细胞因子对类风湿关节炎病人滑膜细胞DNA合成和蛋白激酶的影响
作者：燕太强 吕厚山 药立波 孙铁铮
单位：燕太强(100044 北京医科大学人民医院关节病诊疗研究中心)；吕厚山(100044 北京医科大学人民医院关节病诊疗研究中心)；孙铁铮(100044 北京医科大学人民医院关节病诊疗研究中心)；药立波(西安第四军医大学生化及分子生物学教研室)
关键词：
中华医学杂志000928 类风湿关节炎(RA)的发病与关节液中异常增高的细胞因子密切相关，高水平的因子持续刺激滑膜细胞，引起细胞内蛋白激酶的持续激活和过度的信号传导，从而调控相关基因的过量表达。RA的关节液及滑膜组织中表皮生长因子(EGF)和肿瘤坏死因子(TNF)-α的含量明显高于骨性关节炎(OA)。但是，两者对RA滑膜细胞的作用及细胞内相关信号传导分子的活性变化尚少有报道。
一、材料和方法
, http://www.100md.com
1.材料：滑膜组织取自本院20例手术治疗的RA病人(均符合1987年美国风湿病协会诊断标准[1])。TNF-α(500万U/ml，第四军医大学惠赠)，EGF(300 μg/ml，北京经科生物制品公司)，3H-TdR(购于中国科学院原子能研究所)，去污剂相容性蛋白定量试剂盒(Bio-Rad)，ECL Western blot发光试剂(美国Amersham公司产品)，3种抗活化型MAPK多克隆抗体(美国Promega公司)，辣根过氧化物酶偶连驴或羊抗兔IgG。
2.方法：(1) RA滑膜细胞的体外培养：将滑膜组织剪成约1 mm3的碎块，置于无菌瓶内，胶原酶I消化后，过滤，离心。加入DMEM培养液，分装于培养瓶内，置于37℃体积分数为5% CO2孵箱内培养。滑膜成纤维细胞贴壁生长，待基本长满后，消化传代，实验用3～5代细胞。(2)3H-TdR掺入检测RA滑膜细胞中DNA的合成：滑膜细胞以每孔1×104种植于96孔板内，培养24 h后，用无血清的DMEM培养液静息24 h。然后换为实验培养液(对照及每个刺激因子浓度分别设4个复孔)，继续培养48 h。细胞收集前18 h加入1 μCi/L 3 H-TdR，培养结束后，加入胰蛋白酶消化液终止。将细胞收集于玻璃纤维滤膜上，测定每份样品每分钟脉冲数(cpm)。(3) 刺激因子刺激RA滑膜细胞后蛋白的收集：将3～5代的滑膜细胞种植于直径为60 mm的培养皿中，待细胞约90%长满时，静息24 h，10 U/ml TNF-α和10 ng/ml EGF分别刺激滑膜细胞5 min，预冷磷酸盐缓冲液冲洗3遍，加入单去污剂裂解液收集裂解的细胞，涡旋2次，置于冰盒中静止15 min，离心后将上清移至新EP管中。(4) Western blot分析：参照去污剂蛋白定量试剂盒的说明，首先绘制蛋白定量标准曲线。于分光光度计750 nm下，测定A值与蛋白浓度成直线相关。每条泳道上样25 μg蛋白，体积分数为30%的聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将凝胶中蛋白电转移至硝酸纤维素滤膜上，体积分数为5%脱脂奶粉封闭后分别加入一抗、二抗孵育、洗膜于暗室中加入ECL发光试剂约1 min，拍X线片，分析结果。
, 百拇医药
3.统计学方法：差异显著性检验采用方差分析及多样本均数间的Q检验。
二、结果
1.3H-TdR掺入检测RA滑膜细胞中DNA的合成：EGF 1 ng/ml刺激组和对照组及TNF-α刺激组cpm值差别有显著意义，P<0.05；EGF 10～1 000 ng/ml刺激组和其他两组比较差别有显著意义，P<0.01。TNF-α 0.01～1 000 U/ml的浓度刺激组和对照组比较差异无显著意义，P>0.05(图1)。
图1 3H-TdR掺入检测类风湿关节炎
滑膜细胞中DNA合成
2.活化型MAPK的检测：一抗为抗活化形式细胞外信号调节激酶(ERK)的多克隆抗体(1∶20 000)、二抗为辣根过氧化物酶偶连驴或羊抗兔IgG(1∶10 000)，确定相对分子质量为42 000的ERK明显活化。用洗脱液洗脱抗活化形式ERK的多克隆抗体，在同一张硝酸纤维素滤膜用抗非活化形式的ERK抗体(1∶100)进行检测，对照组和刺激组非活化ERK1和ERK2几乎完全相同，说明刺激组和对照组蛋白上样量的一致性。综合两图结果，说明滑膜细胞中ERK在EGF和TNF-α的作用下明显活化。同样检测JNK和P38的活化情况，抗活化形式的一抗C-JunN端激酶(JNK)，(1∶5 000)、P38(1∶2 000)多克隆抗体，结果表明JNK和P38均未见活化。
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三、讨论
RA滑膜中存在过量的细胞因子、受体和与其有同源性的癌基因产物，它们可能作用于滑膜细胞信号传导途径的不同部位，导致持续的信号传导，从而引起RA滑膜细胞的肿瘤样改变[2]。在滑膜组织中以自分泌和旁分泌的方式，大量表达EGF、TNF-α及其受体，EGF是强有力的促细胞分裂因子，TNF-α能诱导骨吸收及抑制蛋白多糖的合成，上调RA滑膜细胞分泌胶原酶、基质金属蛋白酶、环氧化酶、PGE2、细胞粘附分子和IL-1、IL-6、IL-8等[3]。我们应用体外培养RA滑膜细胞，加入外源性EGF和TNF-α刺激，观察对细胞增殖的影响，结果表明，EGF能显著诱导细胞的增殖，TNF-α对细胞的增殖无影响。但二者是否影响处于细胞内信号传导途径中重要中介位置的有丝分裂素激活的蛋白激酶(MAPK)的活性呢？MAPK负责将特异细胞外刺激信号诱发的蛋白激酶酪氨酸磷酸化转变为蛋白激酶丝氨酸/苏氨酸磷酸化，从而使信号向下游传导。ERK、JNK和P38都属于MAPK的亚型。ERK主要与细胞的增殖通路有关，而JNK和P38 在诱导细胞凋亡的信号传导途径中起作用。在未受刺激的细胞内，MAPK表现为脱磷酸型，只有当它的苏氨酸和酪氨酸残基都被磷酸化后，MAPK才被激活。3种亚型可以独立或同时被激活[4]。
, 百拇医药
既往检测MAPK的活化需要检测其对特异底物MAP-2(microtuble-associated protein 2)或MBP(myelin basic protein)的磷酸化情况，需同位素掺入和免疫沉淀等繁琐步骤[5]。而本实验所用最新出现的抗活化形式的抗体直接标记磷酸化的苏氨酸和酪氨酸残基，使实验步骤简单易行，并且避免了接触同位素。本实验表明EGF和TNF-α都能明显活化ERK，结合3H-TdR掺入的结果，我们推测EGF刺激后ERK通路的活化引起了滑膜细胞的增殖，TNF-α刺激后细胞中ERK的活化可能与促进滑膜细胞分泌炎性因子和炎性蛋白酶有关。ERK的活化在这两条通路中都起重要的作用。因本实验只是一个初步的研究，EGF 和TNF-α作用于RA滑膜细胞后引起MAPK激活的上、下游激酶及细胞内详细的信号传导途径尚需进一步实验证实。
基金项目：国家自然基金资助项目(39730430)
参考文献
, 百拇医药
1，Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 1988, 31: 315-324.
2，燕太强，吕厚山，药立波.类风湿关节炎滑膜细胞酪氨酸激酶信号传导系统.中华风湿病学杂志，1999，3：121-123.
3，陆华中，李崇渔，邹萍. TNF-α与TNF受体超家族介导的信号传导.国外医学分子生物学分册, 1997, 19: 105-109.
4，Cano E & Mahadevan LC. Parallel signal processing among mammalian mitogen-activated protein kinases. Trends Biochem Sci, 1995, 20: 117-122.
5，Dionne S, D'Agata ID, Ruemmele FM, et al. Tyrosine kinase and MAPK inhibition of TNF-α-and EGF-stimulated IEC-6 cell growth. Biochem Biophy Res Commun, 1998, 242: 146-150.
(收稿日期：1999-08-24), http://www.100md.com
单位：燕太强(100044 北京医科大学人民医院关节病诊疗研究中心)；吕厚山(100044 北京医科大学人民医院关节病诊疗研究中心)；孙铁铮(100044 北京医科大学人民医院关节病诊疗研究中心)；药立波(西安第四军医大学生化及分子生物学教研室)
关键词：
中华医学杂志000928 类风湿关节炎(RA)的发病与关节液中异常增高的细胞因子密切相关，高水平的因子持续刺激滑膜细胞，引起细胞内蛋白激酶的持续激活和过度的信号传导，从而调控相关基因的过量表达。RA的关节液及滑膜组织中表皮生长因子(EGF)和肿瘤坏死因子(TNF)-α的含量明显高于骨性关节炎(OA)。但是，两者对RA滑膜细胞的作用及细胞内相关信号传导分子的活性变化尚少有报道。
一、材料和方法
, http://www.100md.com
1.材料：滑膜组织取自本院20例手术治疗的RA病人(均符合1987年美国风湿病协会诊断标准[1])。TNF-α(500万U/ml，第四军医大学惠赠)，EGF(300 μg/ml，北京经科生物制品公司)，3H-TdR(购于中国科学院原子能研究所)，去污剂相容性蛋白定量试剂盒(Bio-Rad)，ECL Western blot发光试剂(美国Amersham公司产品)，3种抗活化型MAPK多克隆抗体(美国Promega公司)，辣根过氧化物酶偶连驴或羊抗兔IgG。
2.方法：(1) RA滑膜细胞的体外培养：将滑膜组织剪成约1 mm3的碎块，置于无菌瓶内，胶原酶I消化后，过滤，离心。加入DMEM培养液，分装于培养瓶内，置于37℃体积分数为5% CO2孵箱内培养。滑膜成纤维细胞贴壁生长，待基本长满后，消化传代，实验用3～5代细胞。(2)3H-TdR掺入检测RA滑膜细胞中DNA的合成：滑膜细胞以每孔1×104种植于96孔板内，培养24 h后，用无血清的DMEM培养液静息24 h。然后换为实验培养液(对照及每个刺激因子浓度分别设4个复孔)，继续培养48 h。细胞收集前18 h加入1 μCi/L 3 H-TdR，培养结束后，加入胰蛋白酶消化液终止。将细胞收集于玻璃纤维滤膜上，测定每份样品每分钟脉冲数(cpm)。(3) 刺激因子刺激RA滑膜细胞后蛋白的收集：将3～5代的滑膜细胞种植于直径为60 mm的培养皿中，待细胞约90%长满时，静息24 h，10 U/ml TNF-α和10 ng/ml EGF分别刺激滑膜细胞5 min，预冷磷酸盐缓冲液冲洗3遍，加入单去污剂裂解液收集裂解的细胞，涡旋2次，置于冰盒中静止15 min，离心后将上清移至新EP管中。(4) Western blot分析：参照去污剂蛋白定量试剂盒的说明，首先绘制蛋白定量标准曲线。于分光光度计750 nm下，测定A值与蛋白浓度成直线相关。每条泳道上样25 μg蛋白，体积分数为30%的聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将凝胶中蛋白电转移至硝酸纤维素滤膜上，体积分数为5%脱脂奶粉封闭后分别加入一抗、二抗孵育、洗膜于暗室中加入ECL发光试剂约1 min，拍X线片，分析结果。
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3.统计学方法：差异显著性检验采用方差分析及多样本均数间的Q检验。
二、结果
1.3H-TdR掺入检测RA滑膜细胞中DNA的合成：EGF 1 ng/ml刺激组和对照组及TNF-α刺激组cpm值差别有显著意义，P<0.05；EGF 10～1 000 ng/ml刺激组和其他两组比较差别有显著意义，P<0.01。TNF-α 0.01～1 000 U/ml的浓度刺激组和对照组比较差异无显著意义，P>0.05(图1)。
图1 3H-TdR掺入检测类风湿关节炎
滑膜细胞中DNA合成
2.活化型MAPK的检测：一抗为抗活化形式细胞外信号调节激酶(ERK)的多克隆抗体(1∶20 000)、二抗为辣根过氧化物酶偶连驴或羊抗兔IgG(1∶10 000)，确定相对分子质量为42 000的ERK明显活化。用洗脱液洗脱抗活化形式ERK的多克隆抗体，在同一张硝酸纤维素滤膜用抗非活化形式的ERK抗体(1∶100)进行检测，对照组和刺激组非活化ERK1和ERK2几乎完全相同，说明刺激组和对照组蛋白上样量的一致性。综合两图结果，说明滑膜细胞中ERK在EGF和TNF-α的作用下明显活化。同样检测JNK和P38的活化情况，抗活化形式的一抗C-JunN端激酶(JNK)，(1∶5 000)、P38(1∶2 000)多克隆抗体，结果表明JNK和P38均未见活化。
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三、讨论
RA滑膜中存在过量的细胞因子、受体和与其有同源性的癌基因产物，它们可能作用于滑膜细胞信号传导途径的不同部位，导致持续的信号传导，从而引起RA滑膜细胞的肿瘤样改变[2]。在滑膜组织中以自分泌和旁分泌的方式，大量表达EGF、TNF-α及其受体，EGF是强有力的促细胞分裂因子，TNF-α能诱导骨吸收及抑制蛋白多糖的合成，上调RA滑膜细胞分泌胶原酶、基质金属蛋白酶、环氧化酶、PGE2、细胞粘附分子和IL-1、IL-6、IL-8等[3]。我们应用体外培养RA滑膜细胞，加入外源性EGF和TNF-α刺激，观察对细胞增殖的影响，结果表明，EGF能显著诱导细胞的增殖，TNF-α对细胞的增殖无影响。但二者是否影响处于细胞内信号传导途径中重要中介位置的有丝分裂素激活的蛋白激酶(MAPK)的活性呢？MAPK负责将特异细胞外刺激信号诱发的蛋白激酶酪氨酸磷酸化转变为蛋白激酶丝氨酸/苏氨酸磷酸化，从而使信号向下游传导。ERK、JNK和P38都属于MAPK的亚型。ERK主要与细胞的增殖通路有关，而JNK和P38 在诱导细胞凋亡的信号传导途径中起作用。在未受刺激的细胞内，MAPK表现为脱磷酸型，只有当它的苏氨酸和酪氨酸残基都被磷酸化后，MAPK才被激活。3种亚型可以独立或同时被激活[4]。
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既往检测MAPK的活化需要检测其对特异底物MAP-2(microtuble-associated protein 2)或MBP(myelin basic protein)的磷酸化情况，需同位素掺入和免疫沉淀等繁琐步骤[5]。而本实验所用最新出现的抗活化形式的抗体直接标记磷酸化的苏氨酸和酪氨酸残基，使实验步骤简单易行，并且避免了接触同位素。本实验表明EGF和TNF-α都能明显活化ERK，结合3H-TdR掺入的结果，我们推测EGF刺激后ERK通路的活化引起了滑膜细胞的增殖，TNF-α刺激后细胞中ERK的活化可能与促进滑膜细胞分泌炎性因子和炎性蛋白酶有关。ERK的活化在这两条通路中都起重要的作用。因本实验只是一个初步的研究，EGF 和TNF-α作用于RA滑膜细胞后引起MAPK激活的上、下游激酶及细胞内详细的信号传导途径尚需进一步实验证实。
基金项目：国家自然基金资助项目(39730430)
参考文献
, 百拇医药
1，Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 1988, 31: 315-324.
2，燕太强，吕厚山，药立波.类风湿关节炎滑膜细胞酪氨酸激酶信号传导系统.中华风湿病学杂志，1999，3：121-123.
3，陆华中，李崇渔，邹萍. TNF-α与TNF受体超家族介导的信号传导.国外医学分子生物学分册, 1997, 19: 105-109.
4，Cano E & Mahadevan LC. Parallel signal processing among mammalian mitogen-activated protein kinases. Trends Biochem Sci, 1995, 20: 117-122.
5，Dionne S, D'Agata ID, Ruemmele FM, et al. Tyrosine kinase and MAPK inhibition of TNF-α-and EGF-stimulated IEC-6 cell growth. Biochem Biophy Res Commun, 1998, 242: 146-150.
(收稿日期：1999-08-24), http://www.100md.com