流式细胞术检测网织血小板
作者：向晓娟 邓承祺 牛挺 雷松 孟文彤
单位：向晓娟(325000 温州医学院附属第一医院血液内科)；邓承祺 牛挺 雷松 孟文彤(华西医科大学附一院血液内科)
关键词：
中华血液学杂志000923 网织血小板(Reticulated platelets, RPs)是新释放入血循环中的血小板，在失血或血小板破坏增多的情况下，RPs百分率明显增高[1]。我们建立了流式细胞术检测RPs的方法，并观察RPs是否可作为分析血小板减少性疾病发病机制及预测血小板数恢复状况的指标。
材料和方法
1 试剂 噻唑橙(TO，BD公司产品)；CD41-FITC单克隆抗体(Coulter公司产品)；RNAase (Boerhinger Mannhein公司产品)；GPⅢa单克隆抗体(SZ-21，苏州医学院产品)；ABC试剂盒(Vector公司产品)；IMDM培养液(Gibco公司产品)。
, 百拇医药
2 网织血小板的测定方法[1] 采静脉血，以20g/L EDTA-Na2抗凝，制成100×109/L的血小板悬液。取50μl悬液与450μlTO混匀，避光孵育1h，另取一份加入PBS作为空白对照。流式细胞仪测定荧光强度，吸收光波长488nm，激发光波长为530nm，测得直方图。按空白对照设置标尺，使TO阳性血小板为1%，同一标尺用于TO染色的病例标本，结果以百分率表示RPs。RPs百分率与血小板计数(BPC)相乘，得RPs绝对计数。
3 CD41-FITC单抗标记血小板 取50μl血小板悬液(20×109/L)，与10μlCD41单抗混匀，4℃避光孵育25min。流式细胞仪检测，确定血小板群体位置，在CD41阳性细胞集中分布周围设置门，保证门内至少95%的细胞为血小板。
4 RNAase处理血小板 血小板悬液中加入体积分数为0.5%Triton X-100，洗涤后加入50μg/ml RNAase，静置2h，流式细胞仪检测RPs的百分率，与未加RNAase处理时所测得的RPs百分率相比较。确定所测的血小板确为RPs。
, 百拇医药
5 检测对象 对照组为正常健康人64名，血小板计数在(100～300)×109/L之间；患者组为慢性特发性血小板减少性紫癜(CITP)47例，急性白血病(AL)20例，再生障碍性贫血(AA)23例，血管内弥慢性凝血(DIC)5例。
结果
1 RNAase处理血小板结果 正常组4人和CITP组8例未加RNAase处理时，测得RPs百分率分别为(6.13±1.12)%、(37.2±13.14)%，处理后分别降至(4.88±0.91)%和(5.19±0.92)%。表明TO阳性血小板确为含较多RNA的网织血小板。
2 正常对照组的BPC、RPs百分率和RPs绝对计数结果分别为(154.31±39.93)×109/L、(5.83±1.81)%、(8.70±2.60)109/L。男、女相比，BPC、RPs百分率、RPs绝对数差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
3 各血小板减少性疾病患者组的BPC、RPs百分率和RPs绝对计数 结果见表1。
表1 各组病例的BPC、RPs%和RPs绝对计数(
±s) 组别
例数
BPC
(×109/L)
RPs
(%)
RPs绝对数
(×109/L)
正常组
, 百拇医药
64
154.31±39.95
5.83±1.81
8.70±2.60
CITP
47
25.30±17.72*
29.31±16.30*
6.33±4.50*
DIC
5
, http://www.100md.com
25.00±19.35*
30.50±11.76*
8.98±7.63
AL
20
31.15±18.43*
8.61±3.07*
2.45±1.42*
AA
23
26.70±17.21*
, 百拇医药
6.63±2.89
1.67±1.38*
注：与正常组相比较，*P<0.001
4 8例血小板减少患者治疗中的动态观察 结果发现，6例治疗有效者中5例在BPC升高前先出现RPs百分率升高达峰值，此后随BPC上升RPs百分率逐渐下降。2例治疗无效者未观察到RPs百分率有明显变化。
讨论
我们采用CD41单抗来确定血小板群体时加用RNAase处理，结果显示，所有标本经处理后RPs百分率均明显降低，表明我们所测定的TO阳性血小板确为含较多RNA的RPs。1995年Richards用TO染色测得的RPs百分率正常范围为5%～10%，我们测得RPs百分率正常值为(5.83±1.81)%，与Richards报道一致。
, 百拇医药
CITP是因免疫性血小板破坏增加所致的血小板减少性疾病。我们测定47例CITP患者的RPs百分率高于正常对照组5倍，表明，在血小板破坏增加的情况下，RPs百分率是反映骨髓血小板生成活性的一项有用指标。
我们认为RPs百分率与RPs绝对数，能反映骨髓血小板生成率，可作为鉴别生成障碍还是破坏过多引起血小板减少的指标之一。而且，RPs百分率可作为血小板数恢复状况的预测指标。
参 考 文 献
1，Richards EM, Baglin TP. Quantitation of reticulatecl platelets: methodology and clinical application. Br J Haematol,1995;91:445-451.
(收稿日期：1999-07-15), 百拇医药
单位：向晓娟(325000 温州医学院附属第一医院血液内科)；邓承祺 牛挺 雷松 孟文彤(华西医科大学附一院血液内科)
关键词：
中华血液学杂志000923 网织血小板(Reticulated platelets, RPs)是新释放入血循环中的血小板，在失血或血小板破坏增多的情况下，RPs百分率明显增高[1]。我们建立了流式细胞术检测RPs的方法，并观察RPs是否可作为分析血小板减少性疾病发病机制及预测血小板数恢复状况的指标。
材料和方法
1 试剂 噻唑橙(TO，BD公司产品)；CD41-FITC单克隆抗体(Coulter公司产品)；RNAase (Boerhinger Mannhein公司产品)；GPⅢa单克隆抗体(SZ-21，苏州医学院产品)；ABC试剂盒(Vector公司产品)；IMDM培养液(Gibco公司产品)。
, 百拇医药
2 网织血小板的测定方法[1] 采静脉血，以20g/L EDTA-Na2抗凝，制成100×109/L的血小板悬液。取50μl悬液与450μlTO混匀，避光孵育1h，另取一份加入PBS作为空白对照。流式细胞仪测定荧光强度，吸收光波长488nm，激发光波长为530nm，测得直方图。按空白对照设置标尺，使TO阳性血小板为1%，同一标尺用于TO染色的病例标本，结果以百分率表示RPs。RPs百分率与血小板计数(BPC)相乘，得RPs绝对计数。
3 CD41-FITC单抗标记血小板 取50μl血小板悬液(20×109/L)，与10μlCD41单抗混匀，4℃避光孵育25min。流式细胞仪检测，确定血小板群体位置，在CD41阳性细胞集中分布周围设置门，保证门内至少95%的细胞为血小板。
4 RNAase处理血小板 血小板悬液中加入体积分数为0.5%Triton X-100，洗涤后加入50μg/ml RNAase，静置2h，流式细胞仪检测RPs的百分率，与未加RNAase处理时所测得的RPs百分率相比较。确定所测的血小板确为RPs。
, 百拇医药
5 检测对象 对照组为正常健康人64名，血小板计数在(100～300)×109/L之间；患者组为慢性特发性血小板减少性紫癜(CITP)47例，急性白血病(AL)20例，再生障碍性贫血(AA)23例，血管内弥慢性凝血(DIC)5例。
结果
1 RNAase处理血小板结果 正常组4人和CITP组8例未加RNAase处理时，测得RPs百分率分别为(6.13±1.12)%、(37.2±13.14)%，处理后分别降至(4.88±0.91)%和(5.19±0.92)%。表明TO阳性血小板确为含较多RNA的网织血小板。
2 正常对照组的BPC、RPs百分率和RPs绝对计数结果分别为(154.31±39.93)×109/L、(5.83±1.81)%、(8.70±2.60)109/L。男、女相比，BPC、RPs百分率、RPs绝对数差异无显著性(P>0.05)。
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3 各血小板减少性疾病患者组的BPC、RPs百分率和RPs绝对计数 结果见表1。
表1 各组病例的BPC、RPs%和RPs绝对计数(
±s) 组别例数
BPC
(×109/L)
RPs
(%)
RPs绝对数
(×109/L)
正常组
, 百拇医药
64
154.31±39.95
5.83±1.81
8.70±2.60
CITP
47
25.30±17.72*
29.31±16.30*
6.33±4.50*
DIC
5
, http://www.100md.com
25.00±19.35*
30.50±11.76*
8.98±7.63
AL
20
31.15±18.43*
8.61±3.07*
2.45±1.42*
AA
23
26.70±17.21*
, 百拇医药
6.63±2.89
1.67±1.38*
注：与正常组相比较，*P<0.001
4 8例血小板减少患者治疗中的动态观察 结果发现，6例治疗有效者中5例在BPC升高前先出现RPs百分率升高达峰值，此后随BPC上升RPs百分率逐渐下降。2例治疗无效者未观察到RPs百分率有明显变化。
讨论
我们采用CD41单抗来确定血小板群体时加用RNAase处理，结果显示，所有标本经处理后RPs百分率均明显降低，表明我们所测定的TO阳性血小板确为含较多RNA的RPs。1995年Richards用TO染色测得的RPs百分率正常范围为5%～10%，我们测得RPs百分率正常值为(5.83±1.81)%，与Richards报道一致。
, 百拇医药
CITP是因免疫性血小板破坏增加所致的血小板减少性疾病。我们测定47例CITP患者的RPs百分率高于正常对照组5倍，表明，在血小板破坏增加的情况下，RPs百分率是反映骨髓血小板生成活性的一项有用指标。
我们认为RPs百分率与RPs绝对数，能反映骨髓血小板生成率，可作为鉴别生成障碍还是破坏过多引起血小板减少的指标之一。而且，RPs百分率可作为血小板数恢复状况的预测指标。
参 考 文 献
1，Richards EM, Baglin TP. Quantitation of reticulatecl platelets: methodology and clinical application. Br J Haematol,1995;91:445-451.
(收稿日期：1999-07-15), 百拇医药