雌激素对卵巢切除大鼠内源性白细胞介素-6变化的影响
作者：涂意辉 杜靖远
单位：同济医科大学附属协和医院骨科，武汉 430022
关键词：卵巢切除；白细胞介素-6；雌激素
中国矫形外科杂志000916
摘 要 目的：探讨卵巢切除后大鼠内源性白细胞介素-6(IL-6)的变化及雌激素替补治疗对此的影响。方法：通过酶联免疫吸收法检测骨髓上清的IL-6含量，通过斑点杂交和免疫组织化学方法检测骨组织IL-6的表达和分布。结果：卵巢切除导致骨髓上清IL-6含量和骨组织IL-6表达升高，而雌激素替补治疗在一定程度上抑制了这两者的升高。骨组织成骨细胞、骨细胞和骨衬里细胞均有较强的IL-6免疫活性。结论：雌激素缺乏使骨髓内源性IL-6增加可能是由成骨细胞系IL-6 mRNA表达升高决定的，雌激素抗骨吸收作用部分是通过降低IL-6的产生而介导的。IL-6在卵巢切除大鼠骨丢失中可能起着重要作用。
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中图分类号 R683 文献标识码 A
文章编号 1005-8478(2000)09-0886-03
Effects of Estrogen on Production of Endogenous Interleukin-6 in Ovariectomized Rats
TU Yi-hui,DU Jing-yuan.
(Department of Orthopaedics,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430022.)
Abstract Objective:To study the effect of estrogen on production of endogenous interleukin-6 (IL-6) in ovariectomized rats.Methods:Ovariectomized rats model were used in this study.The concentration of IL-6 in bone marrow supernatants (BMS)were measured by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA).The expression and distribution of IL-6 were detected by dot blot hybridization and immunohistochemistry respectively 8 weeks after surgery.Results:The concentration of IL-6 in BMS and the expression of IL-6 in bone tissue were much higher in ovariectomized rats as compared with in control rats.While treated with estrogen,both parameter declined to some degree.The immunoreactivity signals were detected in osteoblasts,lining cells and osteocytes.Conclusions:Estrogen deficiency enhanced endogenous IL-6 levels in BMS,resuting from increased expression of IL-6 in vivo osteoblas linage.Suppression for IL-6 production were involvement in mechanism of estrogen application inhibiting bone loss in ovariectomized rats.
, 百拇医药
Key words Ovariectomy Interleukin-6 Estrogen
卵巢切除引起骨转换增加，并且骨吸收超过骨形成，导致骨丢失[1]。引起这种变化的分子机制尚不清楚。本文建立卵巢切除大鼠模型，检测骨髓上清白细胞介素-6(IL-6)含量及骨组织IL-6表达的变化和分布，以探讨卵巢切除后内源性IL-6的变化及雌激素治疗对此的影响。
1 材料与方法
1.1卵巢切除大鼠模型的建立及分组
9月龄雌性SD大鼠30只，体重260～300g，由同济医科大学实验动物中心提供。1%戊巴比妥钠麻醉，随机分成3组：(1)对照组10只，只暴露而不切除双侧卵巢；(2)卵巢切除组10只，完整切除双侧卵巢；(3)雌激素治疗组10只，切除双侧卵巢后每隔2周皮下注射苯甲酸雌二醇0.2mg。所有大鼠自由饮水，标准饲料喂养，2个月后被处死取材。
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1.2 方法
1.2.1 骨髓上清IL-6含量的测定 使用Lee SK等介绍的方法制备骨髓上清[2]，通过ELISA分别测定3组大鼠骨髓上清IL-6含量，测试试剂盒购自Genzyme公司。
1.2.2 斑点杂交 异硫氰酸胍一步法提取左侧股骨和胫骨总RNA[3]，使用德国Boehringer Mannheim公司地高辛高效引物标记及检测试剂盒，地高辛标记IL-6 cDNA探针。RNA液点样于硝酸纤维素膜，进行斑点杂交。杂交斑点的光密度值(IOD)通过病理图像分析系统进行测试。
1.2.3 免疫组织化学染色 取右侧胫骨干骺端，常规制成5μm厚的石腊切片。具体操作步骤按SABC试剂盒说明书进行，DAB显色，以胞浆内出现棕色颗粒为阳性染色。
1.2.4 骨矿密度测量 脊椎被完全显露，取出L1～3，移出椎管内脊髓，使用Hologic QDR-200+型双能X线骨密度仪测定标本的骨密度值。
, 百拇医药
1.2.5 统计学方法 实验结果以均数±标准差(x±s)表示，以t检验进行统计学处理。
2 结 果
表1显示，卵巢切除导致IL-6产生增加，与对照组比较，骨髓上清IL-6含量升高2.2倍(P<0.01)，骨组织IL-6 mRNA表达升高2.4倍(P<0.01)；另外，卵巢切除还导致L1～3骨矿密度显著性下降。雌激素治疗抑制了IL-6产生，与卵巢切除组比较，骨髓上清IL-6含量及骨组织IL-6 mRNA均显著下降；另外，雌激素治疗还使L1～3骨矿密度显著性上升。免疫组化染色结果见图1～3，骨组织成骨细胞、骨细胞和骨衬里细胞均具有较强的免疫活性。
表1 3组大鼠骨髓上清IL-6含量、骨组织IL-6 mRNA表达水平和骨矿密度(x±s，n＝10) 组 别
骨髓上清IL-6含量(pg/ml)
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骨组织IL-6 mRNA表达水平(IOD)
骨矿密度(mg/cm2)
对照组卵巢切除组
雌激素治疗组
43.63±1.58
97.93±2.87
68.14±1.96△△
36.41±4.87
87.81±12.36
58.39±7.43△△
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296.83±4.49
265.07±3.64
287.17±3.93△△
注：与对照组比较，P<0.01；与卵巢切除组比较，△△P<0.01
3 讨 论
骨质疏松症是进行性骨丢失，骨量下降，骨显微结构破坏为特征的代谢性疾病[4]。IL-6是一种多功能细胞因子，具有广泛的生理活性，在骨代谢中可能也起着重要作用。实验表明，IL-6能刺激破骨细胞的形成及活化，IL-6可能通过此途径而介导雌激素缺乏导致的骨吸收增加[5]。但体外实验具有一定局限性，因为体外细胞的分离和培养可能改变细胞因子的分泌；更重要的是，体外实验不能完全模拟体内实际情况，不能准确判断体内局部微环境中各个支持细胞和细胞因子所起的作用。
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在体内，关于雌激素是否影响内源性IL-6的产生及骨组织中哪些细胞表达IL-6研究很少。骨髓是一个复杂的细胞和细胞因子网络，与破骨细胞的产生及骨改建有着密切的联系[6]。本实验建立卵巢切除大鼠模型，直接测其骨髓上清IL-6的含量和骨组织IL-6 mRNA表达变化及雌激素治疗对此的影响，更客观反映了绝经后骨质疏松的实际情况。实验结果显示，卵巢切除不仅使骨组织IL-6 mRNA 表达水平显著升高，且导致骨髓上清IL-6含量显著增加；雌激素治疗有效地抑制了两者的升高，与卵巢切除组比较，两者显著性下降(P<0.01)。说明骨髓上清IL-6水平可能是由骨组织稳态IL-6 mRNA表达决定的，雌激素有调节卵巢切除大鼠骨组织的IL-6表达的作用。
为了探讨分泌IL-6的细胞在骨组织的分布所进行的免疫组织化学染色结果显示，在骨组织成骨细胞、骨细胞和骨衬里细胞具有较强的IL-6免疫活性。说明成骨细胞系具有合成IL-6的功能。
成骨细胞系由合成功能的成骨细胞、功能静止位于骨小梁表面的骨衬里细胞及位于骨陷窝内的骨细胞共同组成，通过骨小管3种细胞彼此发生功能联系[7]。成骨细胞膜上存在雌激素受体[8]，雌激素可能直接与受体结合而调节IL-6的分泌。雌激素抑制IL-6的产生可能是通过与特异性受体结合，间接地抑制IL-6基因促动子近端225bp序列的活性而引起的[9]。在雌激素缺乏时，这种抑制作用丧失，从而成骨细胞IL-6mRNA表达升高，大量IL-6通过旁分泌进入骨髓中，为破骨细胞产生提供了一个合适的环境，使破骨细胞性骨吸收增加。
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L1～3骨矿密度测量结果显示，卵巢切除使骨矿密度显著性下降，而雌激素治疗部分抑制了这种变化，说明卵巢切除二个月后发生了骨丢失，而雌激素具有抗骨丢失作用。
本实验结果提示，卵巢切除导致骨丢失，与内源性IL-6水平升高有密切关系，可能由骨组织成骨细胞系IL-6 mRNA表达升高并以旁分泌方式大量分泌IL-6进入骨髓微环境中引起的；而雌激素抗丢失作用，可能部分通过降低骨组织成骨细胞系分泌IL-6而介导的。
作者简介：涂意辉(1964-)，男，湖北武汉人，副主任医师，医学博士，主要从事脊柱外科，骨质疏松的研究。电话：(027)65430520×567
参考文献：
[1] Kanis JA.Estrogen,the menopause,and osteoporosis[J].Bone,1996,19:185～190.
, 百拇医药
[2] Lee SK,Goldring SR,Lorenzo JA.Expression of the calcitonin recepor in bone morrow cell cultures and in bone[J].Endocrinology,1995,136:4 572～4 581.
[3] Sambrook J,Frits EF,Maniatis T.Moleculor cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Sping Harbor,New York,NY,U.S.A.
[4] Mark K,Horowit Z.Cytokines and estrogen in Bone:Antiosteoporotic effects.Science,1993,260:626～627.
[5] Ishimi Y,Miyaura C,Jin CH,et al.IL-6 is produced by osteoblast and induce bone resorption.J Immunol,1990,145:3 297～3 303.
, http://www.100md.com
[6] Romas E,Martin TJ.Cytokines in the pathogenesis of osteoporosis[J].Osteoporos Int,1997(suppl 3):s47～s45.
[7] Martin TJ.Hormones in the coupling of bone resorption and formation[J].Osteoporos Int,1993(suppl 1):s121～s125.
[8] Eriksen E,Colvard DS,Derg NJ,et al.Evidence of estrogen receptors in normal human osteoblast-like cell[J].Science.1988,24:84～86.
[9] Pottratz S,Bellido T,Mocharla H,et al.17 β-estrodiol inhibits expression of human interleukin-6 promotor-reporter constructs by a receptor-dependent mechanisms[J].J Clin Invest,1994,93:944～950.
(收稿：2000-01-19 修回：2000-04-25), http://www.100md.com
单位：同济医科大学附属协和医院骨科，武汉 430022
关键词：卵巢切除；白细胞介素-6；雌激素
中国矫形外科杂志000916
摘 要 目的：探讨卵巢切除后大鼠内源性白细胞介素-6(IL-6)的变化及雌激素替补治疗对此的影响。方法：通过酶联免疫吸收法检测骨髓上清的IL-6含量，通过斑点杂交和免疫组织化学方法检测骨组织IL-6的表达和分布。结果：卵巢切除导致骨髓上清IL-6含量和骨组织IL-6表达升高，而雌激素替补治疗在一定程度上抑制了这两者的升高。骨组织成骨细胞、骨细胞和骨衬里细胞均有较强的IL-6免疫活性。结论：雌激素缺乏使骨髓内源性IL-6增加可能是由成骨细胞系IL-6 mRNA表达升高决定的，雌激素抗骨吸收作用部分是通过降低IL-6的产生而介导的。IL-6在卵巢切除大鼠骨丢失中可能起着重要作用。
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中图分类号 R683 文献标识码 A
文章编号 1005-8478(2000)09-0886-03
Effects of Estrogen on Production of Endogenous Interleukin-6 in Ovariectomized Rats
TU Yi-hui,DU Jing-yuan.
(Department of Orthopaedics,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430022.)
Abstract Objective:To study the effect of estrogen on production of endogenous interleukin-6 (IL-6) in ovariectomized rats.Methods:Ovariectomized rats model were used in this study.The concentration of IL-6 in bone marrow supernatants (BMS)were measured by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA).The expression and distribution of IL-6 were detected by dot blot hybridization and immunohistochemistry respectively 8 weeks after surgery.Results:The concentration of IL-6 in BMS and the expression of IL-6 in bone tissue were much higher in ovariectomized rats as compared with in control rats.While treated with estrogen,both parameter declined to some degree.The immunoreactivity signals were detected in osteoblasts,lining cells and osteocytes.Conclusions:Estrogen deficiency enhanced endogenous IL-6 levels in BMS,resuting from increased expression of IL-6 in vivo osteoblas linage.Suppression for IL-6 production were involvement in mechanism of estrogen application inhibiting bone loss in ovariectomized rats.
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Key words Ovariectomy Interleukin-6 Estrogen
卵巢切除引起骨转换增加，并且骨吸收超过骨形成，导致骨丢失[1]。引起这种变化的分子机制尚不清楚。本文建立卵巢切除大鼠模型，检测骨髓上清白细胞介素-6(IL-6)含量及骨组织IL-6表达的变化和分布，以探讨卵巢切除后内源性IL-6的变化及雌激素治疗对此的影响。
1 材料与方法
1.1卵巢切除大鼠模型的建立及分组
9月龄雌性SD大鼠30只，体重260～300g，由同济医科大学实验动物中心提供。1%戊巴比妥钠麻醉，随机分成3组：(1)对照组10只，只暴露而不切除双侧卵巢；(2)卵巢切除组10只，完整切除双侧卵巢；(3)雌激素治疗组10只，切除双侧卵巢后每隔2周皮下注射苯甲酸雌二醇0.2mg。所有大鼠自由饮水，标准饲料喂养，2个月后被处死取材。
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1.2 方法
1.2.1 骨髓上清IL-6含量的测定 使用Lee SK等介绍的方法制备骨髓上清[2]，通过ELISA分别测定3组大鼠骨髓上清IL-6含量，测试试剂盒购自Genzyme公司。
1.2.2 斑点杂交 异硫氰酸胍一步法提取左侧股骨和胫骨总RNA[3]，使用德国Boehringer Mannheim公司地高辛高效引物标记及检测试剂盒，地高辛标记IL-6 cDNA探针。RNA液点样于硝酸纤维素膜，进行斑点杂交。杂交斑点的光密度值(IOD)通过病理图像分析系统进行测试。
1.2.3 免疫组织化学染色 取右侧胫骨干骺端，常规制成5μm厚的石腊切片。具体操作步骤按SABC试剂盒说明书进行，DAB显色，以胞浆内出现棕色颗粒为阳性染色。
1.2.4 骨矿密度测量 脊椎被完全显露，取出L1～3，移出椎管内脊髓，使用Hologic QDR-200+型双能X线骨密度仪测定标本的骨密度值。
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1.2.5 统计学方法 实验结果以均数±标准差(x±s)表示，以t检验进行统计学处理。
2 结 果
表1显示，卵巢切除导致IL-6产生增加，与对照组比较，骨髓上清IL-6含量升高2.2倍(P<0.01)，骨组织IL-6 mRNA表达升高2.4倍(P<0.01)；另外，卵巢切除还导致L1～3骨矿密度显著性下降。雌激素治疗抑制了IL-6产生，与卵巢切除组比较，骨髓上清IL-6含量及骨组织IL-6 mRNA均显著下降；另外，雌激素治疗还使L1～3骨矿密度显著性上升。免疫组化染色结果见图1～3，骨组织成骨细胞、骨细胞和骨衬里细胞均具有较强的免疫活性。
表1 3组大鼠骨髓上清IL-6含量、骨组织IL-6 mRNA表达水平和骨矿密度(x±s，n＝10) 组 别
骨髓上清IL-6含量(pg/ml)
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骨组织IL-6 mRNA表达水平(IOD)
骨矿密度(mg/cm2)
对照组卵巢切除组
雌激素治疗组
43.63±1.58
97.93±2.87
68.14±1.96△△
36.41±4.87
87.81±12.36
58.39±7.43△△
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296.83±4.49
265.07±3.64
287.17±3.93△△
注：与对照组比较，P<0.01；与卵巢切除组比较，△△P<0.01
3 讨 论
骨质疏松症是进行性骨丢失，骨量下降，骨显微结构破坏为特征的代谢性疾病[4]。IL-6是一种多功能细胞因子，具有广泛的生理活性，在骨代谢中可能也起着重要作用。实验表明，IL-6能刺激破骨细胞的形成及活化，IL-6可能通过此途径而介导雌激素缺乏导致的骨吸收增加[5]。但体外实验具有一定局限性，因为体外细胞的分离和培养可能改变细胞因子的分泌；更重要的是，体外实验不能完全模拟体内实际情况，不能准确判断体内局部微环境中各个支持细胞和细胞因子所起的作用。
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在体内，关于雌激素是否影响内源性IL-6的产生及骨组织中哪些细胞表达IL-6研究很少。骨髓是一个复杂的细胞和细胞因子网络，与破骨细胞的产生及骨改建有着密切的联系[6]。本实验建立卵巢切除大鼠模型，直接测其骨髓上清IL-6的含量和骨组织IL-6 mRNA表达变化及雌激素治疗对此的影响，更客观反映了绝经后骨质疏松的实际情况。实验结果显示，卵巢切除不仅使骨组织IL-6 mRNA 表达水平显著升高，且导致骨髓上清IL-6含量显著增加；雌激素治疗有效地抑制了两者的升高，与卵巢切除组比较，两者显著性下降(P<0.01)。说明骨髓上清IL-6水平可能是由骨组织稳态IL-6 mRNA表达决定的，雌激素有调节卵巢切除大鼠骨组织的IL-6表达的作用。
为了探讨分泌IL-6的细胞在骨组织的分布所进行的免疫组织化学染色结果显示，在骨组织成骨细胞、骨细胞和骨衬里细胞具有较强的IL-6免疫活性。说明成骨细胞系具有合成IL-6的功能。
成骨细胞系由合成功能的成骨细胞、功能静止位于骨小梁表面的骨衬里细胞及位于骨陷窝内的骨细胞共同组成，通过骨小管3种细胞彼此发生功能联系[7]。成骨细胞膜上存在雌激素受体[8]，雌激素可能直接与受体结合而调节IL-6的分泌。雌激素抑制IL-6的产生可能是通过与特异性受体结合，间接地抑制IL-6基因促动子近端225bp序列的活性而引起的[9]。在雌激素缺乏时，这种抑制作用丧失，从而成骨细胞IL-6mRNA表达升高，大量IL-6通过旁分泌进入骨髓中，为破骨细胞产生提供了一个合适的环境，使破骨细胞性骨吸收增加。
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L1～3骨矿密度测量结果显示，卵巢切除使骨矿密度显著性下降，而雌激素治疗部分抑制了这种变化，说明卵巢切除二个月后发生了骨丢失，而雌激素具有抗骨丢失作用。
本实验结果提示，卵巢切除导致骨丢失，与内源性IL-6水平升高有密切关系，可能由骨组织成骨细胞系IL-6 mRNA表达升高并以旁分泌方式大量分泌IL-6进入骨髓微环境中引起的；而雌激素抗丢失作用，可能部分通过降低骨组织成骨细胞系分泌IL-6而介导的。
作者简介：涂意辉(1964-)，男，湖北武汉人，副主任医师，医学博士，主要从事脊柱外科，骨质疏松的研究。电话：(027)65430520×567
参考文献：
[1] Kanis JA.Estrogen,the menopause,and osteoporosis[J].Bone,1996,19:185～190.
, 百拇医药
[2] Lee SK,Goldring SR,Lorenzo JA.Expression of the calcitonin recepor in bone morrow cell cultures and in bone[J].Endocrinology,1995,136:4 572～4 581.
[3] Sambrook J,Frits EF,Maniatis T.Moleculor cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Sping Harbor,New York,NY,U.S.A.
[4] Mark K,Horowit Z.Cytokines and estrogen in Bone:Antiosteoporotic effects.Science,1993,260:626～627.
[5] Ishimi Y,Miyaura C,Jin CH,et al.IL-6 is produced by osteoblast and induce bone resorption.J Immunol,1990,145:3 297～3 303.
, http://www.100md.com
[6] Romas E,Martin TJ.Cytokines in the pathogenesis of osteoporosis[J].Osteoporos Int,1997(suppl 3):s47～s45.
[7] Martin TJ.Hormones in the coupling of bone resorption and formation[J].Osteoporos Int,1993(suppl 1):s121～s125.
[8] Eriksen E,Colvard DS,Derg NJ,et al.Evidence of estrogen receptors in normal human osteoblast-like cell[J].Science.1988,24:84～86.
[9] Pottratz S,Bellido T,Mocharla H,et al.17 β-estrodiol inhibits expression of human interleukin-6 promotor-reporter constructs by a receptor-dependent mechanisms[J].J Clin Invest,1994,93:944～950.
(收稿：2000-01-19 修回：2000-04-25), http://www.100md.com