冠心病、糖尿病和系统性红斑狼疮患者的可溶性血管内皮细胞蛋白C受体检测
作者：吴竞生 周志中 叶山东 戴海明 马礼坤 徐修才 厉小梅
单位：230001 合肥，安徽省立医院
关键词：内皮细胞；受体，蛋白质C；糖尿病；冠状动脉硬化
中华血液学杂志000907
【摘要】 目的 检测冠心病(CHD)、糖尿病(DM)、系统性红斑狼疮(SLE)患者血浆中的可溶性血管内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)水平，以探讨sEPCR在不同疾病患者血浆中表达水平及其临床意义。方法 采用酶联免疫双抗体夹心法检测34例CHD、42例DM、63例SLE患者及20名正常人(NC)血浆中的sEPCR水平。结果 sEPCR在DM患者血浆中的表达水平明显高于正常对照血浆(P<0.05); SLE合并血栓及SLE无血栓患者的sEPCR水平均高于NC组(P<0.005及P<0.001)，但SLE两组之间的sEPCR水平差异无显著性(P>0.05); 冠心病患者血浆中sEPCR水平与正常对照组差异无显著性(P>0.05)。结论 sEPCR在DM病、SLE中升高可能与血管内皮损伤、炎性反应过程有关。
, 百拇医药
Detection of soluble endothelial protein C receptor(sEPCR) in patients with CHD, DM and SLE
WU Jingsheng ZHOU Zhizhong YE Shandong
(Department of Hematology， Anhui Provincial Hospital, Hefei 230001，China)
【Abstract】 Objective To evaluate the clinical significance of plasma soluble endothelial protein C receptor(sEPCR) level in patients with coronary heart disease (CHD), diabetes mellitus (DM) and systemic lupus erythematosus (SLE) . Methods ELISA of antibody-sandwiched principle was used to detect sEPCR in 34 patients with CHD, 42 with DM-Ⅱ, 63 with SLE and 20 normal controls (NC). Results The plasma level of sEPCR in patients with DM was higher than that in NC group (P<0.05). The sEPCR level in SLE patients with thrombosis and non-thrombosis are higher than that in NC group (P<0.005 and P<0.001，respectively). There is no significant difference between the two groups of SLE (P>0.05), and between the CHD and NC groups. Conclusion sEPCR level increased in DM and SLE, it seems related to the process of inflammatory reaction and damage of endothelial cell.
, http://www.100md.com
【Key words】 Endothelial cells; Receptor,protein C； Diabetes; Coronary arteriosclerosis
血管内皮细胞蛋白C受体(EPCR)是近年才发现的蛋白C(PC)系统新的成员，初步研究发现EPCR主要参与体内的抗凝功能及炎性反应，但EPCR在体内的确切生理功能尚不清楚[1，2]，检测不同疾病时体内EPCR的变化，将有助于了解其生理功能，可能为血栓性疾病的发病机制研究开拓新的思路。
对象和方法
1 研究对象
1.1 冠心病(CHD)患者34例，男性19例，女性15例，平均年龄66.4岁(47～78岁)，其中心绞痛患者19例，心肌梗死患者10例。根据1979年国际心脏病学会及WHO临床命名标准化联合专题组制定的诊断标准确诊。
, 百拇医药
1.2 糖尿病(DM)-Ⅱ型患者42例，其中男性19例，女性23例，平均年龄60.5岁(45～76岁)。依照1985年世界卫生组织指定的诊断标准。
1.3 系统性红斑狼疮(SLE)患者63例，其中男性6例，女性57例，平均年龄37.8岁(18～47岁)。均符合美国风湿病学会1982年制定的SLE诊断标准，其中合并血栓患者14例，无血栓患者49例。
1.4 正常对照(NC)组20名，男性12名，女性8名，平均年龄33.6岁(21～46岁)，均为本院健康献血员。
2 标本采集及处理 抽取患者及对照外周血，枸橼酸钠抗凝,3000r/min离心10min, 取上层血浆分装置于-80℃冻存待测。
3 实验方法 采用酶联免疫双抗体夹心法检测sEPCR。包被抗体-单克隆抗体JRK-1501浓度为5μg/ml，纯化的标准品EPCR倍比稀释为400～3125μg/ml,生物素标记的二抗JRK1500浓度为1μg/ml, 碱性磷酸酶底物在酶标仪上于405nm波长处比色(sEPCR试剂由美国Charles教授惠赠)。
, 百拇医药
4 统计学处理 组间比较采用t检验。
结果
CHD患者血浆中的sEPCR水平[(132.8±65.4)mg/L]与NC组[(115.2±20.7)mg/L]比较，差异无显著性(P>0.05)。其中心绞痛[(146.8±83.1)mg/L]及心肌梗死[(117.3±30.0)mg/L]组与NC组比较差异均无显著性(P>0.05)；心绞痛与心肌梗死患者组间sEPCR水平差异亦无显著性(P>0.05)。DM-Ⅱ患者的sEPCR水平为(147.6±57.7)mg/L，明显高于NC组(P<0.05)。SLE合并血栓组[(144.7±33.9)mg/L]及无血栓患者sEPCR水平[(165.8±45.3)mg/L]均高于NC组的sEPCR水平(P<0.005及P<0.001), 但SLE患者两组间sEPCR水平差异无显著性(P>0.05)。
讨论
, 百拇医药
EPCR是最近被发现并获得成功克隆表达的一个新的内皮细胞受体。克隆的EPCR cDNA长1.3kb，是一种具有221个氨基酸的跨膜糖蛋白,主要由血管内皮细胞分泌产生，也是反应血管内皮细胞功能的重要指标之一[1-3]。EPCR通过促进凝血酶-凝血酶调节蛋白(T-TM)复合物与PC的结合来放大PC的激活，并与凝血酶调节蛋白(TM)形成复合物共同参与激活PC[3]。免疫组化法显示，仅在表达EPCR的血管表面能检测出PC，从而提示PC的活化依赖EPCR。 当PC与EPCR结合后大大增强了PC的活化[1]。EPCR不仅能与PC，且能与APC特异性结合，因此另一重要功能是通过与活化的PC结合从而抑制APC的抗凝活性[3，4]。然而EPCR在体内的确切生理功能尚不清楚。
Fukudome等[1,3,4]研究发现EPCR特异性地存在于人体，表达相对局限于大血管内皮细胞，因此有学者认为EPCR是大血管损伤的标志。凝血酶和其它炎症诱导的酶能释放可溶性的EPCR进入血循环，且动脉中的水平高于静脉。已有学者利用RT-PCR方法证实EPCR在稳定的或不稳定的冠状动脉粥样硬化斑块中EPCR mRNA高表达[5]。新近在203例心肌梗死(MI)患者中有4例和149例深部静脉血栓患者中有5例发现EPCR基因突变(如EPCR外显子23 bp的插入) 及多态性，可能是静脉血栓也是MI的危险因素[6]。但本组结果并未显示CHD患者sEPCR水平与NC组之间差异有显著性，其中心绞痛及MI患者EPCR水平与NC组差异也无显著性意义。这是否由于EPCR在动脉、静脉、微循环中浓度不同，或与本文例数偏少，病例选择有关，还待进一步研究证实。
, 百拇医药
血管内皮功能受损是DM患者血栓发生的原因之一，由血管内皮合成的物质如TM，vWF，在DM时血浆浓度的改变证实了内皮损害的存在。EPCR是继发现TM内皮细胞受体后PC系统的又一个新的内皮细胞受体，其水平的高低可能在一定程度内反映内皮细胞功能。EPCR与DM的关系尚未见报道。我们对42例DM-Ⅱ型患者血浆EPCR检测结果显示sEPCR明显高于正常对照，可能与血管内皮受损有关。至于EPCR在DM时是否直接参与APC的抗凝活性，促进血液高凝状态形成，还需要深入研究。
国外已有学者对SLE患者进行过sEPCR的检测，发现SLE患者sEPCR水平明显高于正常对照组[7]。我们的结果也显示SLE患者sEPCR水平均明显高于正常对照组，但SLE合并血栓及无血栓组之间sEPCR水平差异无显著性，提示EPCR可能与SLE患者炎性反应有关，尚未证实EPCR与SLE血栓有直接关系。SLE血栓形成与PC途径密切相关[1]，有资料表明狼疮抗凝物(LA)及获得性抗活化的蛋白C(APCR)是引起SLE患者发生血栓的重要因素之一[8]。sEPCR是否参与SLE患者血栓的形成，值得进一步研究。
, 百拇医药
志谢：本课题受到美国俄克拉何马州医学研究基金会Charles TE教授及徐俊、顾建民博士的指导与帮助，在此表示衷心感谢
基金项目：安徽省自然科学基金资助项目(98452234)
参 考 文 献
1，Esmon CT, Xu J, Gu JM, et al. Endothelial protein C receptor. Thromb Haemost, 1999, 82:251-258.
2，Fukudome K, Esmon CT. Identification cloning and regulation of a novel endothelial cell protein C/ activated protein C receptor. J Biol Chem, 1994, 269:26486-26491.
, 百拇医药
3，Stearns-Kurosawa DJ, Kurosawa S, Mollica JS, et al. The endothelial cell protein C receptor augments protein C activation by the thrombin-thrombomodulin complex. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996, 93:10212-10216.
4，Fukudome K, Ye X, Tsuneyoshi N, et al. Activation mechanism of anticoagulant protein C in large blood vessels involving the endothelial cell protein C receptor. J Exp Med, 1998, 187:1029-1035.
5，Franchi FP, Faioni EM, Biguzzi E, et al. Expression of gene involved in hemostasis and cell adhesion in human coronary atherosclerotic plaques. Thromb Haemost, 1999, suppl:445.
, 百拇医药
6，Merati G, Biguzzi E, Oganesyan N, et al. A 23bp insertion in the endothelial protein C receptor (EPCR) gene in patients with myocardial infarction and deep vein thrombosis. Thromb Haemost, 1999, 82 suppl:507
7，Kurosawa S, Sterarns-Kurosawa DJ, Carson CW, et al. Plasma levels of endothelial cell protein C receptor are elevated in patients with sepsis and systemic lupus erythematosus: lack of correlation with thrombomodulin suggests involvement of different pathological processes(letter). Blood, 1998, 91:724-728.
8，周志中，吴竞生，厉小梅，等. 系统性红斑狼疮抗活化蛋白C的研究. 中华风湿病学杂志，2000，4：18-20.
(收稿日期：2000-03-20), http://www.100md.com
单位：230001 合肥，安徽省立医院
关键词：内皮细胞；受体，蛋白质C；糖尿病；冠状动脉硬化
中华血液学杂志000907
【摘要】 目的 检测冠心病(CHD)、糖尿病(DM)、系统性红斑狼疮(SLE)患者血浆中的可溶性血管内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)水平，以探讨sEPCR在不同疾病患者血浆中表达水平及其临床意义。方法 采用酶联免疫双抗体夹心法检测34例CHD、42例DM、63例SLE患者及20名正常人(NC)血浆中的sEPCR水平。结果 sEPCR在DM患者血浆中的表达水平明显高于正常对照血浆(P<0.05); SLE合并血栓及SLE无血栓患者的sEPCR水平均高于NC组(P<0.005及P<0.001)，但SLE两组之间的sEPCR水平差异无显著性(P>0.05); 冠心病患者血浆中sEPCR水平与正常对照组差异无显著性(P>0.05)。结论 sEPCR在DM病、SLE中升高可能与血管内皮损伤、炎性反应过程有关。
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Detection of soluble endothelial protein C receptor(sEPCR) in patients with CHD, DM and SLE
WU Jingsheng ZHOU Zhizhong YE Shandong
(Department of Hematology， Anhui Provincial Hospital, Hefei 230001，China)
【Abstract】 Objective To evaluate the clinical significance of plasma soluble endothelial protein C receptor(sEPCR) level in patients with coronary heart disease (CHD), diabetes mellitus (DM) and systemic lupus erythematosus (SLE) . Methods ELISA of antibody-sandwiched principle was used to detect sEPCR in 34 patients with CHD, 42 with DM-Ⅱ, 63 with SLE and 20 normal controls (NC). Results The plasma level of sEPCR in patients with DM was higher than that in NC group (P<0.05). The sEPCR level in SLE patients with thrombosis and non-thrombosis are higher than that in NC group (P<0.005 and P<0.001，respectively). There is no significant difference between the two groups of SLE (P>0.05), and between the CHD and NC groups. Conclusion sEPCR level increased in DM and SLE, it seems related to the process of inflammatory reaction and damage of endothelial cell.
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【Key words】 Endothelial cells; Receptor,protein C； Diabetes; Coronary arteriosclerosis
血管内皮细胞蛋白C受体(EPCR)是近年才发现的蛋白C(PC)系统新的成员，初步研究发现EPCR主要参与体内的抗凝功能及炎性反应，但EPCR在体内的确切生理功能尚不清楚[1，2]，检测不同疾病时体内EPCR的变化，将有助于了解其生理功能，可能为血栓性疾病的发病机制研究开拓新的思路。
对象和方法
1 研究对象
1.1 冠心病(CHD)患者34例，男性19例，女性15例，平均年龄66.4岁(47～78岁)，其中心绞痛患者19例，心肌梗死患者10例。根据1979年国际心脏病学会及WHO临床命名标准化联合专题组制定的诊断标准确诊。
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1.2 糖尿病(DM)-Ⅱ型患者42例，其中男性19例，女性23例，平均年龄60.5岁(45～76岁)。依照1985年世界卫生组织指定的诊断标准。
1.3 系统性红斑狼疮(SLE)患者63例，其中男性6例，女性57例，平均年龄37.8岁(18～47岁)。均符合美国风湿病学会1982年制定的SLE诊断标准，其中合并血栓患者14例，无血栓患者49例。
1.4 正常对照(NC)组20名，男性12名，女性8名，平均年龄33.6岁(21～46岁)，均为本院健康献血员。
2 标本采集及处理 抽取患者及对照外周血，枸橼酸钠抗凝,3000r/min离心10min, 取上层血浆分装置于-80℃冻存待测。
3 实验方法 采用酶联免疫双抗体夹心法检测sEPCR。包被抗体-单克隆抗体JRK-1501浓度为5μg/ml，纯化的标准品EPCR倍比稀释为400～3125μg/ml,生物素标记的二抗JRK1500浓度为1μg/ml, 碱性磷酸酶底物在酶标仪上于405nm波长处比色(sEPCR试剂由美国Charles教授惠赠)。
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4 统计学处理 组间比较采用t检验。
结果
CHD患者血浆中的sEPCR水平[(132.8±65.4)mg/L]与NC组[(115.2±20.7)mg/L]比较，差异无显著性(P>0.05)。其中心绞痛[(146.8±83.1)mg/L]及心肌梗死[(117.3±30.0)mg/L]组与NC组比较差异均无显著性(P>0.05)；心绞痛与心肌梗死患者组间sEPCR水平差异亦无显著性(P>0.05)。DM-Ⅱ患者的sEPCR水平为(147.6±57.7)mg/L，明显高于NC组(P<0.05)。SLE合并血栓组[(144.7±33.9)mg/L]及无血栓患者sEPCR水平[(165.8±45.3)mg/L]均高于NC组的sEPCR水平(P<0.005及P<0.001), 但SLE患者两组间sEPCR水平差异无显著性(P>0.05)。
讨论
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EPCR是最近被发现并获得成功克隆表达的一个新的内皮细胞受体。克隆的EPCR cDNA长1.3kb，是一种具有221个氨基酸的跨膜糖蛋白,主要由血管内皮细胞分泌产生，也是反应血管内皮细胞功能的重要指标之一[1-3]。EPCR通过促进凝血酶-凝血酶调节蛋白(T-TM)复合物与PC的结合来放大PC的激活，并与凝血酶调节蛋白(TM)形成复合物共同参与激活PC[3]。免疫组化法显示，仅在表达EPCR的血管表面能检测出PC，从而提示PC的活化依赖EPCR。 当PC与EPCR结合后大大增强了PC的活化[1]。EPCR不仅能与PC，且能与APC特异性结合，因此另一重要功能是通过与活化的PC结合从而抑制APC的抗凝活性[3，4]。然而EPCR在体内的确切生理功能尚不清楚。
Fukudome等[1,3,4]研究发现EPCR特异性地存在于人体，表达相对局限于大血管内皮细胞，因此有学者认为EPCR是大血管损伤的标志。凝血酶和其它炎症诱导的酶能释放可溶性的EPCR进入血循环，且动脉中的水平高于静脉。已有学者利用RT-PCR方法证实EPCR在稳定的或不稳定的冠状动脉粥样硬化斑块中EPCR mRNA高表达[5]。新近在203例心肌梗死(MI)患者中有4例和149例深部静脉血栓患者中有5例发现EPCR基因突变(如EPCR外显子23 bp的插入) 及多态性，可能是静脉血栓也是MI的危险因素[6]。但本组结果并未显示CHD患者sEPCR水平与NC组之间差异有显著性，其中心绞痛及MI患者EPCR水平与NC组差异也无显著性意义。这是否由于EPCR在动脉、静脉、微循环中浓度不同，或与本文例数偏少，病例选择有关，还待进一步研究证实。
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血管内皮功能受损是DM患者血栓发生的原因之一，由血管内皮合成的物质如TM，vWF，在DM时血浆浓度的改变证实了内皮损害的存在。EPCR是继发现TM内皮细胞受体后PC系统的又一个新的内皮细胞受体，其水平的高低可能在一定程度内反映内皮细胞功能。EPCR与DM的关系尚未见报道。我们对42例DM-Ⅱ型患者血浆EPCR检测结果显示sEPCR明显高于正常对照，可能与血管内皮受损有关。至于EPCR在DM时是否直接参与APC的抗凝活性，促进血液高凝状态形成，还需要深入研究。
国外已有学者对SLE患者进行过sEPCR的检测，发现SLE患者sEPCR水平明显高于正常对照组[7]。我们的结果也显示SLE患者sEPCR水平均明显高于正常对照组，但SLE合并血栓及无血栓组之间sEPCR水平差异无显著性，提示EPCR可能与SLE患者炎性反应有关，尚未证实EPCR与SLE血栓有直接关系。SLE血栓形成与PC途径密切相关[1]，有资料表明狼疮抗凝物(LA)及获得性抗活化的蛋白C(APCR)是引起SLE患者发生血栓的重要因素之一[8]。sEPCR是否参与SLE患者血栓的形成，值得进一步研究。
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志谢：本课题受到美国俄克拉何马州医学研究基金会Charles TE教授及徐俊、顾建民博士的指导与帮助，在此表示衷心感谢
基金项目：安徽省自然科学基金资助项目(98452234)
参 考 文 献
1，Esmon CT, Xu J, Gu JM, et al. Endothelial protein C receptor. Thromb Haemost, 1999, 82:251-258.
2，Fukudome K, Esmon CT. Identification cloning and regulation of a novel endothelial cell protein C/ activated protein C receptor. J Biol Chem, 1994, 269:26486-26491.
, 百拇医药
3，Stearns-Kurosawa DJ, Kurosawa S, Mollica JS, et al. The endothelial cell protein C receptor augments protein C activation by the thrombin-thrombomodulin complex. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996, 93:10212-10216.
4，Fukudome K, Ye X, Tsuneyoshi N, et al. Activation mechanism of anticoagulant protein C in large blood vessels involving the endothelial cell protein C receptor. J Exp Med, 1998, 187:1029-1035.
5，Franchi FP, Faioni EM, Biguzzi E, et al. Expression of gene involved in hemostasis and cell adhesion in human coronary atherosclerotic plaques. Thromb Haemost, 1999, suppl:445.
, 百拇医药
6，Merati G, Biguzzi E, Oganesyan N, et al. A 23bp insertion in the endothelial protein C receptor (EPCR) gene in patients with myocardial infarction and deep vein thrombosis. Thromb Haemost, 1999, 82 suppl:507
7，Kurosawa S, Sterarns-Kurosawa DJ, Carson CW, et al. Plasma levels of endothelial cell protein C receptor are elevated in patients with sepsis and systemic lupus erythematosus: lack of correlation with thrombomodulin suggests involvement of different pathological processes(letter). Blood, 1998, 91:724-728.
8，周志中，吴竞生，厉小梅，等. 系统性红斑狼疮抗活化蛋白C的研究. 中华风湿病学杂志，2000，4：18-20.
(收稿日期：2000-03-20), http://www.100md.com