPO对HL60细胞生长的抑制率以及不同剂量ASPO作用后HL60细胞Bcl-2蛋白表达变化曲线，计算出ASPO对HL60细胞作用的最大效应-最小毒性剂量为134 μmol/L(A点)，当剂量大于262 μmol/L(B点)时，ASPO与SPO的毒性作用已无差别(图2)。
, http://www.100md.com
图1 ASPO、SPO对HL60细胞毒抑制率的
剂量-效应曲线
y1:SPO的细胞抑制率，y2:ASPO的细胞存活率，y3:ASPO的Bcl-2蛋白表达率。A点(y1、y3交叉点)为最大效应-最小毒性剂量，B点(y1、y2交叉点)
图2 ASPO、SPO对HL60细胞作用的
剂量-效应-毒性关系曲线直线化分析
2.大剂量ASPO和SPO对HL60细胞生物特性的影响：对照组和SPO组HL60细胞数随培养时间增加逐渐增多，而ASPO组细胞数渐减少，显著低于对照组和SPO组(P<0.01)(表1)。培养72 h，对照组、SPO组和ASPO组的台盼蓝拒染率分别为89.7%±2.5%、82.7%±3.1%、74.3%±4.2%；CFU-HL60克隆形成抑制率ASPO组为88.1%，SPO组为11.9%。
, 百拇医药
表1 大剂量ASPO、SPO作用不同时间后HL60细胞数变化
(×105/ml，
±s) 组别
24 h
48 h
72 h
对照组
3.37±
0.15
7.37±
0.45
10.05±
, http://www.100md.com
0.70
SPO(160 μmol/L)
2.60±
0.10*
5.13±
0.31*
7.40±
0.46*
ASPO(160 μmol/L)
1.17±
0.15**
, http://www.100md.com
0.80±
0.10**
0.50±
0.10**
注：与对照比较*P<0.05，与SPO组比较**P<0.01
3.对HL60细胞Bcl-2蛋白表达抑制和细胞凋亡的诱导作用：SPO和ASPO(160 μmol/L)对Bcl-2蛋白表达率分别为78%和28%；ASPO、SPO作用后的 CFU-HL60经再培养传代后测 Bcl-2蛋白表达的阳性率分别为99.6%、97.8%。对照组、SPO组、ASPO组的吖啶橙染色凋亡率分别为8.5%、16.0%、42.5%。于培养48 h，提取DNA电泳结果发现，ASPO组有凋亡特征的DNA改变，呈现DNA降解“梯状”条带片段，而 SPO组未见梯形条带。与对照组比较，SPO组见有极轻度的DNA模状降解(图3)。
, 百拇医药
注：M：174 HaeⅢ片段；1.ASPO 160 μmol/L；2.SPO 160 μmol/L；3.对照
图3 HL60细胞在ASPO、SPO作用48 h后DNA片段
琼脂糖凝胶电泳图
讨论
目前，反义技术研究中硫代寡脱氧核苷酸的研究最引人注目，然而对其剂量和毒性关系的研究报道甚少。在剂量与效应、毒性关系问题探讨中,我们以Bcl-2蛋白的下降为特异性效应指标，符合 Bcl-2 ASPO的作用原理，不以Bcl-2 mRNA水平和细胞凋亡率为特异性效应指标，主要考虑：(1)Bcl-2 mRNA量的变化与Bcl-2蛋白表达的变化不甚一致，因从mRNA翻译出蛋白质的过程还经过翻译及翻译后的加工；ASPO作用的水平可以是mRNA至蛋白水平。也可以只是蛋白质水平受影响[1，5]。且蛋白质水平的变化是反义寡核苷酸特异性效应表现的最后一个环节。因此以RT-PCR检测Bcl-2 mRNA量的变化可能会低估其效应。(2)凋亡细胞的出现与Bcl-2蛋白下降的时相不一致，而Bcl-2 ASPO作用下应先有Bcl-2蛋白的下降再有凋亡的产生，否则是非特异性的，况且同一时相可以出现不同阶段凋亡细胞的改变，尤其会受凋亡细胞继发坏死的影响，同样可能低估其效应。
, http://www.100md.com
但Crooke[1]应用其它序列的ASPO对细胞系进行毒性研究时报道ASPO在100 μmol/L以下产生的毒副作用不很显著，此与本研究结果相近。可见Bcl-2 ASPO虽为低毒药物，但随着剂量增加到一定程度，其毒性作用呈现剂量依赖性，然而仍有其较大的应用剂量范围。因此，本研究可能为ASPO的动物药效学，毒理学研究提供具有一定参考价值的应用剂量。但在其应用中尚需考虑：(1) ASPO序列的特异性；(2) 靶细胞，靶器官的不同；(3) 实验动物种类的差异。
基金项目：卫生部科研基金资助(98-2-337)；福建省科委优先发展基金资助(97-Z-47)
参考文献
1，Crooke ST. Antisense research and application (hand-book of experimental pharmacology; V.131). Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Germany, 1998,26-31.
, http://www.100md.com
2，Keith FJ, Bradbury DA, Zhu YM, et al. Inhibition of Bcl-2 with antisense oligonucleotides induces apoptosis and increase the sensitivity of AML blasts to Ara-c. Leukemia, 1995,9:131-138.
3，Hansen BM, Nielsen SE, Berg K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods, 1989,119:203-210.
4，张昭林，席雨人.急性白血病化疗药物体外敏感性MTT法的研究，&127;中华血液学杂志， 1990,11:116-118.
5，林艳娟，吕联煌，胡建达.反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸对HL60细胞Bcl-2表达的抑制作用，中华医学遗传学杂志，1999,16:12-15.
6，林艳娟，吕联煌.Bcl-2反义硫代磷酸寡核苷酸对HL60细胞生长的影响.细胞生物学杂志， 1998,20:177-181.
7，姜泊，张亚历，周殿元，主编.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社， 1996,174-177.
(收稿日期：1999-07-20), 百拇医药
单位：350001 福州，福建医科大学附属协和医院 福建省血液病研究所
关键词：寡核苷酸类；反义；毒性试验；细胞系
中华医学杂志000921 【摘要】 目的 探讨大剂量Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(AS-PS-ODN, ASPO)对HL60细胞系的毒性作用，同时了解毒性与剂量的关系。方法 应用四氮唑蓝比色法、台盼蓝拒染试验，CFU-HL60克隆培养法观察大剂量Bcl-2 ASPO对HL60细胞的毒性作用，同时应用免疫细胞化学染色及流式细胞仪检测 P26 Bcl-2蛋白表达，吖啶橙染色及DNA片段电泳对细胞凋亡的观察。并以其正义PS-ODN(SPO)为反义序列非特异性毒性对照。用SPSS软件包进行剂量-效应曲线直线化回归分析。结果 (1)当ASPO、SPO剂量为20 μmol/L时，即出现对HL60细胞生长的非特异性毒性作用；在160 μmol/L时，其非特异性毒性出现明显增加。对HL60细胞生长的抑制率分别为40%、18%。(2)量效曲线回归分析表明当剂量为262 μmol/L时，ASPO与SPO的毒性作用无差别。(3) 160 μmol/L ASPO、SPO对Bcl-2蛋白表达率分别为28%、78%，将ASPO、SPO作用后的HL60细胞进行克隆传代发现Bcl-2表达阳性率反跳分别达 99.6%、97.8%。结论 Bcl-2 ASPO虽为低毒药物，但仍存在剂量依赖性毒性作用。其对HL60细胞作用的适合剂量以不超过134 μmol/L为宜。
, http://www.100md.com
The toxic effects of high-dose Bcl-2 antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides incubation on cell line
LIN Yanjuan
(Union Hospital Affiliate to Fujian Medical University, Fujian Insititute of Hematology, Fuzhou 350001, China)
L
Lianhuang(Union Hospital Affiliate to Fujian Medical University, Fujian Insititute of Hematology, Fuzhou 350001, China)
, http://www.100md.com
CHEN Zhizhe.
(Union Hospital Affiliate to Fujian Medical University, Fujian Insititute of Hematology, Fuzhou 350001, China)
【Abstract】 Objective To investigate the toxic effects of high-dose Bcl-2 antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides (AS-PS-ODN, ASPO) incubation on HL60 cells and to understand the relationship between the dose of ASPO and the toxicity. Methods Cellular viability and toxicity were detected by trypan blue exclusion, colony-forming unit HL60 cells and MTT assay. The expression of Bcl-2 protein was determined by immunocytochemistry and flow cytometry analysis. The proportion of apoptosis cells was tested by acridine orange (AO) standing. The sense (PS-ODN, SPO) was chosen for the toxic control of independent sequence. The curves of dose-effect and dose-toxicity were transfered into straight line and the reguession analysis was done by computer with the SPSS soften-ware. Results When the dose of Bcl-2 PS-ODN was higher than 20 μmol/L, the non-specific effect of suppressing cell proliferation could occur. When the dose of Bcl-2 PS-ODN was more than 160 μmol/L, the non-specific effect (toxic effect) increased significantly. When the dose of Bcl-2 ASPO was higher than 80 μmol/L, the specific effect of inhibitting the expression of Bcl-2 proteion increased slowly. When the dose of PS-ODN reached 262 μmol/L, the toxic effect had no significant differences between Bcl-2 ASPO and Bcl-2 SPO. In the presence of ASPO or SPO at 160 μmol/L, the expression of Bcl-2 protein in the two groups of HL60 was decreased to 28% and 78% respectively, after 72 hours of incubation. The expression of Bcl-2 protein in the groups of HL60 which were passaged after incubation with ASPO or SPO was reinereased to 99.6% and 97.8%, respectively. Conclusion Although ASPO is a kind of low-toxic drug, the toxic effects of Bcl-2 ASPO seem to be dependent on the dose increasing to a certain extent. It is clear that it can be used over a wide range of doses, however. Our results may also provide some referring concentrations of Bcl-2 ASPO for the pharmacodynamic and toxicological study in vivo in future.
, http://www.100md.com
【Key words】 Oligodeoxynucleotides, antisense； Toxicity, tests； Cell line
国外仅有少数对反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(AS-PS-ODN,ASPO)的毒性进行了研究，发现均可产生不同程度的毒副作用，且相同程度的副作用，所要求的不同反义寡核苷酸的浓度不同[1]。关于Bcl-2 ASPO的药效学作用在国内、外文献中均有较为肯定的报道，然而对其毒性的研究，目前尚少见报道。为此我们应用大剂量ASPO作用于HL60细胞，观察其产生特异性效应的同时产生细胞毒性作用的程度和剂量范围。
材料和方法
1.细胞及培养体系：HL60细胞株(由福建省医学科学研究所提供)。用含体积分数0.1的胎牛血清(美国Gibco-BRL)的RPMI 1640培养液，置37℃、体积分数0.05的CO2、饱和湿度的培养箱中培养，2 d传代1次。实验用的细胞均保持在(0.1～0.5)×106/ml密度，处于对数生长期。
, 百拇医药
2.PS-ODN的合成：反义PS-ODN(ASPO)序列[2]为5′-CAGCGTGCGCCATCCTTCCC-3′为Bcl-2的mRNA开放阅读框架(-7～+13)的 20个碱基，并以20nt正义PS-ODN(SPO)为反义序列非特异性毒性对照，序列为5′-GGGAAGGATGGCGCACGCTG-3′。均由美国ABI公司392型DNA/RNA合成仪合成，合成过程严格按说明书进行，合成物用OPC柱纯化，于紫外分光光度分析仪 (DU 640型，美国BECKMAN公司)定量，分装冻干后保存于-40℃。
3.检测ASPO和SPO对HL60细胞的毒性作用：按文献[3，4]方法略加改良简述如下：HL60细胞的终浓度1×105/ml种于96孔培养板，50 μl/孔，设对照组(细胞+培养液)，反义组加ASPO使终浓度分别为5、20、40、80、160、320 μmol/L；正义组加SPO使终浓度同反义组、零点组(全培养液无细胞)，每个浓度同时设2个平行孔。于37℃、体积分数0.05 CO2的饱和湿度的培养箱中培养72 h后，加入MTT (上海华美公司)(0.01 mol/L、pH 7.4、PBS溶解5 mg/ml)10 μl/孔，零点组不加MTT溶液。培养4 h后，加二甲基亚砜(DMSO)150 μl/孔终止反应，在微量振荡器上振摇使甲颗粒充分溶解，以零点组校正零点，在Bil-TEKEL311型酶标仪上测490 nm波长的吸光度(A)值，取各浓度组平均A值分别计算细胞抑制率(细胞毒性)和细胞存活率。
, 百拇医药
细胞抑制率＝(1-正义组、反义组A值/对照组A值)×100%
细胞存活率＝(正义组、反义组A值/对照组A值)×100%
4.细胞免疫化学法检测Bcl-2蛋白表达：于培养72 h收集各组细胞，细胞免疫化学染色方法及分级标准参照文献[5]介绍的方法。
5.大剂量ASPO和SPO与HL60细胞共培养：HL60细胞终浓度为1×105/ml，培养设对照组、正义组、反义组。ASPO、SPO终浓度均为160 μmol/L，种于96孔培养板(Costar)，每孔50 μl，同时做3孔，培养过程不换液。于培养72 h做以下实验观察：(1)台盼蓝拒染试验及HL60细胞克隆(CFU-HL60)培养方法参见文献[6]方法，将克隆细胞的换液传代后用流式细胞仪检测P26 Bcl-2蛋白表达；(2)流式细胞仪检测 P26 Bcl-2 蛋白表达按文献[5]方法；(3)活细胞悬液吖啶橙染色检测细胞凋亡率。方法及结果判断按文献[7]方法。
, 百拇医药
HL60细胞终浓度为5×105/ml的培养：设对照组、反义组、正义组，ASPO、SPO终浓度均为160 μmol/L，于培养48 h收集细胞做DNA抽提和电泳，观察DNA降解片段[7]。
6.统计学处理：用SPSS软件包进行t检验和量效曲线直线化回归分析。
结果
1.ASPO和SPO对HL60细胞毒性作用及量效分析：HL60细胞分别经不同浓度ASPO，SPO作用后发现随着浓度的增大，对HL60细胞生长的抑制率增大，当ASPO、SPO剂量在20 μmol/L时，出现非特异性毒性作用，对HL60细胞生长的抑制率分别为10%、1%。当160 μmol/L时非特异性毒作用显著增加抑制率分别为40%、18%(图1)。应用SPSS软件系统进行量效曲线直线化回归分析，不同剂量ASPO对HL60细胞作用的存活率，不同剂量SPO对HL60细胞生长的抑制率以及不同剂量ASPO作用后HL60细胞Bcl-2蛋白表达变化曲线，计算出ASPO对HL60细胞作用的最大效应-最小毒性剂量为134 μmol/L(A点)，当剂量大于262 μmol/L(B点)时，ASPO与SPO的毒性作用已无差别(图2)。
, http://www.100md.com
图1 ASPO、SPO对HL60细胞毒抑制率的
剂量-效应曲线
y1:SPO的细胞抑制率，y2:ASPO的细胞存活率，y3:ASPO的Bcl-2蛋白表达率。A点(y1、y3交叉点)为最大效应-最小毒性剂量，B点(y1、y2交叉点)
图2 ASPO、SPO对HL60细胞作用的
剂量-效应-毒性关系曲线直线化分析
2.大剂量ASPO和SPO对HL60细胞生物特性的影响：对照组和SPO组HL60细胞数随培养时间增加逐渐增多，而ASPO组细胞数渐减少，显著低于对照组和SPO组(P<0.01)(表1)。培养72 h，对照组、SPO组和ASPO组的台盼蓝拒染率分别为89.7%±2.5%、82.7%±3.1%、74.3%±4.2%；CFU-HL60克隆形成抑制率ASPO组为88.1%，SPO组为11.9%。
, 百拇医药
表1 大剂量ASPO、SPO作用不同时间后HL60细胞数变化
(×105/ml，
±s) 组别24 h
48 h
72 h
对照组
3.37±
0.15
7.37±
0.45
10.05±
, http://www.100md.com
0.70
SPO(160 μmol/L)
2.60±
0.10*
5.13±
0.31*
7.40±
0.46*
ASPO(160 μmol/L)
1.17±
0.15**
, http://www.100md.com
0.80±
0.10**
0.50±
0.10**
注：与对照比较*P<0.05，与SPO组比较**P<0.01
3.对HL60细胞Bcl-2蛋白表达抑制和细胞凋亡的诱导作用：SPO和ASPO(160 μmol/L)对Bcl-2蛋白表达率分别为78%和28%；ASPO、SPO作用后的 CFU-HL60经再培养传代后测 Bcl-2蛋白表达的阳性率分别为99.6%、97.8%。对照组、SPO组、ASPO组的吖啶橙染色凋亡率分别为8.5%、16.0%、42.5%。于培养48 h，提取DNA电泳结果发现，ASPO组有凋亡特征的DNA改变，呈现DNA降解“梯状”条带片段，而 SPO组未见梯形条带。与对照组比较，SPO组见有极轻度的DNA模状降解(图3)。
, 百拇医药
注：M：174 HaeⅢ片段；1.ASPO 160 μmol/L；2.SPO 160 μmol/L；3.对照
图3 HL60细胞在ASPO、SPO作用48 h后DNA片段
琼脂糖凝胶电泳图
讨论
目前，反义技术研究中硫代寡脱氧核苷酸的研究最引人注目，然而对其剂量和毒性关系的研究报道甚少。在剂量与效应、毒性关系问题探讨中,我们以Bcl-2蛋白的下降为特异性效应指标，符合 Bcl-2 ASPO的作用原理，不以Bcl-2 mRNA水平和细胞凋亡率为特异性效应指标，主要考虑：(1)Bcl-2 mRNA量的变化与Bcl-2蛋白表达的变化不甚一致，因从mRNA翻译出蛋白质的过程还经过翻译及翻译后的加工；ASPO作用的水平可以是mRNA至蛋白水平。也可以只是蛋白质水平受影响[1，5]。且蛋白质水平的变化是反义寡核苷酸特异性效应表现的最后一个环节。因此以RT-PCR检测Bcl-2 mRNA量的变化可能会低估其效应。(2)凋亡细胞的出现与Bcl-2蛋白下降的时相不一致，而Bcl-2 ASPO作用下应先有Bcl-2蛋白的下降再有凋亡的产生，否则是非特异性的，况且同一时相可以出现不同阶段凋亡细胞的改变，尤其会受凋亡细胞继发坏死的影响，同样可能低估其效应。
, http://www.100md.com
但Crooke[1]应用其它序列的ASPO对细胞系进行毒性研究时报道ASPO在100 μmol/L以下产生的毒副作用不很显著，此与本研究结果相近。可见Bcl-2 ASPO虽为低毒药物，但随着剂量增加到一定程度，其毒性作用呈现剂量依赖性，然而仍有其较大的应用剂量范围。因此，本研究可能为ASPO的动物药效学，毒理学研究提供具有一定参考价值的应用剂量。但在其应用中尚需考虑：(1) ASPO序列的特异性；(2) 靶细胞，靶器官的不同；(3) 实验动物种类的差异。
基金项目：卫生部科研基金资助(98-2-337)；福建省科委优先发展基金资助(97-Z-47)
参考文献
1，Crooke ST. Antisense research and application (hand-book of experimental pharmacology; V.131). Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Germany, 1998,26-31.
, http://www.100md.com
2，Keith FJ, Bradbury DA, Zhu YM, et al. Inhibition of Bcl-2 with antisense oligonucleotides induces apoptosis and increase the sensitivity of AML blasts to Ara-c. Leukemia, 1995,9:131-138.
3，Hansen BM, Nielsen SE, Berg K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods, 1989,119:203-210.
4，张昭林，席雨人.急性白血病化疗药物体外敏感性MTT法的研究，&127;中华血液学杂志， 1990,11:116-118.
5，林艳娟，吕联煌，胡建达.反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸对HL60细胞Bcl-2表达的抑制作用，中华医学遗传学杂志，1999,16:12-15.
6，林艳娟，吕联煌.Bcl-2反义硫代磷酸寡核苷酸对HL60细胞生长的影响.细胞生物学杂志， 1998,20:177-181.
7，姜泊，张亚历，周殿元，主编.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社， 1996,174-177.
(收稿日期：1999-07-20), 百拇医药