逆转录病毒载体介导人凝血因子Ⅷ的体外高效表达
作者：郭雪梅 王鸿利 储海燕 王学锋 璩斌 李志广 戚正武 王振义
单位：郭雪梅 王鸿利 储海燕 王学锋 璩斌 李志广 王振义(200025 上海第二医科大学附属瑞金医院、上海血液学研究所)；戚正武(中国科学院上海生物化学研究所)
关键词：载体，病毒；血液凝固因子Ⅷ；基因表达
中华血液学杂志000902
【摘要】 目的 建立逆转录病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ(FⅧ)体外高效表达体系。方法 将一B区缺失(760aa～1639aa)的人FⅧ cDNA(FⅧBD cDNA)克隆至逆转录病毒载体pLNCX，构建了重组表达载体pLNC-FⅧBD。经PA317细胞包装后，感染多种靶细胞。分别采用一期法、ELISA法和RT-PCR检测细胞培养上清中人FⅧ的凝血活性(FⅧ∶C)和抗原含量(FⅧ∶Ag)以及细胞中FⅧBD cDNA的转录。结果 pLNC-FⅧBD在4种靶细胞中以NIH3T3细胞的表达最高，在24 h内每毫升中106细胞表达FⅧ∶C为1.6U，FⅧ∶Ag为500ng。结论 逆转录病毒载体能够介导人FⅧ的体外高效表达，为血友病A的基因治疗奠定了基础。
, 百拇医药
Retroviral-mediated high efficient in vitro expression of human coagulation factor Ⅷ
GUO Xuemei WANG Hongli CHU haiyan
(Shanghai Institute of Hematology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China)
【Abstract】 Objective To develop a retroviral-mediated high efficient expression system of human coagulation factor Ⅷ. Methods The retroviral vector LNC-ⅧBD was generated by cloning a B-domain-deleted FⅧ cDNA (760aa～1639aa) into retroviral vector pLNCX. Several cell lines including NIH3T3, CHO, COS-7 and human hepatic cell line L-02 were infected with viral supernatant from the highest productive PA317 clones. The antigen and procoagulant activity of human FⅧ in the cell culture medium were measured by ELISA assay and one-stage method, respectively. RT-PCR was performed for the detection of FⅧBD mRNA. Results Human FⅧ was expressed in all four target cells. The highest expression was observed in NIH3T3, the procoagulant activity of secreted FⅧ was up to 1.6U, and the FⅧ antigen was 500ng by 106 cells/ml in 24 hours,respectively. Conclusion The constructed retroviral vector was able to generate high level expression of human FⅧ in some cell lines, and it might have potential utility in the gene therapy for Hemophilia A.
, 百拇医药
【Key words】 Vector，retroviral； Blood coagulation factor Ⅷ； Gene expression
血友病A( HA)是临床常见的X染色体连锁的遗传性出血性疾病，患者因为基因缺陷导致血浆凝血因子Ⅷ(FⅧ)缺乏或活性下降。基因治疗是根治HA的理想模式之一。逆转录病毒载体可以稳定整合至宿主细胞的染色体，有利于实现目的基因的长期稳定表达。为了探讨逆转录病毒载体用于HA基因治疗的可能性，我们构建了重组人FⅧ逆转录表达载体，并观察其在体外不同靶细胞中的表达。
材料和方法
1 重组逆转录表达载体pLNC-FⅧBD的构建 B区大部分缺失(760aa～1639aa)的FⅧ cDNA克隆(FⅧBDcDNA)由中国科学院生物化学研究所戚正武院士惠赠，逆转录病毒载体pLNCX购自Clontech公司。采用SalⅠ和XhoⅠ酶切pGRE5.2/EBV-FⅧBD(本室构建)，得到长4.6kb的FⅧBD cDNA, 将此片段克隆至pLNCX的HpaⅠ位点，构建pLNC-FⅧBD。
, 百拇医药
2 细胞株和细胞培养 PA317、CHO、COS-7和NIH3T3细胞为本所冻存的细胞株。正常成人肝细胞株L-02购自中国科学院细胞库。细胞培养条件为含体积分数为10%的新生牛血清(Hyclone)的DMEM(购自Gibco-BRL公司)，37℃，体积分数为5%的CO2。
3 重组逆转录病毒的包装和克隆筛选 采用脂质体(LipofactaMINE,购自 Gibco-BRL公司)介导pLNC-FⅧBD转染包装细胞PA317，具体操作参照产品手册。转染后5h更换新鲜培养液。48h后，1∶4传代细胞，更换含G418(购自Amresco公司)的选择性培养基进行筛选，G418的筛选浓度维持在600μg/ml。10～14d后，G418抗性克隆形成，分离并扩增各单克隆细胞，进行病毒滴度和FⅧ活性的检测，并采用RT-PCR检测各克隆中FⅧBD cDNA的转录。
4 病毒滴度的检测 采用NIH3T3细胞感染法。收集各抗G418的PA317细胞克隆的48h培养上清，作100,1000,10000倍稀释。分别滴加1ml含8μg/ml的聚凝胺(购自 Sigma公司)的病毒稀释液于六孔板中60%～80%融合的NIH3T3细胞表面，37℃，体积分数为5%的CO2培养2.5h后，更换含维持浓度300μg/ml的G418的选择性培养基进行筛选。2周后，G418抗性克隆形成。抗性克隆数目和病毒液稀释倍数的乘积即为病毒的滴度。
, 百拇医药
5 感染靶细胞 选择产病毒滴度最高的单克隆PA317细胞，收集其24h培养上清，5倍稀释后感染靶细胞NIH3T3、CHO、COS-7和L-02，感染方法同上。CHO细胞的G418筛选浓度为400μg/ml，其他3种细胞为300μg/ml。2周后抗性克隆形成，分离并扩增各单克隆，检测人FⅧ表达的活性和抗原含量以及人FⅧBDcDNA的转录。重组逆转录表达载体pLNC-FⅧBD在靶细胞中的活性或抗原均以每24h内每毫升中106细胞表达的结果表示。
6 人FⅧ活性(FⅧ∶C)和抗原(FⅧ∶Ag)含量测定 FⅧ∶C检测采用一期法，在ST4血液凝固仪上完成(乏FⅧ血浆购自Diagnostic Stago公司)。FⅧ∶Ag采用ELISA法检测(由中国科学院生物化学研究所协助完成)。标准品用含血清的细胞培养基稀释后作标准曲线。
7 人FⅧBD cDNA的转录 采用TRIzol(购自Gibco-BRL公司)抽提细胞总RNA。RT-PCR检测FⅧBD cDNA转录的mRNA(试剂盒购自Gibco公司)。设计一对FⅧBD cDNA特异的引物,上游引物序列为5′-CCAACATGATGGCATGGAAG-3′,下游引物序列为5′-CGAGGACTAAGGGAGCATAG-3′, 扩增片段为250bp。逆转录条件为70℃变性10min，42℃反应50min。PCR扩增条件为95℃30s，58℃ 30s，72℃ 30s，30个循环后，电泳观察结果。
, 百拇医药
结果
1 重组逆转录表达载体pLNC-FⅧBD的构建 构建的pLNC-FⅧBD全长11.2 kb。根据酶切图谱，采用ClaⅠ和BglⅡ分别酶切载体和目的基因片段上相应的单克隆位点，鉴定重组载体拼接方向正确与否。正向拼接时，双酶切后应得到2.9kb和8.3kb两条片段。经酶切和测序均证实重组载体构建正确(图1)(测序结果未显示)。
M：分子量标记λDNA/HindⅢ;1：CalⅠ单酶切pLNC-FⅧBD,得到11.2kb单一片段;
2：CalⅠ和BglⅡ双酶切pLNC-FⅧBD, 得到2.9kb和8.3kb两条片段;
3：CalⅠ单酶切空载体pLNCX, 得到6.6kb单一片段
, 百拇医药
图1 重组逆转录表达载体pLNCFⅧBD的酶切鉴定
2 病毒的包装和滴度的测定 pLNC-FⅧBD转染PA317细胞后，48个G418抗性克隆培养上清中13个的FⅧ∶C较未转染的PA317细胞提高10倍以上(>0.01U), 最高的达到0.24U。NIH3T3感染后形成的G418抗性克隆数目显示这些阳性克隆的病毒滴度为104～105cfu/ml，最高达到5×105cfu/ml。
3 靶细胞中人FⅧ的表达 pLNC-FⅧBD在NIH3T3、CHO、COS-7和L-02细胞中有不同程度的表达(表1)。其中以NIH3T3细胞的表达量最高。CHO细胞表达次之，COS-7和L-02细胞表达FⅧ较低。FⅧ∶C和FⅧ∶Ag检测具有良好的一致性。
表1 重组逆转录表达载体pLNC-FⅧBD
, 百拇医药
在4种靶细胞中的表达 靶细胞
FⅧ∶C(U)
FⅧ∶Ag(ng)
NIH3T3
1.600
500.0
CHO
0.120
62.4
COS-7
0.018
4.8
, 百拇医药 L-02
0.011
3.6
注：以正常人混合血浆的FⅧ∶C为1U/ml，FⅧ∶Ag为200ng/ml
4 FⅧBD cDNA的转录 在所有48个转染后具有G418抗性的PA317克隆中，13个阳性克隆(FⅧ∶C活性大于0.01U)均扩增出预期的250bp大小的片段，而在35个阴性克隆(FⅧ∶C小于0.01U)中也有2个克隆扩增出特异的250bp条带。感染后的NIH3T3、CHO、COS-7和L-02各单克隆细胞也都扩增出期望的特异条带(图2)。
M：DL2000分子量标记；1,3,5,7,9：分别为转染或感染后的PA317,NIH3T3,CHO,COS-7和L-02细胞；2,4,6,8,10：分别为未转染或
, 百拇医药
未感染的PA317,NIH3T3,CHO,COS-7和L-02细胞
图2 RT-PCR检测PA317和靶细胞中FⅧBD cDNA的转录
讨论
虽然早在1984年，人FⅧcDNA克隆就已成功并在体外获得低水平表达[1]，但至目前为止，FⅧ的体内外表达效率还很低。建立一个能够实现FⅧ高效稳定表达的表达体系涉及到载体-FⅧ基因-靶细胞三者之间的相互匹配。
由于逆转录病毒载体可以稳定地整合到靶细胞的染色体上，有利于实现目的基因的高效、稳定表达。我们构建了一重组逆转录表达载体，观察其介导人FⅧ基因转移和表达的效率。RT-PCR、FⅧ∶C及FⅧ∶Ag的检测结果表明，pLNC-FⅧBD可以很好地介导FⅧ在包装细胞和多种靶细胞中的基因转移和表达，尤其是在NIH3T3细胞中表达很高，达到了500ng, 远远高于以往采用质粒载体在相同细胞以及肿瘤细胞中的表达[2]，也高于其他研究小组的结果[3,4]。
, 百拇医药
研究证实，B区缺失的FⅧcDNA不仅可以产生与野生型FⅧ活性相同的FⅧ，而且其表达效率是全长FⅧ cDNA的5～10倍。我们采用的FⅧcDNA缺失了760aa～1639aa的编码序列，但保留了影响FⅧ活性的1648位精氨酸等重要位点[5]。转染后，细胞上清液中检测到较高的FⅧ∶C，且FⅧ∶C和FⅧ∶Ag之间具有良好的一致性。
适宜的靶细胞也是提高表达效率的重要因素之一。我们选择了4种不同类型的细胞株作为靶细胞。其中pLNC-FⅧBD在CHO和COS-7细胞中的表达分别为62.4和24.0ng，与其他作者的报道相近。pLNC-FⅧBD在NIH3T3细胞的表达效率最高，达到500ng，这可能与成纤维细胞分裂生长旺盛，易于感染有关。由于成纤维细胞属于已分化细胞，大多数外源基因都能得到很好的表达。而且易于取材和体外培养、植入体内和移出体外的优点。因此，成纤维细胞是基因治疗较为理想的靶细胞之一。
基金项目：上海市新药发展基金资助项目(975419001)；上海血液学研究所胡应洲基金资助项目
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1，Gitschier J, Wood WI, Goralka TM, et al. Characterization of human factor Ⅷ gene. Nature, 1984,312:326-330.
2，诸江，王鸿利，于立志，等. 人凝血因子Ⅷ cDNA体外真核表达的初步研究.中华血液学杂志，1998,19:464-466.
3，Chen C,Fang XD, ZHU J, et al. The gene expression of coagulation factor Ⅷ in mammalian cell lines. Thromb Res,1999,95:105-115.
4，卢健，姜志龙，陈诗书. 人FⅧ基因高效表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达.中华血液学杂志，1998,19:129-132.
5，Chiang GG, Rubin HL, Cherington V, et al. Bone marrow stromal cell-mediated gene therapy for hemophilia A: in vitro expression of human factor Ⅷ with high biological activity requires the inclusion of the proteolytic site at amino acid 1648. Human gene therapy, 1999, 10: 61-76.
(收稿日期：1999-11-08), http://www.100md.com
单位：郭雪梅 王鸿利 储海燕 王学锋 璩斌 李志广 王振义(200025 上海第二医科大学附属瑞金医院、上海血液学研究所)；戚正武(中国科学院上海生物化学研究所)
关键词：载体，病毒；血液凝固因子Ⅷ；基因表达
中华血液学杂志000902
【摘要】 目的 建立逆转录病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ(FⅧ)体外高效表达体系。方法 将一B区缺失(760aa～1639aa)的人FⅧ cDNA(FⅧBD cDNA)克隆至逆转录病毒载体pLNCX，构建了重组表达载体pLNC-FⅧBD。经PA317细胞包装后，感染多种靶细胞。分别采用一期法、ELISA法和RT-PCR检测细胞培养上清中人FⅧ的凝血活性(FⅧ∶C)和抗原含量(FⅧ∶Ag)以及细胞中FⅧBD cDNA的转录。结果 pLNC-FⅧBD在4种靶细胞中以NIH3T3细胞的表达最高，在24 h内每毫升中106细胞表达FⅧ∶C为1.6U，FⅧ∶Ag为500ng。结论 逆转录病毒载体能够介导人FⅧ的体外高效表达，为血友病A的基因治疗奠定了基础。
, 百拇医药
Retroviral-mediated high efficient in vitro expression of human coagulation factor Ⅷ
GUO Xuemei WANG Hongli CHU haiyan
(Shanghai Institute of Hematology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China)
【Abstract】 Objective To develop a retroviral-mediated high efficient expression system of human coagulation factor Ⅷ. Methods The retroviral vector LNC-ⅧBD was generated by cloning a B-domain-deleted FⅧ cDNA (760aa～1639aa) into retroviral vector pLNCX. Several cell lines including NIH3T3, CHO, COS-7 and human hepatic cell line L-02 were infected with viral supernatant from the highest productive PA317 clones. The antigen and procoagulant activity of human FⅧ in the cell culture medium were measured by ELISA assay and one-stage method, respectively. RT-PCR was performed for the detection of FⅧBD mRNA. Results Human FⅧ was expressed in all four target cells. The highest expression was observed in NIH3T3, the procoagulant activity of secreted FⅧ was up to 1.6U, and the FⅧ antigen was 500ng by 106 cells/ml in 24 hours,respectively. Conclusion The constructed retroviral vector was able to generate high level expression of human FⅧ in some cell lines, and it might have potential utility in the gene therapy for Hemophilia A.
, 百拇医药
【Key words】 Vector，retroviral； Blood coagulation factor Ⅷ； Gene expression
血友病A( HA)是临床常见的X染色体连锁的遗传性出血性疾病，患者因为基因缺陷导致血浆凝血因子Ⅷ(FⅧ)缺乏或活性下降。基因治疗是根治HA的理想模式之一。逆转录病毒载体可以稳定整合至宿主细胞的染色体，有利于实现目的基因的长期稳定表达。为了探讨逆转录病毒载体用于HA基因治疗的可能性，我们构建了重组人FⅧ逆转录表达载体，并观察其在体外不同靶细胞中的表达。
材料和方法
1 重组逆转录表达载体pLNC-FⅧBD的构建 B区大部分缺失(760aa～1639aa)的FⅧ cDNA克隆(FⅧBDcDNA)由中国科学院生物化学研究所戚正武院士惠赠，逆转录病毒载体pLNCX购自Clontech公司。采用SalⅠ和XhoⅠ酶切pGRE5.2/EBV-FⅧBD(本室构建)，得到长4.6kb的FⅧBD cDNA, 将此片段克隆至pLNCX的HpaⅠ位点，构建pLNC-FⅧBD。
, 百拇医药
2 细胞株和细胞培养 PA317、CHO、COS-7和NIH3T3细胞为本所冻存的细胞株。正常成人肝细胞株L-02购自中国科学院细胞库。细胞培养条件为含体积分数为10%的新生牛血清(Hyclone)的DMEM(购自Gibco-BRL公司)，37℃，体积分数为5%的CO2。
3 重组逆转录病毒的包装和克隆筛选 采用脂质体(LipofactaMINE,购自 Gibco-BRL公司)介导pLNC-FⅧBD转染包装细胞PA317，具体操作参照产品手册。转染后5h更换新鲜培养液。48h后，1∶4传代细胞，更换含G418(购自Amresco公司)的选择性培养基进行筛选，G418的筛选浓度维持在600μg/ml。10～14d后，G418抗性克隆形成，分离并扩增各单克隆细胞，进行病毒滴度和FⅧ活性的检测，并采用RT-PCR检测各克隆中FⅧBD cDNA的转录。
4 病毒滴度的检测 采用NIH3T3细胞感染法。收集各抗G418的PA317细胞克隆的48h培养上清，作100,1000,10000倍稀释。分别滴加1ml含8μg/ml的聚凝胺(购自 Sigma公司)的病毒稀释液于六孔板中60%～80%融合的NIH3T3细胞表面，37℃，体积分数为5%的CO2培养2.5h后，更换含维持浓度300μg/ml的G418的选择性培养基进行筛选。2周后，G418抗性克隆形成。抗性克隆数目和病毒液稀释倍数的乘积即为病毒的滴度。
, 百拇医药
5 感染靶细胞 选择产病毒滴度最高的单克隆PA317细胞，收集其24h培养上清，5倍稀释后感染靶细胞NIH3T3、CHO、COS-7和L-02，感染方法同上。CHO细胞的G418筛选浓度为400μg/ml，其他3种细胞为300μg/ml。2周后抗性克隆形成，分离并扩增各单克隆，检测人FⅧ表达的活性和抗原含量以及人FⅧBDcDNA的转录。重组逆转录表达载体pLNC-FⅧBD在靶细胞中的活性或抗原均以每24h内每毫升中106细胞表达的结果表示。
6 人FⅧ活性(FⅧ∶C)和抗原(FⅧ∶Ag)含量测定 FⅧ∶C检测采用一期法，在ST4血液凝固仪上完成(乏FⅧ血浆购自Diagnostic Stago公司)。FⅧ∶Ag采用ELISA法检测(由中国科学院生物化学研究所协助完成)。标准品用含血清的细胞培养基稀释后作标准曲线。
7 人FⅧBD cDNA的转录 采用TRIzol(购自Gibco-BRL公司)抽提细胞总RNA。RT-PCR检测FⅧBD cDNA转录的mRNA(试剂盒购自Gibco公司)。设计一对FⅧBD cDNA特异的引物,上游引物序列为5′-CCAACATGATGGCATGGAAG-3′,下游引物序列为5′-CGAGGACTAAGGGAGCATAG-3′, 扩增片段为250bp。逆转录条件为70℃变性10min，42℃反应50min。PCR扩增条件为95℃30s，58℃ 30s，72℃ 30s，30个循环后，电泳观察结果。
, 百拇医药
结果
1 重组逆转录表达载体pLNC-FⅧBD的构建 构建的pLNC-FⅧBD全长11.2 kb。根据酶切图谱，采用ClaⅠ和BglⅡ分别酶切载体和目的基因片段上相应的单克隆位点，鉴定重组载体拼接方向正确与否。正向拼接时，双酶切后应得到2.9kb和8.3kb两条片段。经酶切和测序均证实重组载体构建正确(图1)(测序结果未显示)。
M：分子量标记λDNA/HindⅢ;1：CalⅠ单酶切pLNC-FⅧBD,得到11.2kb单一片段;
2：CalⅠ和BglⅡ双酶切pLNC-FⅧBD, 得到2.9kb和8.3kb两条片段;
3：CalⅠ单酶切空载体pLNCX, 得到6.6kb单一片段
, 百拇医药
图1 重组逆转录表达载体pLNCFⅧBD的酶切鉴定
2 病毒的包装和滴度的测定 pLNC-FⅧBD转染PA317细胞后，48个G418抗性克隆培养上清中13个的FⅧ∶C较未转染的PA317细胞提高10倍以上(>0.01U), 最高的达到0.24U。NIH3T3感染后形成的G418抗性克隆数目显示这些阳性克隆的病毒滴度为104～105cfu/ml，最高达到5×105cfu/ml。
3 靶细胞中人FⅧ的表达 pLNC-FⅧBD在NIH3T3、CHO、COS-7和L-02细胞中有不同程度的表达(表1)。其中以NIH3T3细胞的表达量最高。CHO细胞表达次之，COS-7和L-02细胞表达FⅧ较低。FⅧ∶C和FⅧ∶Ag检测具有良好的一致性。
表1 重组逆转录表达载体pLNC-FⅧBD
, 百拇医药
在4种靶细胞中的表达 靶细胞
FⅧ∶C(U)
FⅧ∶Ag(ng)
NIH3T3
1.600
500.0
CHO
0.120
62.4
COS-7
0.018
4.8
, 百拇医药 L-02
0.011
3.6
注：以正常人混合血浆的FⅧ∶C为1U/ml，FⅧ∶Ag为200ng/ml
4 FⅧBD cDNA的转录 在所有48个转染后具有G418抗性的PA317克隆中，13个阳性克隆(FⅧ∶C活性大于0.01U)均扩增出预期的250bp大小的片段，而在35个阴性克隆(FⅧ∶C小于0.01U)中也有2个克隆扩增出特异的250bp条带。感染后的NIH3T3、CHO、COS-7和L-02各单克隆细胞也都扩增出期望的特异条带(图2)。
M：DL2000分子量标记；1,3,5,7,9：分别为转染或感染后的PA317,NIH3T3,CHO,COS-7和L-02细胞；2,4,6,8,10：分别为未转染或
, 百拇医药
未感染的PA317,NIH3T3,CHO,COS-7和L-02细胞
图2 RT-PCR检测PA317和靶细胞中FⅧBD cDNA的转录
讨论
虽然早在1984年，人FⅧcDNA克隆就已成功并在体外获得低水平表达[1]，但至目前为止，FⅧ的体内外表达效率还很低。建立一个能够实现FⅧ高效稳定表达的表达体系涉及到载体-FⅧ基因-靶细胞三者之间的相互匹配。
由于逆转录病毒载体可以稳定地整合到靶细胞的染色体上，有利于实现目的基因的高效、稳定表达。我们构建了一重组逆转录表达载体，观察其介导人FⅧ基因转移和表达的效率。RT-PCR、FⅧ∶C及FⅧ∶Ag的检测结果表明，pLNC-FⅧBD可以很好地介导FⅧ在包装细胞和多种靶细胞中的基因转移和表达，尤其是在NIH3T3细胞中表达很高，达到了500ng, 远远高于以往采用质粒载体在相同细胞以及肿瘤细胞中的表达[2]，也高于其他研究小组的结果[3,4]。
, 百拇医药
研究证实，B区缺失的FⅧcDNA不仅可以产生与野生型FⅧ活性相同的FⅧ，而且其表达效率是全长FⅧ cDNA的5～10倍。我们采用的FⅧcDNA缺失了760aa～1639aa的编码序列，但保留了影响FⅧ活性的1648位精氨酸等重要位点[5]。转染后，细胞上清液中检测到较高的FⅧ∶C，且FⅧ∶C和FⅧ∶Ag之间具有良好的一致性。
适宜的靶细胞也是提高表达效率的重要因素之一。我们选择了4种不同类型的细胞株作为靶细胞。其中pLNC-FⅧBD在CHO和COS-7细胞中的表达分别为62.4和24.0ng，与其他作者的报道相近。pLNC-FⅧBD在NIH3T3细胞的表达效率最高，达到500ng，这可能与成纤维细胞分裂生长旺盛，易于感染有关。由于成纤维细胞属于已分化细胞，大多数外源基因都能得到很好的表达。而且易于取材和体外培养、植入体内和移出体外的优点。因此，成纤维细胞是基因治疗较为理想的靶细胞之一。
基金项目：上海市新药发展基金资助项目(975419001)；上海血液学研究所胡应洲基金资助项目
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1，Gitschier J, Wood WI, Goralka TM, et al. Characterization of human factor Ⅷ gene. Nature, 1984,312:326-330.
2，诸江，王鸿利，于立志，等. 人凝血因子Ⅷ cDNA体外真核表达的初步研究.中华血液学杂志，1998,19:464-466.
3，Chen C,Fang XD, ZHU J, et al. The gene expression of coagulation factor Ⅷ in mammalian cell lines. Thromb Res,1999,95:105-115.
4，卢健，姜志龙，陈诗书. 人FⅧ基因高效表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达.中华血液学杂志，1998,19:129-132.
5，Chiang GG, Rubin HL, Cherington V, et al. Bone marrow stromal cell-mediated gene therapy for hemophilia A: in vitro expression of human factor Ⅷ with high biological activity requires the inclusion of the proteolytic site at amino acid 1648. Human gene therapy, 1999, 10: 61-76.
(收稿日期：1999-11-08), http://www.100md.com