脑血栓患者凝血因子Ⅻ对纤溶活性影响的初步研究
作者：胡翊群 王鸿利 焦洁茹 王也飞 余文红 凌晓斌
单位：200025 上海第二医科大学附属瑞金医院
关键词：血液凝固因子Ⅻ；血栓形成；纤维蛋白溶解；突变
中华血液学杂志000905 【摘要】 目的 研究脑血栓和(或)脑腔隙性梗死(脑腔梗)患者中凝血因子Ⅻ(FⅫ)对纤溶的影响。方法 用ELISA方法检测脑血栓患者血浆FⅫ∶Ag、FⅫa、β FⅫa水平,FⅫ∶C和其他纤溶活性；利用MOEA技术筛选是否存在已知常见的FⅫ基因点突变。结果 107例脑血栓患者中，有22例呈FⅫ∶C下降，类似FⅫ CRM+表现，PLG∶A、α2AP∶A升高和D-二聚体(D-D)水平降低的同时，FⅫa和β FⅫa水平明显降低；22例FⅫ∶C下降患者均未见已知的FⅫ基因突变。结论 FⅫ∶C下降可能通过降低纤溶酶原的活性，在脑血栓形成中发挥重要作用；类似FⅫ CRM+的FⅫ异常，其基因突变与已知基因突变不同；FⅫ334精氨酸、353精氨酸所在区域相应的基因点突变可能对FⅫa、β FⅫa水平和纤溶活性下降更重要。所以血栓性疾病筛选检查中有必要考虑FⅫ的检测。
, 百拇医药
Preliminary study on the effects of coagulation factor Ⅻ on fibrinolysis
HU Yiqun WANG Hongli JIAO Jieru
(Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025,China)
【Abstract】 Objective To study the effects of FⅫ on fibrinolysis in patients with cerebral thrombosis. Methods Plasma level of FⅫ∶C, FⅫ∶Ag, FⅫa and β FⅫa and fibrinolysis activities were examined by ELISA. Screening of FⅫ gene mutation by MOEA. Results FⅫ∶C in 22 of 107 patients with cerebral thrombosis decreased, which was similar to the feature of FⅫ cross-reacting material positive (FⅫ CRM+). There were significant increase in plasma levels of PLG∶A and α2AP∶A and decrease in D-dimer, moreover, plasma levels of FⅫa and βFⅫa were lower in patients than in controls. FⅫ gene mutation was not found in 22 of 107 patients. Conclusion Decrease of FⅫ∶C may play an important role in cerebral thrombosis by reducing activation of plasminogen. The gene mutation of FⅫ CRM+-like abnormal FⅫ was different from the known FⅫ gene mutation. Mutations in the regions of FⅫ Arg (334) and Arg(353) may be more important for the reducing of FⅫa、β FⅫa levels and fibrinolysis activities. FⅫ assay should be included in thrombotic disorder screening.
, 百拇医药
【Key words】 Blood coagulation factor Ⅻ； Thrombosis； Fibrinolysis； Gene mutation
凝血因子Ⅻ(FⅫ) 是一种涉及凝血、纤溶和补体系统的接触活性物质[1]。1980年以来，陆续报道了家族性或获得性FⅫ缺陷导致血栓性疾病的病例。发生血栓性疾病均被认为是FⅫ对纤溶酶原激活的影响，其机制不清楚[2，3]。 已报道的FⅫ缺陷患者，有的表现血栓性疾病，如深部静脉血栓(DVT)，有些没有血栓形成表现。为进一步了解FⅫ与血栓形成的关系，选择FⅫ活性下降的脑血栓疾病患者，研究其对纤溶活性的影响。
对象和方法
1 对象
1.1 病例:共107例，男性69例，女性38例，平均年龄58岁(42～78岁)。 均为我院近两年来经临床和核磁共振检查确定为脑栓塞的患者。其中脑腔隙性梗死(脑腔梗)80例，男性52例，女性28例，平均年龄56(42～78)岁；FⅫ活性低于60%的患者22例，男性14例，女性8例，平均年龄49(42～61)岁。
, 百拇医药
1.2 对照组：共59名，均为我院体检正常者，无血栓性疾病和高血压、高血脂、肝肾疾病史，年龄41～65岁。其中男性30名，女性29名。
2 方法
2.1 FⅫ活性和抗原检测:对照组和所有患者在早晨空腹静脉采血，枸橼酸钠抗凝，分离血浆，置-30℃冰箱保存待测。所有血浆标本分别以一期法检测FⅫ∶C(乏FⅫ基质血浆和APTT试剂由Dade公司提供)；ELISA法检测FⅫ抗原(FⅫ∶Ag)、活化FⅫ抗原(FⅫa∶Ag)和活化β FⅫ抗原(β FⅫa∶Ag)(试剂由Engygnost和Shield Diagnostics公司提供)；发色底物法检测纤溶酶原活性(PLG∶A)、α2抗纤溶酶活性(α2AP∶A)(Dade公司提供试剂)；免疫比浊法检测D-二聚体(D-D)水平(三菱公司提供试剂)，用CA-1500全自动血凝仪检测[4]。
, 百拇医药 2.2 基因分析：对照组和患者的基因组DNA以蛋白酶K-苯酚-氯仿法提取。参照Hofferbert等[5]的FⅫ基因点突变检测选定引物序列，合成两个外显子1区域引物(PⅠa：5′-TTCACAGTGGACTCCAAGATC-3′，PⅠb：5′-AGAACAATCCTGGGACAATCC-3′)，两个外显子3区域引物(PⅢa：5′-TTGTGGGTACATTTGTGGTAC-3′，PⅢb：5′-CTCCCCGGTGACAGTGAGAAC-3′)和一个外显子ⅪⅤ区域引物(PⅪⅤ：5′-AGCTGCGTGTTTCCGACCCAG-3′)。以Efremov等建立的快速检测已知点突变的突变引物延伸扩增技术(MOEA)[6]来检测常见的基因突变。
3 统计学分析 检测数据以u检验和t检验处理。
结果
1 脑血栓疾病患者和对照组的FⅫ和纤溶活性检测结果见表1。
, 百拇医药
表1 脑血栓疾病患者FⅫ和纤溶活性检测结果(
±s) 组别
例
数
FⅫ∶C
(%)
FⅫ∶Ag
(μg/L)
FⅫa∶Ag
(μg/L)
βFⅫa∶Ag
(μg/L)
, 百拇医药
PLG∶A
(%)
α2AP∶A
(%)
D-D
(mg/L)
对照组
59
101.2±14.3
2.1±0.2
2.5±1.9
1.7±0.9
, 百拇医药
99.2±8.8
103.4±9.8
0.31±0.11
脑血栓组
(包括
脑腔梗)
107
82.4±23.8*
2.4±0.3△
3.3±2.1△
2.2±1.3☆
, 百拇医药
92.3±25.4*
106.6±19.2*
0.48±0.19☆
脑腔梗组
80
68.8±28.7＃
2.2±0.6*
2.1±1.8☆
1.9±1.2☆
103.1±29.6☆
, 百拇医药
112.5±15.6＃
0.38±0.13☆
FⅫ
CRM+组
22
39.7±18.1☆■
2.0±0.2*▲
0.9±0.6☆▲
0.7±0.5☆▲
121.8±16.2＃■
, http://www.100md.com
136.8±24.2＃■
0.30±0.14■△
注：与对照组比较，*P>0.05,#P<0.05，△P<0.01，☆P<0.001; 与脑腔梗患者比较，■P<0.05，▲P<0.012 在对107例脑血栓患者的检测中发现，FⅫ∶C虽较对照组降低，但仍处正常参考值范围内。D-D、FⅫa和β FⅫa水平明显升高，与对照组相比差异有显著性。
3 107例脑血栓患者中22例FⅫ∶C明显下降，平均为正常值的39.7%，其FⅫ∶Ag水平与对照组比较差异无显著性，表现出FⅫ CRM+特征；FⅫa和β FⅫa水平明显降低，D-D水平低于其他患者，但与对照组相比差异无显著性；而PLG∶A和α2AP∶A水平升高，和对照组及其他脑血栓患者相比差异有显著性。
, 百拇医药
4 FⅫ已知高频基因突变的MOEA检测结果 22例表现FⅫ CRM+患者HindⅢ酶切后产生区带与正常人一样，仅为一条较长的扩增片段，表明其相关FⅫ基因正常。
讨论
FⅫ是一种接触活性物质，相对分子质量为76000，由596个氨基酸组成的单链糖蛋白，其基因总长2045bp，包括14个外显子和13个内含子，定位于5q33[7]。FⅫ在体内可以被激肽释放酶、纤溶酶、凝血酶激活。FⅫ单链的精氨酸(353)和缬氨酸(354)间切断后单链FⅫ转变为由二硫键联结的FⅫa(αFⅫa)双链结构。进而又可在FⅫa重链的精氨酸(334)和天门冬氨酸(335)间切断，产生β FⅫa。α FⅫa和β FⅫa都具酶活性，可激活激肽释放酶原(PK)和纤溶酶原(PLG)[8]。
我们对脑血栓患者FⅫ研究中发现，22例患者(其中18例为脑腔梗)存在明显FⅫ∶C降低(平均为39.7%)，但FⅫ∶Ag水平与对照组比较并无明显降低。可认为属FⅫ CRM+特征。这些患者FⅫa和β FⅫa的水平都明显降低，说明FⅫ酶活性降低；患者血浆的D-D水平不高，而PLG∶A、α2AP∶A超过对照组和其他脑血栓(脑腔梗)患者，表现出纤溶活性和纤溶酶原激活水平降低。其余脑血栓患者虽有FⅫ∶C降低，但不明显，这部分患者D-D水平较高，FⅫa和β FⅫa水平也高于对照组，不存在因FⅫ水平下降造成的纤溶活性和纤溶酶原激活水平的低下现象。说明这部分患者的脑血栓病变与FⅫ缺陷患者不同。
, 百拇医药
我们对22例FⅫ∶C降低患者用MOEA方法未能证实外显子1-8 G→C、外显子3-224 T→C、外显子3-244 T→C和11396位核苷酸G→A的突变[3，4]。 因此，这些患者FⅫ∶C下降的主要因素是FⅫa和βFⅫa的减少，而非简单的FⅫ∶Ag的减少。我们曾用Sanger双脱氧法，对1例FⅫ水平下降患者的FⅫ基因9772～10002核苷酸区域作尝试性DNA测序，结果显示患者可能存在FⅫ基因9815位核苷酸G→A突变。
我们的研究结果表明，FⅫ∶C、FⅫa和βFⅫa降低可导致纤溶活性的下降；FⅫ的测定也许是血栓性疾病有用的筛选项目。
参 考 文 献
1，Farsetti A, Masiti S, Citarelia F,et al. Molecular basis of estrogen regulation of factor Ⅻ gene expression. Endocrinology，1995,136:5076-5083.
, 百拇医药
2，Coppola R, Cristilli P,Cugno M, et al. Measurement of activated factor Ⅻ in health and disease. Blood Coagul Fibrinolysis，1996,7:530-535.
3，Schloesser M, Hofferbert S,Bartg V, et al. The novel acceptor splice site mutation 11396(G→A)in the factor Ⅻ gene cause a truncated transcript in cross-reacting materiel negative patients.Hum Mol Genet，1995，85:66-70.
4，李家增，王鸿利，韩忠朝. 血液实验学.上海：上海科学技术出版社， 1997. 356-359;366-368;421-424;434-435.
, http://www.100md.com
5，Hofferbert S, Muller J, Kostering H, et al. A novel 5′-upstream mutation in the factor Ⅻ gene is associated with a TaqⅠ restriction site in an Alu repeat in factor Ⅻ-deficient patients. Hum Genet，1996，97:838-841.
6，Efremov DG,Dimovsk AJ, Jankovic I, et al. Mutant oligonucleotide extension amplification:a nonlabeling polymerase-chain-reaction- based assay for the detection of point mutations. Acta Haematol，1991，85:66-70.
7，Cool DE, MacGillivray RTA. Characterization of the human blood coagulation factor Ⅻ gene. J Bio Chem,1987,262:13662-13673.
8，王鸿利. 血液学和血液学检验.第2版. 北京：人民卫生出版社, 1997.236-248.
(收稿日期：2000-03-17), 百拇医药
单位：200025 上海第二医科大学附属瑞金医院
关键词：血液凝固因子Ⅻ；血栓形成；纤维蛋白溶解；突变
中华血液学杂志000905 【摘要】 目的 研究脑血栓和(或)脑腔隙性梗死(脑腔梗)患者中凝血因子Ⅻ(FⅫ)对纤溶的影响。方法 用ELISA方法检测脑血栓患者血浆FⅫ∶Ag、FⅫa、β FⅫa水平,FⅫ∶C和其他纤溶活性；利用MOEA技术筛选是否存在已知常见的FⅫ基因点突变。结果 107例脑血栓患者中，有22例呈FⅫ∶C下降，类似FⅫ CRM+表现，PLG∶A、α2AP∶A升高和D-二聚体(D-D)水平降低的同时，FⅫa和β FⅫa水平明显降低；22例FⅫ∶C下降患者均未见已知的FⅫ基因突变。结论 FⅫ∶C下降可能通过降低纤溶酶原的活性，在脑血栓形成中发挥重要作用；类似FⅫ CRM+的FⅫ异常，其基因突变与已知基因突变不同；FⅫ334精氨酸、353精氨酸所在区域相应的基因点突变可能对FⅫa、β FⅫa水平和纤溶活性下降更重要。所以血栓性疾病筛选检查中有必要考虑FⅫ的检测。
, 百拇医药
Preliminary study on the effects of coagulation factor Ⅻ on fibrinolysis
HU Yiqun WANG Hongli JIAO Jieru
(Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025,China)
【Abstract】 Objective To study the effects of FⅫ on fibrinolysis in patients with cerebral thrombosis. Methods Plasma level of FⅫ∶C, FⅫ∶Ag, FⅫa and β FⅫa and fibrinolysis activities were examined by ELISA. Screening of FⅫ gene mutation by MOEA. Results FⅫ∶C in 22 of 107 patients with cerebral thrombosis decreased, which was similar to the feature of FⅫ cross-reacting material positive (FⅫ CRM+). There were significant increase in plasma levels of PLG∶A and α2AP∶A and decrease in D-dimer, moreover, plasma levels of FⅫa and βFⅫa were lower in patients than in controls. FⅫ gene mutation was not found in 22 of 107 patients. Conclusion Decrease of FⅫ∶C may play an important role in cerebral thrombosis by reducing activation of plasminogen. The gene mutation of FⅫ CRM+-like abnormal FⅫ was different from the known FⅫ gene mutation. Mutations in the regions of FⅫ Arg (334) and Arg(353) may be more important for the reducing of FⅫa、β FⅫa levels and fibrinolysis activities. FⅫ assay should be included in thrombotic disorder screening.
, 百拇医药
【Key words】 Blood coagulation factor Ⅻ； Thrombosis； Fibrinolysis； Gene mutation
凝血因子Ⅻ(FⅫ) 是一种涉及凝血、纤溶和补体系统的接触活性物质[1]。1980年以来，陆续报道了家族性或获得性FⅫ缺陷导致血栓性疾病的病例。发生血栓性疾病均被认为是FⅫ对纤溶酶原激活的影响，其机制不清楚[2，3]。 已报道的FⅫ缺陷患者，有的表现血栓性疾病，如深部静脉血栓(DVT)，有些没有血栓形成表现。为进一步了解FⅫ与血栓形成的关系，选择FⅫ活性下降的脑血栓疾病患者，研究其对纤溶活性的影响。
对象和方法
1 对象
1.1 病例:共107例，男性69例，女性38例，平均年龄58岁(42～78岁)。 均为我院近两年来经临床和核磁共振检查确定为脑栓塞的患者。其中脑腔隙性梗死(脑腔梗)80例，男性52例，女性28例，平均年龄56(42～78)岁；FⅫ活性低于60%的患者22例，男性14例，女性8例，平均年龄49(42～61)岁。
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1.2 对照组：共59名，均为我院体检正常者，无血栓性疾病和高血压、高血脂、肝肾疾病史，年龄41～65岁。其中男性30名，女性29名。
2 方法
2.1 FⅫ活性和抗原检测:对照组和所有患者在早晨空腹静脉采血，枸橼酸钠抗凝，分离血浆，置-30℃冰箱保存待测。所有血浆标本分别以一期法检测FⅫ∶C(乏FⅫ基质血浆和APTT试剂由Dade公司提供)；ELISA法检测FⅫ抗原(FⅫ∶Ag)、活化FⅫ抗原(FⅫa∶Ag)和活化β FⅫ抗原(β FⅫa∶Ag)(试剂由Engygnost和Shield Diagnostics公司提供)；发色底物法检测纤溶酶原活性(PLG∶A)、α2抗纤溶酶活性(α2AP∶A)(Dade公司提供试剂)；免疫比浊法检测D-二聚体(D-D)水平(三菱公司提供试剂)，用CA-1500全自动血凝仪检测[4]。
, 百拇医药 2.2 基因分析：对照组和患者的基因组DNA以蛋白酶K-苯酚-氯仿法提取。参照Hofferbert等[5]的FⅫ基因点突变检测选定引物序列，合成两个外显子1区域引物(PⅠa：5′-TTCACAGTGGACTCCAAGATC-3′，PⅠb：5′-AGAACAATCCTGGGACAATCC-3′)，两个外显子3区域引物(PⅢa：5′-TTGTGGGTACATTTGTGGTAC-3′，PⅢb：5′-CTCCCCGGTGACAGTGAGAAC-3′)和一个外显子ⅪⅤ区域引物(PⅪⅤ：5′-AGCTGCGTGTTTCCGACCCAG-3′)。以Efremov等建立的快速检测已知点突变的突变引物延伸扩增技术(MOEA)[6]来检测常见的基因突变。
3 统计学分析 检测数据以u检验和t检验处理。
结果
1 脑血栓疾病患者和对照组的FⅫ和纤溶活性检测结果见表1。
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表1 脑血栓疾病患者FⅫ和纤溶活性检测结果(
±s) 组别例
数
FⅫ∶C
(%)
FⅫ∶Ag
(μg/L)
FⅫa∶Ag
(μg/L)
βFⅫa∶Ag
(μg/L)
, 百拇医药
PLG∶A
(%)
α2AP∶A
(%)
D-D
(mg/L)
对照组
59
101.2±14.3
2.1±0.2
2.5±1.9
1.7±0.9
, 百拇医药
99.2±8.8
103.4±9.8
0.31±0.11
脑血栓组
(包括
脑腔梗)
107
82.4±23.8*
2.4±0.3△
3.3±2.1△
2.2±1.3☆
, 百拇医药
92.3±25.4*
106.6±19.2*
0.48±0.19☆
脑腔梗组
80
68.8±28.7＃
2.2±0.6*
2.1±1.8☆
1.9±1.2☆
103.1±29.6☆
, 百拇医药
112.5±15.6＃
0.38±0.13☆
FⅫ
CRM+组
22
39.7±18.1☆■
2.0±0.2*▲
0.9±0.6☆▲
0.7±0.5☆▲
121.8±16.2＃■
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136.8±24.2＃■
0.30±0.14■△
注：与对照组比较，*P>0.05,#P<0.05，△P<0.01，☆P<0.001; 与脑腔梗患者比较，■P<0.05，▲P<0.012 在对107例脑血栓患者的检测中发现，FⅫ∶C虽较对照组降低，但仍处正常参考值范围内。D-D、FⅫa和β FⅫa水平明显升高，与对照组相比差异有显著性。
3 107例脑血栓患者中22例FⅫ∶C明显下降，平均为正常值的39.7%，其FⅫ∶Ag水平与对照组比较差异无显著性，表现出FⅫ CRM+特征；FⅫa和β FⅫa水平明显降低，D-D水平低于其他患者，但与对照组相比差异无显著性；而PLG∶A和α2AP∶A水平升高，和对照组及其他脑血栓患者相比差异有显著性。
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4 FⅫ已知高频基因突变的MOEA检测结果 22例表现FⅫ CRM+患者HindⅢ酶切后产生区带与正常人一样，仅为一条较长的扩增片段，表明其相关FⅫ基因正常。
讨论
FⅫ是一种接触活性物质，相对分子质量为76000，由596个氨基酸组成的单链糖蛋白，其基因总长2045bp，包括14个外显子和13个内含子，定位于5q33[7]。FⅫ在体内可以被激肽释放酶、纤溶酶、凝血酶激活。FⅫ单链的精氨酸(353)和缬氨酸(354)间切断后单链FⅫ转变为由二硫键联结的FⅫa(αFⅫa)双链结构。进而又可在FⅫa重链的精氨酸(334)和天门冬氨酸(335)间切断，产生β FⅫa。α FⅫa和β FⅫa都具酶活性，可激活激肽释放酶原(PK)和纤溶酶原(PLG)[8]。
我们对脑血栓患者FⅫ研究中发现，22例患者(其中18例为脑腔梗)存在明显FⅫ∶C降低(平均为39.7%)，但FⅫ∶Ag水平与对照组比较并无明显降低。可认为属FⅫ CRM+特征。这些患者FⅫa和β FⅫa的水平都明显降低，说明FⅫ酶活性降低；患者血浆的D-D水平不高，而PLG∶A、α2AP∶A超过对照组和其他脑血栓(脑腔梗)患者，表现出纤溶活性和纤溶酶原激活水平降低。其余脑血栓患者虽有FⅫ∶C降低，但不明显，这部分患者D-D水平较高，FⅫa和β FⅫa水平也高于对照组，不存在因FⅫ水平下降造成的纤溶活性和纤溶酶原激活水平的低下现象。说明这部分患者的脑血栓病变与FⅫ缺陷患者不同。
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我们对22例FⅫ∶C降低患者用MOEA方法未能证实外显子1-8 G→C、外显子3-224 T→C、外显子3-244 T→C和11396位核苷酸G→A的突变[3，4]。 因此，这些患者FⅫ∶C下降的主要因素是FⅫa和βFⅫa的减少，而非简单的FⅫ∶Ag的减少。我们曾用Sanger双脱氧法，对1例FⅫ水平下降患者的FⅫ基因9772～10002核苷酸区域作尝试性DNA测序，结果显示患者可能存在FⅫ基因9815位核苷酸G→A突变。
我们的研究结果表明，FⅫ∶C、FⅫa和βFⅫa降低可导致纤溶活性的下降；FⅫ的测定也许是血栓性疾病有用的筛选项目。
参 考 文 献
1，Farsetti A, Masiti S, Citarelia F,et al. Molecular basis of estrogen regulation of factor Ⅻ gene expression. Endocrinology，1995,136:5076-5083.
, 百拇医药
2，Coppola R, Cristilli P,Cugno M, et al. Measurement of activated factor Ⅻ in health and disease. Blood Coagul Fibrinolysis，1996,7:530-535.
3，Schloesser M, Hofferbert S,Bartg V, et al. The novel acceptor splice site mutation 11396(G→A)in the factor Ⅻ gene cause a truncated transcript in cross-reacting materiel negative patients.Hum Mol Genet，1995，85:66-70.
4，李家增，王鸿利，韩忠朝. 血液实验学.上海：上海科学技术出版社， 1997. 356-359;366-368;421-424;434-435.
, http://www.100md.com
5，Hofferbert S, Muller J, Kostering H, et al. A novel 5′-upstream mutation in the factor Ⅻ gene is associated with a TaqⅠ restriction site in an Alu repeat in factor Ⅻ-deficient patients. Hum Genet，1996，97:838-841.
6，Efremov DG,Dimovsk AJ, Jankovic I, et al. Mutant oligonucleotide extension amplification:a nonlabeling polymerase-chain-reaction- based assay for the detection of point mutations. Acta Haematol，1991，85:66-70.
7，Cool DE, MacGillivray RTA. Characterization of the human blood coagulation factor Ⅻ gene. J Bio Chem,1987,262:13662-13673.
8，王鸿利. 血液学和血液学检验.第2版. 北京：人民卫生出版社, 1997.236-248.
(收稿日期：2000-03-17), 百拇医药