基因治疗与化疗联合应用对人肺腺癌GLC-82细胞作用的实验研究
作者：徐敏毅 林晨 梁萧 付明 张雪艳 吴旻
单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室
关键词：腺癌；细支气管肺泡；基因疗法；顺铂
中华医学杂志000920 【摘要】 目的 探讨基因治疗和化疗联合应用提高肿瘤疗效的可能性和初步机制。方法 将重组腺病毒载体(Ad)介导的p53基因(Ad-p53)与化疗药顺铂(CDDP)或三氧化二砷(As2O3)联合，通过细胞生长和存活的抑制实验，流式细胞分析，末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记检测，逆转录-聚合酶链反应，免疫组织化学检测，以及裸鼠皮下移植瘤模型的治疗实验，观察其对人肺腺癌GLC-82细胞的作用及可能机制。结果 Ad-p53与CDDP或As2O3联合在体外实验中对人肺腺癌GLC-82细胞生长的抑制效果比单独用“药”的效果强。在体内实验中, Ad-p53与CDDP联合对GLC-82细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制率可达89.0%(单用的抑制率分别为43.9%、57.3%)。Ad-p53及较低剂量化疗药可导致GLC-82细胞凋亡，CDDP与As2O3均可引起GLC-82细胞G2/M期的阻滞，当联合应用时，阻滞作用更明显地受阻于G2/M期。结论 Ad-p53与CDDP或As2O3联合应用，可以提高对人肺腺癌GLC-82细胞的疗效。
, 百拇医药
Experimental study on combination of Ad-p53 with CDDP or As2O3 in human lung adenocarcinoma cell line GLC-82
XU Minyi
(National Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021 China)
LIN Chen
(National Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021 China)
, 百拇医药
LIANG Xiao, et al.
(National Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021 China)
【Abstract】 Objective To evaluate the therapeutic efficiency of combining p53-expressing adenovirus with chemotherapy agents on GLC-82 human lung adenocarcinoma cells. Methods Human lung adenocarcinoma cell line GLC-82 was transfected with adenovirus-mediated p53 gene (Ad-p53) combining with administration of either kind of chemotherapeutic agents-cisplatin (CDDP) and arsenic trioxide (As2O3). The cell growth, morphological changes, cell cycle, apoptosis and molecular changes were measured using cell counting, reversmicroscope, flow cytometry, TUNEL, RT-PC, immunocytochemical assays, and in vivo therapy experiments to evaluate the therapeutic efficiency of such combined regimen. Results Ad-p53 transfer and CDDP (or As2O3) administration to GLC-82 cells could exertubstantially stronger therapeutic effects than the single agent treatment. Especially in in vivo experiments, combined administration of Ad-p53 and CDDP induced almost complete tumor remission (89.0%) compared to the partial tumor remission induced by single agent (43.9% or 57.3%). Moreover, delivery of Ad-p53, or administration of minimal-dose CDDP or As2O3 or combined regimen could induce massive apoptosis of GLC-82 cells. Cell cycle analysis demonstrated that administration of CDDP or As2O3 remarkably arrested GLC-82 cells in G2/M prior to apoptotic cell death. When treated with combined regimen, cells were arrested in G2/M to a greater extent prior to apoptotic cell death. Conclusion After introduced into GLC-82 cells, Ad-p53 shows enhanced therapeutic efficiency for GLC-82 cells when combined with CDDP or As2O3.
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【Key words】 Adenocarcinoma, bronchiolo-alueolar； Gene therapy； Cisplatin
肿瘤基因治疗的优势在于它通过改变肿瘤的分子基础而从根本上抑制肿瘤的发生和发展。截至1998年12月, 在美国进行的261个基因治疗临床实验中, 肿瘤基因治疗占159个[1]。但目前肿瘤基因治疗的疗效并不理想，即使在实验动物中也难以完全抑制肿瘤的生长[2]。基因治疗虽然在疗效上有待提高，但对正常细胞伤害不大，而且有的治疗基因(如p53)的导入可增强肿瘤细胞对一些化疗药物(如顺铂)的敏感性[3，4]。因此，我们尝试通过基因治疗与化学治疗(化疗)的联合来提高疗效，我们采用重组腺病毒载体(Ad)介导的p53基因(Ad-p53)与化疗药物—顺铂(CDDP)或三氧化二砷(As2O3)联合，通过体外、体内动物实验，探讨二者联合应用提高肿瘤基因治疗的疗效的可能性及作用机制。
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材料与方法
一、材料
重组腺病毒Ad-LacZ、Ad-p53为本室构建制备[5]，分别携有细菌LacZ基因，及野生型p53 cDNA (1.8kb)，实验中Ad-LacZ设为非治疗基因对照。 293细胞为腺病毒的E1基因转化的人胚肾细胞系，购自Micro-bix Biosystems 公司。人肺腺癌细胞系GLC-82细胞，本室保存。实验动物为BABL/c裸鼠, 5～6周龄，由本所动物室提供。其他试剂： As2O3(美国Sigma公司)，CDDP(山东齐鲁制药厂)，RNA提取试剂盒(Life Technologies公司)，末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)试剂盒(德国Boehringer Mannheim)，过氧化物酶标记的链霉卵蛋白(Streptavidin /Peroxidase SP)染色试剂盒(北京中山生物技术公司)，PCR引物(上海生工生物工程公司)。
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二、方法
1.Ad繁殖、滴度测定、保存及感染： 按文献[5]介绍的方法进行。
2.CDDP、As2O3的应用：CDDP、As2O3与重组体腺病毒联合作用于GLC-82细胞时，先加Ad-Lacz、Ad-p53感染，37℃的CO2培养箱中培养30～60 min，每隔15 min摇晃1次。之后加入含CDDP或As2O3的M199完全培养基, 使得CDDP、As2O3的终浓度分别为0.5 μg/ml和2 μmol/L，放入37℃培养箱中培养。
3.细胞生长与存活的抑制实验： 接种一定量GLC-82细胞(1.2×105)于30 mm平皿，培养过夜；Ad-p53按一定感染强度(multiplicity of infection，MOI)感染细胞：在同一时间点消化收集各组细胞；2% 台盼蓝染色，显微镜下计数活细胞。每组3个样品，求平均值及标准差，并计算加药组抑制率：(对照组细胞数-加药组细胞数)/ 对照组细胞数×100%。
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4.流式细胞仪分析： 用Ad-p53或药物处理细胞4 d后，收集所有悬浮和贴壁细胞(细胞数>106个)，用70%乙醇4℃固定3 h，加入RNA酶(终浓度为50 μg/ml)，37℃反应1 h，用浓度为100 μg/ml的碘化丙啶PI溶液染色20～30 min后，在流式细胞仪(美国Coulter公司)上进行分析。
5.TUNEL检测： 方法按德国Boehringer Mannheim生产试剂盒的说明进行。
6.RT-PCR分析： 按文献[6]介绍的方法进行。
7.免疫组织化学实验： 方法按SP试剂盒的说明进行。
8.裸鼠皮下移植瘤模型的治疗实验： 将106 GLC-82细胞接种于裸鼠右前肢背侧皮下。待肿瘤长至直径5 mm左右时，随机分组，每组5只。瘤体内注射0.1 ml Ad-LacZ和Ad-p53(3×1010 pfu/ml)；同时腹腔注射0.2 ml As2O3(1 mg/kg)或CDDP(3 mg/kg)或生理盐水。每3 d注射1次，共注射3次。每2 d测量瘤径，按V=ab2/2计算肿瘤体积(a、b均为瘤体直径)。3周后处死裸鼠， 剥离瘤块称重， 计算各治疗组的抑瘤率，并进行t检验。
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结果
一、Ad-p53与化疗药物单用和联合应用时对GLC-82细胞形态学的影响
50 MOIAd-LacZ处理GLC-823细胞后形态无改变(图1a)。0.5 μg/ml CDDP处理GLC-82细胞后，细胞先胀后缩，而后膜破裂呈细胞坏死状；少数细胞出现凋亡小体(图1b)。2 μmol/L As2O3处理GLC-82细胞系后，细胞染色质浓缩、核变小变黑，部分细胞膜破裂而呈细胞坏死状，部分细胞出现凋亡小体(图1c)。50 MOI Ad-p53 处理GLC-82细胞后，细胞变圆，有凋亡小体出现，随后细胞脱落且有大量凋亡小体脱离细胞(图1d)。
联合应用Ad-p53与CDDP或As2O3时，所引起GLC-82细胞的形态学改变与单用Ad-p53的类同(图1e、f)。
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二、Ad-p53与化疗药物联合应用对GLC-82肺腺癌细胞生长的抑制
在生长抑制实验中，50 MOI Ad-p53与2 μmol/L As2O3联合应用后第5天， 对GLC-82细胞生长的抑制率为69.0 %(P<0.001)，明显强于单用Ad-p53或As2O3的抑制效果(抑制率分别为47.5%、48.3%，P<0.01)。50 MOI Ad-p53与0.5 μg/ml CDDP联合使用后第4天， 对GLC-82细胞生长的抑制率为81.0%(P<0.003)，明显强于单用Ad-p53或CDDP的抑制效果(抑制率分别为43.6%、66.2%，P<0.001)。
三、流式细胞仪分析
流式细胞仪的检测结果表明As2O3或CDDP均能造成GLC-82细胞不同程度的G2/M期阻滞，而与Ad-p53联合使用时，对GLC-82细胞的G2/M期阻滞更为明显(表1)。联合应用对细胞周期的影响更接近与单用As2O3或CDDP对细胞周期的影响。
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四、TUNEL实验检测细胞的凋亡情况
TUNEL实验表明，被Ad-LacZ(50MOI)感染的GLC-82细胞基本上没有发生凋亡。而被Ad-p53(50 MOI)感染，经2 μmol/L As2O3或Ad-p53+CDDP处理，以及经Ad-p53+As2O3或Ad-p53+CDDP处理的GLC-82细胞均有细胞凋亡的棕红色染色，而且经过上述联合作用后，细胞凋亡更为明显。
a. Ad-LacZ； b. CDDP； c. As2O3； d. Ad-p53； e. Ad-p53+CDDP； f. Ad-p53+As2O3
, http://www.100md.com 图1 Ad(50MOI)，CDDP(0.5 μg/ml)和As2O3(2 μmol/L)处理GLC-82细胞4 d后倒置显微镜下细胞凋亡形态改变 ×100
表1 Ad-p53(50MOI)与CDDP(0.5 μg/ml)或
As2O3(2 μmol/L)单用或合用对GLC-82细胞细胞周期的影响 组 别
细胞周期各时相百分比(%)
G1
S
G2/M
Ad-LacZ
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39.4
37.4
23.2
Ad-p53
28.3
46.9
24.8
Ad-LacZ+CDDP
5.0
32.8
62.2
Ad-p53+CDDP
1.1
, http://www.100md.com
28.0
70.9
Ad-LacZ
60.3
27.9
11.7
Ad-p53
57.4
27.5
15.0
Ad-LacZ+As2O3
43.6
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16.8
39.6
Ad-p53+As2O3
25.5
30.0
44.5
五、Ad介导的p53基因在GLC-82细胞中的表达
50MOI Ad-p53处理GLC-82后第2、4天分别提取各组细胞的总RNA，进行RT-PCR。结果显示(图2)，Ad介导的p53基因进入GLC-82细胞并有转录水平的表达，感染后第4天p53基因转录水平的表达大于第2天的表达。显示p53基因进入GLC-82细胞后，其表达具有时间依赖性。此外，GLC-82细胞内可能有一定量内源性的p53的表达。
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图2 RT-PCR分析GLC-82细胞中p53基因表达
RT-PCR分析各单用或合用组在加“药”第4天时细胞p53基因转录水平的表达结果显示，Ad-p53不论是单独应用还是与其他药合用，Ad介导的p53基因均进入GLC-82细胞并有转录水平的表达(图3，4)。
M：φχ174DNA/Hae Ⅲ；1.对照；2.Ad-p53；3.As2O3+Ad-p53；4.As2O3
图3 RT-PCR分析Ad-p53和As2O2对GLC-82细胞中
p53基因表达
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1.对照；2.CDDP；3.Ad-p53；4.CDDP+Ad-p53；M：φχ174DNA/Hae Ⅲ
图4 RT-PCR分析Ad-p53和CDDP对GLC-82细胞中
p53基因表达
采用免疫组织化学检测P53蛋白的水平，对照组的细胞不显色，而凡是感染了Ad-p53的细胞，其免疫组化细胞显示棕色，表明Ad所携的p53基因进入GLC-82细胞并表达。
六、Ad-p53与As2O3或CDDP联合应用的体内实验
肿瘤生长曲线见图5、6。接种移植瘤3周后处理裸鼠剥离瘤块后称重，计算抑瘤率(表2)。从图表看，联合用“药”的抑瘤效应明显大于对应的单种“药”的抑瘤效应，统计学有显著意义。尤其是CDDP与Ad-p53的联合基本上抑制了移植瘤的生长。
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图5 Ad-p53，CDDP或Ad-p53+CDDP对GLC-82移植瘤的
体内治疗的生长曲线
图6 Ad-p53，As2O3或Ad-p53+As2O3对
GLC-82移植瘤的体内治疗生长曲线
表2 Ad-p53、As2O3、CDDP、Ad-p53+As2O3或
Ad-p53+CDDP在体内移植瘤生长的抑制(
±s) 组别
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鼠数
瘤重(g)
抑制率(%)
(1)Ad-LacZ
5
1.86±0.30
0
(2)Ad-p53
5
1.04±0.21△
44.0
(3)Ad-LacZ+As2O3
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5
1.46±0.13*
21.5
(4)Ad-LacZ+CDDP
5
0.79±0.42△
57.6
(5)Ad-p53+As2O3
5
0.69±0.24△#▲
63.0
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(6)Ad-p53+CDDP
5
0.21±0.11△##▲▲
89.0
注：与(1)组比较*P<0.05，与(1)组比较，△P<0.01；与(2)组比较，#P<0.05；与(2)组比，##P<0.01；与(5)组比较，▲P<0.01；与(6)组比较▲▲P<0.05讨论
p53基因是非常重要的抑癌基因。已发现p53基因在50%～60%的人体恶性肿瘤中发生突变[7]。P53蛋白控制着与细胞周期相关的基因的表达[8]，在DNA修复和细胞凋亡过程中起着非常重要的作用[4]。已有实验表明，即使肿瘤细胞内有内源性正常的p53基因表达，在导入外源p53基因后仍然可产生抑瘤效应[9]。CDDP可与DNA共价作用产生链内或链间的相互交联，造成细胞周期在G2/M期的阻滞[10]以及肿瘤细胞的凋亡。近年来发现，As2O3对急性早幼粒白血病(APL)具有非常显著的疗效，并且对耐受全反式维甲酸或常规化疗药物的病人依然有效[11]。As2O3对多种人实体肿瘤细胞具有抑瘤效应，且机制可能有所不同[11-15]。本结果表明，Ad-p53、CDDP和As2O3均能引起GLC-82肺腺癌细胞凋亡，抑制其生长和存活。CDDP和As2O3还能将细胞周期阻滞于G2/M期。
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在本组的体内、外实验中，腺病毒介导的p53基因与CDDP或As2O3联合应用后，可显著增强对人肺腺癌GLC-82细胞生长存活的抑制效应，更有效地促进GLC-82细胞凋亡。表明通过与CDDP或As2O3联用，可提高腺病毒介导的p53基因对GLC-82细胞的治疗效果。联合应用Ad-p53与CDDP或As2O3时，GLC-82肺腺癌细胞被阻滞于G2/M期， 此时的阻滞行为更接近于单用As2O3或CDDP的效果，提示此时化疗药是决定这种联合对GLC-82细胞的细胞周期影响的主要因素。而形态学实验则提示，在上述剂量条件下，治疗基因是决定这种联合对GLC-82细胞的形态变化影响的主要因素，使得这种联合导致GLC-82细胞呈现出典型的、单用治疗基因所致的凋亡形态学特征。因此我们认为，在上述剂量条件下，这种联合的双方可能分别在阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡上起不同作用。可能CDDP或As2O3将GLC-82肺腺癌细胞的细胞周期阻滞之后，促进了P53蛋白所推动的肿瘤细胞的凋亡，从而实现治疗基因和化疗药在疗效上的互为促进，达到提高疗效的目的。
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上述联合方案表明，Ad-p53与小剂量化疗药物合用可以提高疗效，可以降低化疗药物使用量，有助于克服单用化疗药所引起的副作用大的缺点。非常值得进行深入试验和推广应用。
基金项目：国家863计划项目资助(Z20-01-02)
参考文献
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(收稿日期：1999-08-13), 百拇医药
单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室
关键词：腺癌；细支气管肺泡；基因疗法；顺铂
中华医学杂志000920 【摘要】 目的 探讨基因治疗和化疗联合应用提高肿瘤疗效的可能性和初步机制。方法 将重组腺病毒载体(Ad)介导的p53基因(Ad-p53)与化疗药顺铂(CDDP)或三氧化二砷(As2O3)联合，通过细胞生长和存活的抑制实验，流式细胞分析，末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记检测，逆转录-聚合酶链反应，免疫组织化学检测，以及裸鼠皮下移植瘤模型的治疗实验，观察其对人肺腺癌GLC-82细胞的作用及可能机制。结果 Ad-p53与CDDP或As2O3联合在体外实验中对人肺腺癌GLC-82细胞生长的抑制效果比单独用“药”的效果强。在体内实验中, Ad-p53与CDDP联合对GLC-82细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制率可达89.0%(单用的抑制率分别为43.9%、57.3%)。Ad-p53及较低剂量化疗药可导致GLC-82细胞凋亡，CDDP与As2O3均可引起GLC-82细胞G2/M期的阻滞，当联合应用时，阻滞作用更明显地受阻于G2/M期。结论 Ad-p53与CDDP或As2O3联合应用，可以提高对人肺腺癌GLC-82细胞的疗效。
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Experimental study on combination of Ad-p53 with CDDP or As2O3 in human lung adenocarcinoma cell line GLC-82
XU Minyi
(National Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021 China)
LIN Chen
(National Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021 China)
, 百拇医药
LIANG Xiao, et al.
(National Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021 China)
【Abstract】 Objective To evaluate the therapeutic efficiency of combining p53-expressing adenovirus with chemotherapy agents on GLC-82 human lung adenocarcinoma cells. Methods Human lung adenocarcinoma cell line GLC-82 was transfected with adenovirus-mediated p53 gene (Ad-p53) combining with administration of either kind of chemotherapeutic agents-cisplatin (CDDP) and arsenic trioxide (As2O3). The cell growth, morphological changes, cell cycle, apoptosis and molecular changes were measured using cell counting, reversmicroscope, flow cytometry, TUNEL, RT-PC, immunocytochemical assays, and in vivo therapy experiments to evaluate the therapeutic efficiency of such combined regimen. Results Ad-p53 transfer and CDDP (or As2O3) administration to GLC-82 cells could exertubstantially stronger therapeutic effects than the single agent treatment. Especially in in vivo experiments, combined administration of Ad-p53 and CDDP induced almost complete tumor remission (89.0%) compared to the partial tumor remission induced by single agent (43.9% or 57.3%). Moreover, delivery of Ad-p53, or administration of minimal-dose CDDP or As2O3 or combined regimen could induce massive apoptosis of GLC-82 cells. Cell cycle analysis demonstrated that administration of CDDP or As2O3 remarkably arrested GLC-82 cells in G2/M prior to apoptotic cell death. When treated with combined regimen, cells were arrested in G2/M to a greater extent prior to apoptotic cell death. Conclusion After introduced into GLC-82 cells, Ad-p53 shows enhanced therapeutic efficiency for GLC-82 cells when combined with CDDP or As2O3.
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【Key words】 Adenocarcinoma, bronchiolo-alueolar； Gene therapy； Cisplatin
肿瘤基因治疗的优势在于它通过改变肿瘤的分子基础而从根本上抑制肿瘤的发生和发展。截至1998年12月, 在美国进行的261个基因治疗临床实验中, 肿瘤基因治疗占159个[1]。但目前肿瘤基因治疗的疗效并不理想，即使在实验动物中也难以完全抑制肿瘤的生长[2]。基因治疗虽然在疗效上有待提高，但对正常细胞伤害不大，而且有的治疗基因(如p53)的导入可增强肿瘤细胞对一些化疗药物(如顺铂)的敏感性[3，4]。因此，我们尝试通过基因治疗与化学治疗(化疗)的联合来提高疗效，我们采用重组腺病毒载体(Ad)介导的p53基因(Ad-p53)与化疗药物—顺铂(CDDP)或三氧化二砷(As2O3)联合，通过体外、体内动物实验，探讨二者联合应用提高肿瘤基因治疗的疗效的可能性及作用机制。
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材料与方法
一、材料
重组腺病毒Ad-LacZ、Ad-p53为本室构建制备[5]，分别携有细菌LacZ基因，及野生型p53 cDNA (1.8kb)，实验中Ad-LacZ设为非治疗基因对照。 293细胞为腺病毒的E1基因转化的人胚肾细胞系，购自Micro-bix Biosystems 公司。人肺腺癌细胞系GLC-82细胞，本室保存。实验动物为BABL/c裸鼠, 5～6周龄，由本所动物室提供。其他试剂： As2O3(美国Sigma公司)，CDDP(山东齐鲁制药厂)，RNA提取试剂盒(Life Technologies公司)，末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)试剂盒(德国Boehringer Mannheim)，过氧化物酶标记的链霉卵蛋白(Streptavidin /Peroxidase SP)染色试剂盒(北京中山生物技术公司)，PCR引物(上海生工生物工程公司)。
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二、方法
1.Ad繁殖、滴度测定、保存及感染： 按文献[5]介绍的方法进行。
2.CDDP、As2O3的应用：CDDP、As2O3与重组体腺病毒联合作用于GLC-82细胞时，先加Ad-Lacz、Ad-p53感染，37℃的CO2培养箱中培养30～60 min，每隔15 min摇晃1次。之后加入含CDDP或As2O3的M199完全培养基, 使得CDDP、As2O3的终浓度分别为0.5 μg/ml和2 μmol/L，放入37℃培养箱中培养。
3.细胞生长与存活的抑制实验： 接种一定量GLC-82细胞(1.2×105)于30 mm平皿，培养过夜；Ad-p53按一定感染强度(multiplicity of infection，MOI)感染细胞：在同一时间点消化收集各组细胞；2% 台盼蓝染色，显微镜下计数活细胞。每组3个样品，求平均值及标准差，并计算加药组抑制率：(对照组细胞数-加药组细胞数)/ 对照组细胞数×100%。
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4.流式细胞仪分析： 用Ad-p53或药物处理细胞4 d后，收集所有悬浮和贴壁细胞(细胞数>106个)，用70%乙醇4℃固定3 h，加入RNA酶(终浓度为50 μg/ml)，37℃反应1 h，用浓度为100 μg/ml的碘化丙啶PI溶液染色20～30 min后，在流式细胞仪(美国Coulter公司)上进行分析。
5.TUNEL检测： 方法按德国Boehringer Mannheim生产试剂盒的说明进行。
6.RT-PCR分析： 按文献[6]介绍的方法进行。
7.免疫组织化学实验： 方法按SP试剂盒的说明进行。
8.裸鼠皮下移植瘤模型的治疗实验： 将106 GLC-82细胞接种于裸鼠右前肢背侧皮下。待肿瘤长至直径5 mm左右时，随机分组，每组5只。瘤体内注射0.1 ml Ad-LacZ和Ad-p53(3×1010 pfu/ml)；同时腹腔注射0.2 ml As2O3(1 mg/kg)或CDDP(3 mg/kg)或生理盐水。每3 d注射1次，共注射3次。每2 d测量瘤径，按V=ab2/2计算肿瘤体积(a、b均为瘤体直径)。3周后处死裸鼠， 剥离瘤块称重， 计算各治疗组的抑瘤率，并进行t检验。
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结果
一、Ad-p53与化疗药物单用和联合应用时对GLC-82细胞形态学的影响
50 MOIAd-LacZ处理GLC-823细胞后形态无改变(图1a)。0.5 μg/ml CDDP处理GLC-82细胞后，细胞先胀后缩，而后膜破裂呈细胞坏死状；少数细胞出现凋亡小体(图1b)。2 μmol/L As2O3处理GLC-82细胞系后，细胞染色质浓缩、核变小变黑，部分细胞膜破裂而呈细胞坏死状，部分细胞出现凋亡小体(图1c)。50 MOI Ad-p53 处理GLC-82细胞后，细胞变圆，有凋亡小体出现，随后细胞脱落且有大量凋亡小体脱离细胞(图1d)。
联合应用Ad-p53与CDDP或As2O3时，所引起GLC-82细胞的形态学改变与单用Ad-p53的类同(图1e、f)。
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二、Ad-p53与化疗药物联合应用对GLC-82肺腺癌细胞生长的抑制
在生长抑制实验中，50 MOI Ad-p53与2 μmol/L As2O3联合应用后第5天， 对GLC-82细胞生长的抑制率为69.0 %(P<0.001)，明显强于单用Ad-p53或As2O3的抑制效果(抑制率分别为47.5%、48.3%，P<0.01)。50 MOI Ad-p53与0.5 μg/ml CDDP联合使用后第4天， 对GLC-82细胞生长的抑制率为81.0%(P<0.003)，明显强于单用Ad-p53或CDDP的抑制效果(抑制率分别为43.6%、66.2%，P<0.001)。
三、流式细胞仪分析
流式细胞仪的检测结果表明As2O3或CDDP均能造成GLC-82细胞不同程度的G2/M期阻滞，而与Ad-p53联合使用时，对GLC-82细胞的G2/M期阻滞更为明显(表1)。联合应用对细胞周期的影响更接近与单用As2O3或CDDP对细胞周期的影响。
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四、TUNEL实验检测细胞的凋亡情况
TUNEL实验表明，被Ad-LacZ(50MOI)感染的GLC-82细胞基本上没有发生凋亡。而被Ad-p53(50 MOI)感染，经2 μmol/L As2O3或Ad-p53+CDDP处理，以及经Ad-p53+As2O3或Ad-p53+CDDP处理的GLC-82细胞均有细胞凋亡的棕红色染色，而且经过上述联合作用后，细胞凋亡更为明显。
a. Ad-LacZ； b. CDDP； c. As2O3； d. Ad-p53； e. Ad-p53+CDDP； f. Ad-p53+As2O3
, http://www.100md.com 图1 Ad(50MOI)，CDDP(0.5 μg/ml)和As2O3(2 μmol/L)处理GLC-82细胞4 d后倒置显微镜下细胞凋亡形态改变 ×100
表1 Ad-p53(50MOI)与CDDP(0.5 μg/ml)或
As2O3(2 μmol/L)单用或合用对GLC-82细胞细胞周期的影响 组 别
细胞周期各时相百分比(%)
G1
S
G2/M
Ad-LacZ
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39.4
37.4
23.2
Ad-p53
28.3
46.9
24.8
Ad-LacZ+CDDP
5.0
32.8
62.2
Ad-p53+CDDP
1.1
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28.0
70.9
Ad-LacZ
60.3
27.9
11.7
Ad-p53
57.4
27.5
15.0
Ad-LacZ+As2O3
43.6
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16.8
39.6
Ad-p53+As2O3
25.5
30.0
44.5
五、Ad介导的p53基因在GLC-82细胞中的表达
50MOI Ad-p53处理GLC-82后第2、4天分别提取各组细胞的总RNA，进行RT-PCR。结果显示(图2)，Ad介导的p53基因进入GLC-82细胞并有转录水平的表达，感染后第4天p53基因转录水平的表达大于第2天的表达。显示p53基因进入GLC-82细胞后，其表达具有时间依赖性。此外，GLC-82细胞内可能有一定量内源性的p53的表达。
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图2 RT-PCR分析GLC-82细胞中p53基因表达
RT-PCR分析各单用或合用组在加“药”第4天时细胞p53基因转录水平的表达结果显示，Ad-p53不论是单独应用还是与其他药合用，Ad介导的p53基因均进入GLC-82细胞并有转录水平的表达(图3，4)。
M：φχ174DNA/Hae Ⅲ；1.对照；2.Ad-p53；3.As2O3+Ad-p53；4.As2O3
图3 RT-PCR分析Ad-p53和As2O2对GLC-82细胞中
p53基因表达
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1.对照；2.CDDP；3.Ad-p53；4.CDDP+Ad-p53；M：φχ174DNA/Hae Ⅲ
图4 RT-PCR分析Ad-p53和CDDP对GLC-82细胞中
p53基因表达
采用免疫组织化学检测P53蛋白的水平，对照组的细胞不显色，而凡是感染了Ad-p53的细胞，其免疫组化细胞显示棕色，表明Ad所携的p53基因进入GLC-82细胞并表达。
六、Ad-p53与As2O3或CDDP联合应用的体内实验
肿瘤生长曲线见图5、6。接种移植瘤3周后处理裸鼠剥离瘤块后称重，计算抑瘤率(表2)。从图表看，联合用“药”的抑瘤效应明显大于对应的单种“药”的抑瘤效应，统计学有显著意义。尤其是CDDP与Ad-p53的联合基本上抑制了移植瘤的生长。
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图5 Ad-p53，CDDP或Ad-p53+CDDP对GLC-82移植瘤的
体内治疗的生长曲线
图6 Ad-p53，As2O3或Ad-p53+As2O3对
GLC-82移植瘤的体内治疗生长曲线
表2 Ad-p53、As2O3、CDDP、Ad-p53+As2O3或
Ad-p53+CDDP在体内移植瘤生长的抑制(
±s) 组别, http://www.100md.com
鼠数
瘤重(g)
抑制率(%)
(1)Ad-LacZ
5
1.86±0.30
0
(2)Ad-p53
5
1.04±0.21△
44.0
(3)Ad-LacZ+As2O3
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5
1.46±0.13*
21.5
(4)Ad-LacZ+CDDP
5
0.79±0.42△
57.6
(5)Ad-p53+As2O3
5
0.69±0.24△#▲
63.0
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(6)Ad-p53+CDDP
5
0.21±0.11△##▲▲
89.0
注：与(1)组比较*P<0.05，与(1)组比较，△P<0.01；与(2)组比较，#P<0.05；与(2)组比，##P<0.01；与(5)组比较，▲P<0.01；与(6)组比较▲▲P<0.05讨论
p53基因是非常重要的抑癌基因。已发现p53基因在50%～60%的人体恶性肿瘤中发生突变[7]。P53蛋白控制着与细胞周期相关的基因的表达[8]，在DNA修复和细胞凋亡过程中起着非常重要的作用[4]。已有实验表明，即使肿瘤细胞内有内源性正常的p53基因表达，在导入外源p53基因后仍然可产生抑瘤效应[9]。CDDP可与DNA共价作用产生链内或链间的相互交联，造成细胞周期在G2/M期的阻滞[10]以及肿瘤细胞的凋亡。近年来发现，As2O3对急性早幼粒白血病(APL)具有非常显著的疗效，并且对耐受全反式维甲酸或常规化疗药物的病人依然有效[11]。As2O3对多种人实体肿瘤细胞具有抑瘤效应，且机制可能有所不同[11-15]。本结果表明，Ad-p53、CDDP和As2O3均能引起GLC-82肺腺癌细胞凋亡，抑制其生长和存活。CDDP和As2O3还能将细胞周期阻滞于G2/M期。
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在本组的体内、外实验中，腺病毒介导的p53基因与CDDP或As2O3联合应用后，可显著增强对人肺腺癌GLC-82细胞生长存活的抑制效应，更有效地促进GLC-82细胞凋亡。表明通过与CDDP或As2O3联用，可提高腺病毒介导的p53基因对GLC-82细胞的治疗效果。联合应用Ad-p53与CDDP或As2O3时，GLC-82肺腺癌细胞被阻滞于G2/M期， 此时的阻滞行为更接近于单用As2O3或CDDP的效果，提示此时化疗药是决定这种联合对GLC-82细胞的细胞周期影响的主要因素。而形态学实验则提示，在上述剂量条件下，治疗基因是决定这种联合对GLC-82细胞的形态变化影响的主要因素，使得这种联合导致GLC-82细胞呈现出典型的、单用治疗基因所致的凋亡形态学特征。因此我们认为，在上述剂量条件下，这种联合的双方可能分别在阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡上起不同作用。可能CDDP或As2O3将GLC-82肺腺癌细胞的细胞周期阻滞之后，促进了P53蛋白所推动的肿瘤细胞的凋亡，从而实现治疗基因和化疗药在疗效上的互为促进，达到提高疗效的目的。
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上述联合方案表明，Ad-p53与小剂量化疗药物合用可以提高疗效，可以降低化疗药物使用量，有助于克服单用化疗药所引起的副作用大的缺点。非常值得进行深入试验和推广应用。
基金项目：国家863计划项目资助(Z20-01-02)
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(收稿日期：1999-08-13), 百拇医药