hVEGF165基因转移对血管内皮细胞增殖及分泌功能的实验研究
作者：刘启功 颜进 张卫东 陆再英
单位：刘启功(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院心内科)陆再英(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院心内科)颜进(同济医科大学医学病毒室)；张卫东(同济医科大学医学病毒室)
关键词：
中华血液学杂志000914 血管内皮细胞(VEC)损伤是再狭窄的始动因素已为大多数学者所公认,因此,促进经皮腔内冠脉成形术(PTCA)后VEC的迅速修复并发挥其正常功能是预防再狭窄的关键。实验证明,血管内皮生长因子(VEGF)能预防实验性血管成形术后再狭窄[1,2],但对其机制知之不多。我们观察VEGF对兔主动脉VEC增殖及分泌前列环素(PGI2)和血栓素A2(TXA2)的影响,为VEGF用于预防PTCA后再狭窄提供实验依据。
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材料和方法
1 含hVEGF165 cDNA的质粒pSVI21 由美国Boston大学惠赠, 腺病毒载体pACCMV.pLpA和pJM17由美国Vanderbilt大学惠赠。pJM17质粒为E1区缺失的5 型腺病毒基因组DNA;pACCMV.pLpA含有CMV启动子和猿猴病毒40的PolyA尾, 中间插入pUC19的多克隆位点,两侧为5型腺病毒部分基因组DNA,与pJM17的部分DNA 序列完全相同。
2 主要试剂 EcoRⅠ、NcoⅠ、HindⅢ、Taq DNA聚合酶、小牛肠碱性磷酸酶(CIP)、T4 DNA连接酶、AMV逆转录酶、λDNA/HindⅢ和蛋白质Marker为Promega公司产品,L-B 培养基、胎牛血清、RPMI 1640和DMEM(高糖,4.5g/L)为Sigma公司产品,兔抗人VEGF多抗、 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为Santa Cruz公司产品,TRIzol试剂为Gibco公司产品,WST-1购自BM公司。
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3 含hVEGF165基因的重组腺病毒载体的构建 pSVI21经EcoRⅠ酶切后采用低熔点凝胶法回收VEGF cDNA片段。pACCMV.pLpA用EcoRⅠ酶切后再以CIP去磷酸化,与目的基因片段连接,经EcoRⅠ和NcoⅠ酶切筛选出正确克隆pACCMV.hVEGF。pJM17经HindⅢ酶切后按碱裂解法[3]大量提取pJM17和pACCMV*hVEGF,再用磷酸钙介导转染法[4]共转染人胚肾293细胞(ATCC),经同源重组形成含hVEGF165基因的缺失E1 区的复制缺陷型重组腺病毒,聚合酶链反应(PCR)鉴定后大量扩增并测定其滴度为2×109pfu/ml,备用。
4 兔主动脉VEC的培养和鉴定 采用胰酶消化法[5]。相差显微镜下细胞呈单层鹅卵石样排列,免疫荧光检查因子Ⅷ阳性。第3～5代细胞用于实验。
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5 目的基因的体外表达 待VEC长成约60%～80%融合时,分为3组:1组为对照组,2和3组分别用每个细胞5pfu和20pfu两个浓度的重组腺病毒感染,48h后吸出上清(分别为CM1、CM2和CM3)进行Western blot,用TRIzol试剂提取细胞RNA，进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)。
5.1 RT-PCR:20μl逆转录反应体系含5×AMV缓冲液4μl,AMV逆转录酶20U, 随机引物20pmol,dNTP 0.25mmol/L,余用样品RNA补足,42℃水浴60min, 95℃灭活逆转录酶10min。然后取上述逆转录产物5μl进行PCR,并以pACCMV*hVEGF为阳性对照。VEGF正、反义引物序列分别为5′-TTGCTGCTCTACCTCCAC-3′和5′-AATGCTTTCTCCGCTCTG-3′。25μl反应体系中含有正、反义引物各28pmol,dNTP 0.2mmol/L,Mg2+ 1.5mmol/L,Taq DNA聚合酶1U。PCR反应条件:94℃ 1min,55℃ 1min,72℃ 75s,共30个循环,最后72℃延伸7min。
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5.2 Western blot:样品先后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质转移、 膜封闭和抗原抗体反应。一抗为兔抗人VEGF多抗,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,显色底物为DAB-H2O2。蛋白质Marker电转移后直接用1g/L的氨基黑染色[3]。
6 VEGF对VEC分泌功能的影响 将对数生长期的VEC接种于24孔板,分成3组,每组16孔。待细胞长成单层后更换新鲜的培养液,每孔1ml,并分别给3组加入等量的CM1、CM2和CM3,继续培养6h,收集上清,采用放射免疫法测6-keto-PGF1a(北京东亚免疫技术研究所产品)。
7 VEGF对VEC增殖的影响 将对数生长期的VEC制成悬液,接种于96孔板,分3组, 每组8孔,每孔4×103个细胞,3组分别加入CM1、CM2和CM3,总体积为每孔100μl,培养48h后,每孔加入WST-1 10μl,继续培养4h,振荡混匀后酶标仪(波长为450nm)测吸光度。
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8 统计学分析 数据以
±s表示,组间比较采用t检验。
结果
1 RT-PCR结果 PCR产物应为418bp。 PCR产物电泳后阳性对照和感染组在相当于418bp处可见一清晰条带,每细胞20pfu感染组较每细胞5pfu感染组明显,而对照组未见条带。说明重组腺病毒感染VEC 48h后有VEGF mRNA的转录,并呈剂量依赖性(见图1)。
1：每细胞20pfu感染组；2：每细胞5pfu感染组；
3：阳性对照组；4：λDNA/HindⅢ；5：对照组
图1 RT-PCR结果
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2 Western blot hVEGF165相对分子质量约为5.5～6.0万。感染组在相应位置可见一蛋白质条带,高浓度组较低浓度组明显,而对照组未见条带。说明重组腺病毒感染VEC 48h后有VEGF抗原表达,并呈剂量相关性。
3 VEC培养液中TXB2、6-keto-PGF1a的含量 CM3组 6-keto-PGF1a[(251.01±23.76)pg/ml]较CM2组[(232.25±24.47)pg/ml]、CM2组较CM1组[(212.41±26.32)pg/ml]明显增加(P<0.05和P<0.01),而三组TXB2差异无显著性。
4 VEGF对VEC增殖的影响 CM3组(0.63±0.03)高于CM2组(0.59±0.02),二者又均高于CM1组(0.54±0.02)(P<0.01)。说明VEGF能呈剂量依赖性地促进VEC增殖。
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讨论
PTCA已成为治疗冠心病的重要手段之一,然而约有30%～50%的手术成功者于术后3～6个月内出现冠脉再狭窄,且目前尚无解决办法,严重限制了PTCA的应用和远期疗效。研究认为,再狭窄是动脉损伤后的愈合反应,是一个复杂的生物学过程,其中VEC损伤是再狭窄的始动因素。因此,促进PTCA后损伤内皮的迅速修复并恢复其功能可能是防止再狭窄的关键。
VEGF是近几年来发现的一种糖蛋白,能高效特异促进VEC分裂和增殖, 有利于损伤血管内皮的修复,有可能在预防再狭窄中发挥重要作用。实验证实，VEGF能促进实验性动脉成形术及支架植入后内皮细胞修复,使血栓形成减少、内膜增生及管腔狭窄程度减轻[1,2],其作用机制除已知与加速内皮修复有关外,其作用机制还很不明确。
本研究提示,VEGF不仅能促进VEC增殖,还能促进VEC合成、分泌PGI2,使PGI2/TXA2明显增加,从而抑制血管弹性回缩、血小板沉积、血栓形成、血管平滑肌细胞过度增殖和移行,不利于再狭窄的形成。
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参 考 文 献
1，Asahara T, Chen DH, Tsurumi Y, et al. Accelerated restitution of endothelial integrity and endothelium-dependent function after phVEGF165 gene transfer.Circulation,1996,94:3291-3302.
2，van Belle E,Tio FO,Chen D,et al.Passivation of metallic stents after arterial gene transfer of phVEGF165 inhibits thrombus formation and intimal thickening.J Am Coll Cardiol,1997,29:1371-1379.
, 百拇医药
3，Sambrook J,Fritsch EF， Maniatis T.Molecular Cloning.2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.
4，Wilson L， Becker TC.Methods in Cell Biology. Vol 43. New York:Academic Press,1994. 174-185.
5，卢耀增,余铭鹏,夏人仪，等.家兔主动脉内皮细胞的培养及形态学观察.中华病理学杂志,1982,11:176-179.
(收稿日期：1999-03-29), 百拇医药
单位：刘启功(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院心内科)陆再英(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院心内科)颜进(同济医科大学医学病毒室)；张卫东(同济医科大学医学病毒室)
关键词：
中华血液学杂志000914 血管内皮细胞(VEC)损伤是再狭窄的始动因素已为大多数学者所公认,因此,促进经皮腔内冠脉成形术(PTCA)后VEC的迅速修复并发挥其正常功能是预防再狭窄的关键。实验证明,血管内皮生长因子(VEGF)能预防实验性血管成形术后再狭窄[1,2],但对其机制知之不多。我们观察VEGF对兔主动脉VEC增殖及分泌前列环素(PGI2)和血栓素A2(TXA2)的影响,为VEGF用于预防PTCA后再狭窄提供实验依据。
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材料和方法
1 含hVEGF165 cDNA的质粒pSVI21 由美国Boston大学惠赠, 腺病毒载体pACCMV.pLpA和pJM17由美国Vanderbilt大学惠赠。pJM17质粒为E1区缺失的5 型腺病毒基因组DNA;pACCMV.pLpA含有CMV启动子和猿猴病毒40的PolyA尾, 中间插入pUC19的多克隆位点,两侧为5型腺病毒部分基因组DNA,与pJM17的部分DNA 序列完全相同。
2 主要试剂 EcoRⅠ、NcoⅠ、HindⅢ、Taq DNA聚合酶、小牛肠碱性磷酸酶(CIP)、T4 DNA连接酶、AMV逆转录酶、λDNA/HindⅢ和蛋白质Marker为Promega公司产品,L-B 培养基、胎牛血清、RPMI 1640和DMEM(高糖,4.5g/L)为Sigma公司产品,兔抗人VEGF多抗、 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为Santa Cruz公司产品,TRIzol试剂为Gibco公司产品,WST-1购自BM公司。
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3 含hVEGF165基因的重组腺病毒载体的构建 pSVI21经EcoRⅠ酶切后采用低熔点凝胶法回收VEGF cDNA片段。pACCMV.pLpA用EcoRⅠ酶切后再以CIP去磷酸化,与目的基因片段连接,经EcoRⅠ和NcoⅠ酶切筛选出正确克隆pACCMV.hVEGF。pJM17经HindⅢ酶切后按碱裂解法[3]大量提取pJM17和pACCMV*hVEGF,再用磷酸钙介导转染法[4]共转染人胚肾293细胞(ATCC),经同源重组形成含hVEGF165基因的缺失E1 区的复制缺陷型重组腺病毒,聚合酶链反应(PCR)鉴定后大量扩增并测定其滴度为2×109pfu/ml,备用。
4 兔主动脉VEC的培养和鉴定 采用胰酶消化法[5]。相差显微镜下细胞呈单层鹅卵石样排列,免疫荧光检查因子Ⅷ阳性。第3～5代细胞用于实验。
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5 目的基因的体外表达 待VEC长成约60%～80%融合时,分为3组:1组为对照组,2和3组分别用每个细胞5pfu和20pfu两个浓度的重组腺病毒感染,48h后吸出上清(分别为CM1、CM2和CM3)进行Western blot,用TRIzol试剂提取细胞RNA，进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)。
5.1 RT-PCR:20μl逆转录反应体系含5×AMV缓冲液4μl,AMV逆转录酶20U, 随机引物20pmol,dNTP 0.25mmol/L,余用样品RNA补足,42℃水浴60min, 95℃灭活逆转录酶10min。然后取上述逆转录产物5μl进行PCR,并以pACCMV*hVEGF为阳性对照。VEGF正、反义引物序列分别为5′-TTGCTGCTCTACCTCCAC-3′和5′-AATGCTTTCTCCGCTCTG-3′。25μl反应体系中含有正、反义引物各28pmol,dNTP 0.2mmol/L,Mg2+ 1.5mmol/L,Taq DNA聚合酶1U。PCR反应条件:94℃ 1min,55℃ 1min,72℃ 75s,共30个循环,最后72℃延伸7min。
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5.2 Western blot:样品先后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质转移、 膜封闭和抗原抗体反应。一抗为兔抗人VEGF多抗,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,显色底物为DAB-H2O2。蛋白质Marker电转移后直接用1g/L的氨基黑染色[3]。
6 VEGF对VEC分泌功能的影响 将对数生长期的VEC接种于24孔板,分成3组,每组16孔。待细胞长成单层后更换新鲜的培养液,每孔1ml,并分别给3组加入等量的CM1、CM2和CM3,继续培养6h,收集上清,采用放射免疫法测6-keto-PGF1a(北京东亚免疫技术研究所产品)。
7 VEGF对VEC增殖的影响 将对数生长期的VEC制成悬液,接种于96孔板,分3组, 每组8孔,每孔4×103个细胞,3组分别加入CM1、CM2和CM3,总体积为每孔100μl,培养48h后,每孔加入WST-1 10μl,继续培养4h,振荡混匀后酶标仪(波长为450nm)测吸光度。
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8 统计学分析 数据以
±s表示,组间比较采用t检验。结果
1 RT-PCR结果 PCR产物应为418bp。 PCR产物电泳后阳性对照和感染组在相当于418bp处可见一清晰条带,每细胞20pfu感染组较每细胞5pfu感染组明显,而对照组未见条带。说明重组腺病毒感染VEC 48h后有VEGF mRNA的转录,并呈剂量依赖性(见图1)。
1：每细胞20pfu感染组；2：每细胞5pfu感染组；
3：阳性对照组；4：λDNA/HindⅢ；5：对照组
图1 RT-PCR结果
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2 Western blot hVEGF165相对分子质量约为5.5～6.0万。感染组在相应位置可见一蛋白质条带,高浓度组较低浓度组明显,而对照组未见条带。说明重组腺病毒感染VEC 48h后有VEGF抗原表达,并呈剂量相关性。
3 VEC培养液中TXB2、6-keto-PGF1a的含量 CM3组 6-keto-PGF1a[(251.01±23.76)pg/ml]较CM2组[(232.25±24.47)pg/ml]、CM2组较CM1组[(212.41±26.32)pg/ml]明显增加(P<0.05和P<0.01),而三组TXB2差异无显著性。
4 VEGF对VEC增殖的影响 CM3组(0.63±0.03)高于CM2组(0.59±0.02),二者又均高于CM1组(0.54±0.02)(P<0.01)。说明VEGF能呈剂量依赖性地促进VEC增殖。
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讨论
PTCA已成为治疗冠心病的重要手段之一,然而约有30%～50%的手术成功者于术后3～6个月内出现冠脉再狭窄,且目前尚无解决办法,严重限制了PTCA的应用和远期疗效。研究认为,再狭窄是动脉损伤后的愈合反应,是一个复杂的生物学过程,其中VEC损伤是再狭窄的始动因素。因此,促进PTCA后损伤内皮的迅速修复并恢复其功能可能是防止再狭窄的关键。
VEGF是近几年来发现的一种糖蛋白,能高效特异促进VEC分裂和增殖, 有利于损伤血管内皮的修复,有可能在预防再狭窄中发挥重要作用。实验证实，VEGF能促进实验性动脉成形术及支架植入后内皮细胞修复,使血栓形成减少、内膜增生及管腔狭窄程度减轻[1,2],其作用机制除已知与加速内皮修复有关外,其作用机制还很不明确。
本研究提示,VEGF不仅能促进VEC增殖,还能促进VEC合成、分泌PGI2,使PGI2/TXA2明显增加,从而抑制血管弹性回缩、血小板沉积、血栓形成、血管平滑肌细胞过度增殖和移行,不利于再狭窄的形成。
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参 考 文 献
1，Asahara T, Chen DH, Tsurumi Y, et al. Accelerated restitution of endothelial integrity and endothelium-dependent function after phVEGF165 gene transfer.Circulation,1996,94:3291-3302.
2，van Belle E,Tio FO,Chen D,et al.Passivation of metallic stents after arterial gene transfer of phVEGF165 inhibits thrombus formation and intimal thickening.J Am Coll Cardiol,1997,29:1371-1379.
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3，Sambrook J,Fritsch EF， Maniatis T.Molecular Cloning.2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.
4，Wilson L， Becker TC.Methods in Cell Biology. Vol 43. New York:Academic Press,1994. 174-185.
5，卢耀增,余铭鹏,夏人仪，等.家兔主动脉内皮细胞的培养及形态学观察.中华病理学杂志,1982,11:176-179.
(收稿日期：1999-03-29), 百拇医药