急性心肌梗死患者外周血淋巴细胞凋亡及免疫功能变化的研究
作者：孙勇 李景兰 孙文英 王天群 张永春 于汉力(指导)
单位：哈尔滨医科大学附属 第二医院，150086
关键词：
中国急救医学000923 细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡，是英国病理学家kerr等于1972年最早提出的。 近些年来随着分子生物学技术的发展，其重要意义越来越受到重视，我们测定了急性心肌梗 死患者不同病期PBL凋亡的变化，并探讨其临床意义。
1 材料与方法
1.1 对象 AMI患者8例，男女各4例，均为我院1999年5～8月住院患者。年龄60～90岁，平均67.7岁 。冠心病心绞痛(AG)对照组8例，男5例，女3例，年龄60～80岁，平均65.9岁。健康老年对 照组8例，男女各4例，年龄60～83岁，平均66.5岁。
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1.2 方法
1.2.1 淋巴细胞凋亡的测定
PBL分离：抽取肝素抗凝外周静脉血4 ml,留1 ml静脉血用于免疫功能测定，余下3 ml静脉血 ，以淋巴细胞分离液分离PBL，弃上清液，振摇成悬浊液。
淋巴细胞凋亡的流式细胞仪测定分析：①准备缓冲液。a.每份样品含105～106个 细胞，准备100μl Annexin V孵育试剂。b.准备500 ul粘合缓冲液。②搜集细胞。在室温( 18℃～24℃)下，以约1 000转/分离心5～10分钟，去上清液。③将细胞重新悬浮在500 μl 冷(2 ℃～8℃)lxPBS中，然后按上述方法离心形成细胞团。④轻轻将细胞重新悬浮于Annexin V孵 育 试剂中，浓度为105～106/100 μl，在室温(18℃～24℃)下，于黑暗处孵育15分 钟 。⑤应用FACSCalibur流式细胞仪(美国B-D公司产品)，于1小时内测定最大信号，分析结果 。⑥统计学方法为两个样本均数的t检验。
, 百拇医药
1.2.2 免疫功能的测定
试剂：IgG1 FITC/IgG1 PE/IgG1 PE-CY5三色荧光抗体，CD4+-FITC/CD8+-PE/CD3+PE-CY5三色荧光抗体，为美国Coulter公司产品。
仪器：FACSCalibur流式细胞仪，美国B-D公司产品。
应用Cellquest软件分析，以IgG1 FITC/IgG1 PE/IgG1 PE-CY5为阴性对照管，以CD8+/CD3+双阳性细胞为抑制性T淋巴细胞(Ts细胞)，以CD4+/CD3+双 阳性细胞为辅助性T淋巴细胞(Th细胞)。
, 百拇医药
统计学方法：两个均数的t检验。
2 结果
2.1 AMI组患者出现淋巴细胞凋亡，于第3天明显高于正常对照组及AG组(P<0.05)， AG组患者与正常对照组间淋巴细胞凋亡无显著性差异(P>0.05)。
2.2 病程第2、3周AMI组与正常对照组相比CD3+、CD4+含量增加(P<0.05)，AG组各指标无明显改变，见附表。
2.3 凋亡组和各组淋巴细胞及亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的相关系数r1＝-0.33示低度负相关；r2＝-0.74呈高度负相 关；r 3＝-0.004示低度负相关；r4＝0.424呈中度正相关。结果表明：凋亡增加时，淋巴 细胞呈下降趋势。
, 百拇医药
3 讨论
早在80年代就观察到淋巴细胞凋亡(APO)，这些年来，外周血淋巴细胞(PBL)APO的研究多集 中于血液系统疾病。有文献报导，肺心病病人急性加重期，PBL凋亡率明显升高，但AMI 时PBL凋亡情况尚未见报导。本实验研究发现AMI时，急性期PBL凋亡率明显升高，心绞痛 患者PBL凋亡无明显改变，可见PBL凋亡可作为AMI的一项有重要临床意义的诊断参考指标。A MI时PBL不仅有凋亡改变，而且免疫功能发生改变。文献报导，AMI时CD3+细胞在发 病第1天、1周、2周呈下降趋势；CD4+，CD8+细胞于发病第1、2周分别出现显著 性降 低与增高；CD4+/CD8+在AMI后出现下降趋势。本实验结果表明，AMI急性期时大 多数病人CD3+在正常范围，少数病人CD3+增高或降低。CD4+/CD8+比值均异常 ，部分病 例CD4+/CD8+比值升高，此时CD4+明显升高，CD8+正常或降低；部分 病例CD4+/CD8+比值降低，此时CD4+正常或降低，CD8+明 显升高。结果表明，AMI时免疫功能异常，部分病人免疫功能亢进，部分病人免疫功能抑制 ，目前病理生理学进展揭示：AMI时应激的作用较大，应激时免疫功能的变化与交感神经的 兴奋及神经内分泌的改变直接相关。淋巴细胞表面具有儿茶酚胺、糖皮质激素、生长激素、 内啡肽等多种激素的受体，应激时各种神经内分泌改变既可强化也可抑制免疫功能，它们之 间的平衡左右着机体的免疫状态。本实验免疫功能的改变与之相符。
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附表 各组淋巴细胞凋亡改变
及淋巴细胞亚群(%)检测结果(
±s) 组别APO
CD3+
CD4+
CD 8+
CD4+/CD8+
对照组
4.94±3.67
, 百拇医药
63.38±3.67
33.61±2.26
22.27±3.18
1.61±0.26
AG
4.37±3.42
58.08±9.94
35.16±1.97
20.84±6.60
1.76± 0.47
AMI组
1天
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10.78±10.97
63.32±11.49
37.06±15.6
21.10±12.02
2.21±1.29
3天
14.15±10.96
64.02±18.92
32.46±11.26
26.38±18.81
2.02±1.61
, 百拇医药 5天
8.55±7.25
61.93±11.69
34.33±6.65
23.19±10.07
1.9 7±1.60
1周
3.62±0.95
58.21±11.15
36.99±9.58
21.03±10.48
1.91±1.53
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2周
1.40±0.93
72.48±4.26
41.47±8.34
27.87±8.72
1.68 ±0.86
3周
3.8±2.36
75.88±1.54
46.15±1.89
22±9.76
1.60±0.8 4
, 百拇医药
AMI时有10%病人发病数周后发生梗死后综合征，多数学者认为可能与免疫功能改变有关 。本实验中，有1例病人于梗死2周时发生了梗死后综合征，其CD4+/CD8+比 值明显高于正常，至第3周时，比值仍未降至正常。本实验心肌梗死组凋亡发生率与淋巴细 胞及其亚群计数呈负相关，故推测CD4+/CD8+比值升高，即免疫功能亢进的病人 ，可能容易 发生梗死后综合征；而后者的发生可能是由于淋巴细胞凋亡造成的免疫紊乱所致。提醒临床 医生及早采取防治措施，纠正免疫功能紊乱，可能会预防梗死后综合征等并发症的发生，从 而改善AMI病人的生活质量，降低死亡率。AMI并发症与免疫功能的关系，有待于进一步探讨 。
[参考文献]
[1]老年慢性肺心病患者外周血淋巴细胞凋亡的研究.老年医学杂志，1998，7：2 3.
[2]陈君.急性心肌梗死患者免疫功能有变化及临床意义.天津医药，1996，24 ：67.
[收稿：1999-11-29], http://www.100md.com
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关键词：
中国急救医学000923 细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡，是英国病理学家kerr等于1972年最早提出的。 近些年来随着分子生物学技术的发展，其重要意义越来越受到重视，我们测定了急性心肌梗 死患者不同病期PBL凋亡的变化，并探讨其临床意义。
1 材料与方法
1.1 对象 AMI患者8例，男女各4例，均为我院1999年5～8月住院患者。年龄60～90岁，平均67.7岁 。冠心病心绞痛(AG)对照组8例，男5例，女3例，年龄60～80岁，平均65.9岁。健康老年对 照组8例，男女各4例，年龄60～83岁，平均66.5岁。
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1.2 方法
1.2.1 淋巴细胞凋亡的测定
PBL分离：抽取肝素抗凝外周静脉血4 ml,留1 ml静脉血用于免疫功能测定，余下3 ml静脉血 ，以淋巴细胞分离液分离PBL，弃上清液，振摇成悬浊液。
淋巴细胞凋亡的流式细胞仪测定分析：①准备缓冲液。a.每份样品含105～106个 细胞，准备100μl Annexin V孵育试剂。b.准备500 ul粘合缓冲液。②搜集细胞。在室温( 18℃～24℃)下，以约1 000转/分离心5～10分钟，去上清液。③将细胞重新悬浮在500 μl 冷(2 ℃～8℃)lxPBS中，然后按上述方法离心形成细胞团。④轻轻将细胞重新悬浮于Annexin V孵 育 试剂中，浓度为105～106/100 μl，在室温(18℃～24℃)下，于黑暗处孵育15分 钟 。⑤应用FACSCalibur流式细胞仪(美国B-D公司产品)，于1小时内测定最大信号，分析结果 。⑥统计学方法为两个样本均数的t检验。
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1.2.2 免疫功能的测定
试剂：IgG1 FITC/IgG1 PE/IgG1 PE-CY5三色荧光抗体，CD4+-FITC/CD8+-PE/CD3+PE-CY5三色荧光抗体，为美国Coulter公司产品。
仪器：FACSCalibur流式细胞仪，美国B-D公司产品。
应用Cellquest软件分析，以IgG1 FITC/IgG1 PE/IgG1 PE-CY5为阴性对照管，以CD8+/CD3+双阳性细胞为抑制性T淋巴细胞(Ts细胞)，以CD4+/CD3+双 阳性细胞为辅助性T淋巴细胞(Th细胞)。
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统计学方法：两个均数的t检验。
2 结果
2.1 AMI组患者出现淋巴细胞凋亡，于第3天明显高于正常对照组及AG组(P<0.05)， AG组患者与正常对照组间淋巴细胞凋亡无显著性差异(P>0.05)。
2.2 病程第2、3周AMI组与正常对照组相比CD3+、CD4+含量增加(P<0.05)，AG组各指标无明显改变，见附表。
2.3 凋亡组和各组淋巴细胞及亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的相关系数r1＝-0.33示低度负相关；r2＝-0.74呈高度负相 关；r 3＝-0.004示低度负相关；r4＝0.424呈中度正相关。结果表明：凋亡增加时，淋巴 细胞呈下降趋势。
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3 讨论
早在80年代就观察到淋巴细胞凋亡(APO)，这些年来，外周血淋巴细胞(PBL)APO的研究多集 中于血液系统疾病。有文献报导，肺心病病人急性加重期，PBL凋亡率明显升高，但AMI 时PBL凋亡情况尚未见报导。本实验研究发现AMI时，急性期PBL凋亡率明显升高，心绞痛 患者PBL凋亡无明显改变，可见PBL凋亡可作为AMI的一项有重要临床意义的诊断参考指标。A MI时PBL不仅有凋亡改变，而且免疫功能发生改变。文献报导，AMI时CD3+细胞在发 病第1天、1周、2周呈下降趋势；CD4+，CD8+细胞于发病第1、2周分别出现显著 性降 低与增高；CD4+/CD8+在AMI后出现下降趋势。本实验结果表明，AMI急性期时大 多数病人CD3+在正常范围，少数病人CD3+增高或降低。CD4+/CD8+比值均异常 ，部分病 例CD4+/CD8+比值升高，此时CD4+明显升高，CD8+正常或降低；部分 病例CD4+/CD8+比值降低，此时CD4+正常或降低，CD8+明 显升高。结果表明，AMI时免疫功能异常，部分病人免疫功能亢进，部分病人免疫功能抑制 ，目前病理生理学进展揭示：AMI时应激的作用较大，应激时免疫功能的变化与交感神经的 兴奋及神经内分泌的改变直接相关。淋巴细胞表面具有儿茶酚胺、糖皮质激素、生长激素、 内啡肽等多种激素的受体，应激时各种神经内分泌改变既可强化也可抑制免疫功能，它们之 间的平衡左右着机体的免疫状态。本实验免疫功能的改变与之相符。
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附表 各组淋巴细胞凋亡改变
及淋巴细胞亚群(%)检测结果(
±s) 组别APOCD3+
CD4+
CD 8+
CD4+/CD8+
对照组
4.94±3.67
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63.38±3.67
33.61±2.26
22.27±3.18
1.61±0.26
AG
4.37±3.42
58.08±9.94
35.16±1.97
20.84±6.60
1.76± 0.47
AMI组
1天
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10.78±10.97
63.32±11.49
37.06±15.6
21.10±12.02
2.21±1.29
3天
14.15±10.96
64.02±18.92
32.46±11.26
26.38±18.81
2.02±1.61
, 百拇医药 5天
8.55±7.25
61.93±11.69
34.33±6.65
23.19±10.07
1.9 7±1.60
1周
3.62±0.95
58.21±11.15
36.99±9.58
21.03±10.48
1.91±1.53
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2周
1.40±0.93
72.48±4.26
41.47±8.34
27.87±8.72
1.68 ±0.86
3周
3.8±2.36
75.88±1.54
46.15±1.89
22±9.76
1.60±0.8 4
, 百拇医药
AMI时有10%病人发病数周后发生梗死后综合征，多数学者认为可能与免疫功能改变有关 。本实验中，有1例病人于梗死2周时发生了梗死后综合征，其CD4+/CD8+比 值明显高于正常，至第3周时，比值仍未降至正常。本实验心肌梗死组凋亡发生率与淋巴细 胞及其亚群计数呈负相关，故推测CD4+/CD8+比值升高，即免疫功能亢进的病人 ，可能容易 发生梗死后综合征；而后者的发生可能是由于淋巴细胞凋亡造成的免疫紊乱所致。提醒临床 医生及早采取防治措施，纠正免疫功能紊乱，可能会预防梗死后综合征等并发症的发生，从 而改善AMI病人的生活质量，降低死亡率。AMI并发症与免疫功能的关系，有待于进一步探讨 。
[参考文献]
[1]老年慢性肺心病患者外周血淋巴细胞凋亡的研究.老年医学杂志，1998，7：2 3.
[2]陈君.急性心肌梗死患者免疫功能有变化及临床意义.天津医药，1996，24 ：67.
[收稿：1999-11-29], http://www.100md.com