缺血后处理对急性心肌缺血再灌注兔心脏的保护作用
缺血后处理对急性心肌缺血再灌注兔心脏的保护作用
陶凌 李源 高峰 王跃民 龚卫琴
摘 要:目的 研究缺血预处理和缺血后处理对兔心收缩功能和心肌梗死范围的影响，探讨在体条件下，缺血后处理是否具有减轻缺血心肌再灌注损伤的作用. 方法 采用兔缺血再灌注模型，分别以缺血前短暂心肌缺血作预处理，或缺血后再灌前，多次短暂再灌停灌作缺血后处理. 以多导生理仪监测和记录血流动力学指标,TTC法确定心肌梗死范围. 结果 缺血预处理组及缺血后处理组心肌梗死范围分别为(14.7±6.0)%和(12.5±5.4)%，均低于对照组(26.7±6.7)%(P<0.01), 兔左室内压峰值(LVSP)恢复率和dp/dtmax恢复率均高于对照组,再灌注心律失常发生率明显低于对照组(P<0.05). 结论 缺血后处理与缺血预处理对缺血心脏具有相似的保护作用，可改善缺血-再灌心脏收缩功能，缩小心肌梗死范围.
, 百拇医药
关键词:缺血预处理；缺血后处理；缺血-再灌注损伤；心脏保护
0 引言
20世纪80年代中期，Murry等[1]提出心肌在经受多次短暂缺血再灌后，能在随后的长时间缺血中延迟并减轻心肌损伤，即缺血预处理(ischemic preconditioning，IP)，该效应在多种动物模型中得到证实. 但由于这种预处理需在缺血前施与，而使其临床应用价值受限. 国内高峰等[2]在培养的成年大鼠心肌细胞缺氧-复氧模型上发现,已缺氧心肌细胞在复氧前经多次短暂复氧停氧处理，可明显提高心肌细胞存活率,进而提出缺氧后处理(Hypoxic postconditioning,HP)概念. 本研究旨在探讨在体情况下，缺血后处理是否可减轻已缺血心肌再灌注损伤，并与缺血预处理的心脏保护作用进行对比.
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 实验动物及分组 选用健康大耳白兔(本校实验动物研究中心提供)24只，(在试验过程中死亡1只，补1只，共25只)，体质量2.0～2.5 kg，雌雄不拘，随机分为3组(每组8只)①对照组：缺血40 min，再灌注120 min；②缺血预处理组：缺血5min，再灌注10 min，而后重复对照组实验方法；③缺血后处理组：缺血40 min，再灌注2min，缺血2min，再灌注3min，缺血2min，再灌注5min，缺血2min，再灌注7min，缺血2min，然后再灌注95 min.
1.2 心肌缺血动物模型制备 采用常规兔缺血再灌注模型[3].
1.3 心肌收缩功能指标记录和测量 在记录仪上监测和描记心电图、左室内压(LVP)曲线(测定左室内压峰值，LVSP)，将LVP电信号输入微分器描记左室dp/dt曲线，从曲线上测取±dp/dtmax. 所有图形和数据存入RM-6280多道生理记录和数据分析处理系统中进行处理.
, 百拇医药
1.4 心肌梗死范围的测量 于实验终点将LAD重新阻断，从左心室导管内推注20 g.L-1伊文斯蓝3～4 mL，2 min后迅速剪下心脏，分离缺血区(无蓝色)和非缺血区(蓝色)，将缺血心肌以滤纸吸干，置于天平上称重，再将缺血区水平切成5～6片，每片厚1～2 mm，置入10 g.L-1 TTC磷酸缓冲液(pH=7.4)中37℃水浴15 min，再将坏死区(灰白色)和非坏死区(深红色)分离，滤纸吸干将非坏死心肌称重，梗死范围以坏死心肌占缺血心肌重量的百分比表示.
1.5 统计学处理 实验数据均以X±s表示，使用SPSS统计学软件进行单因素方差分析，两组间差异比较采用Student-Newman-Keuls multiple-range test，P<0.05为差异显著.
2 结果
2.1 心脏收缩-舒张功能 测取各组动物缺血前左室内压峰值(LVSP)及缺血40 min时LVSP，缺血40 min时LVSP与缺血前LVSP的比率(即恢复率)之间无显著性差异. 再灌注120 min时，缺血预处理组和缺血后处理组LVSP的恢复率均高于对照组 (P<0.05)，这两组间无明显差异(Tab 1). 缺血40 min时，缺血预处理组±dp/dtmax的恢复率均高于其他组(P<0.05)，而对照组与后处理组间无显著差异. 再灌注120 min时，缺血预处理组, 缺血后处理组±dp/dtmax的恢复率均高于对照组 (P<0.05)，且两处理组间无显著差异(Tab 1).
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2.2 心肌梗死范围 缺血预处理和缺血后处理组心肌梗死范围分别较对照组减小45%和53%(P<0.01)，且两组间无显著性差异(P>0.05,Tab 2).
表 1 不同处理组心肌缺血、再灌注时的LVSP,±dp/dtmax及恢复率
Tab 1 Resumptive ratio of LVSP,±dp/dtmax among each groups(n=8, X±s )
Groups
LVSP
±dp/dtmax
HR(beats.min-1)
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BI
I 40 min/BI
R 120 min/ BI
BI
I 40 min/BI
R 120 min/BI
BI
I 40 min
R 120 min
(mmHg)
%
%
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( mmHg/s)
%
%
Control
126±15
79.7±12.1
60.7±4.8
4813±959
58.6±16.2
56.4±10.9
234±23
211±24
, 百拇医药
150±28
-3851±947
57.3±24.7
59.4±14.7
IP
140±26
84.7±8.9
84.3±7.9a
4988±908
80.5±11.8a
76.6±13.7a
, http://www.100md.com
242±20
227±20
196±17a
-3824±821
78.4±8.8a
77.9±12.7a
HP
126±15
85.1±6.5
83.7±8.9a
, 百拇医药
4372±482
65.9±6.3
79.8±12.1a
231±16
222±18
184±13a
-3242±312
57.1±15.7
78.2±15.8a
1. aP<0.05 vs control groups; 2. the upper line are +dp/dtmax，the lower line are -dp/dtmax; 3. IPBI:before ischemia; I 40 min:40 min after ischemia;R 120 min:120 min after reperfusion. IP:ischemia preconditioning;HP:Hypozic postconditioning. 表 2 不同处理组心肌缺血-再灌注120 min后心肌梗死范围比较
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Tab 2 Comparison of infarct size among each groups(n=8,X±s )
Group
Weight of ischemic
size (mg)
Weight of necrosis
size (mg)
Infarct size
(%)
Control
1216.7±103.27
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323.33±75.80
26.67±6.66
IP
1166.67±194.07
174.16±77.87
14.71±6.03b
HP
1370.83± 191.32
165.00±60.24
12.47±5.38b
1.bP<0.01 vs control group. 2. IP,HP same as Tab 1. 2.3 缺血及再灌注过程中心律失常发生情况 对照组3只兔子分别发生严重室颤及室扑，均发生于再灌注早期，电除颤后其中1只死亡. 缺血后处理组有1例在缺血12 min时出现心脏停跳，经心脏按压后恢复. 此外，各组中还均有不同程度的非致死性心律失常(如室速，早搏或二联律等)，在再灌注的过程中自行恢复，其发生率亦以对照组更高(Fig 1).
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图 1 兔缺血再灌注过程中各组心律失常发生次数
Fig 1 Arrhythmia occurrence times during ischemia-reperfusion in each groups
3 讨论
近年来随着临床冠脉内溶栓、PTCA及冠脉搭桥等治疗方法的广泛应用，心肌再灌注损伤愈来愈引起心血管病专科医生的重视. 由于冠心患者已经发生心肌缺血，缺血前预处理的应用受到一定的限制. 针对已缺血心肌，设法减轻再灌注损伤，无疑具有重要的临床意义.
本实验发现，缺血后处理与缺血预处理相似，可以缩小心肌梗死范围，加快心肌收缩功能恢复，特别是明显降低再灌注早期心律失常发生率，对缺血心肌细胞具有明显的保护作用. 值得注意的是，有研究认为IP引起腺苷一过性释放增加是发挥其心肌保护作用的一个重要因素[4-7]. 我们的实验表明，开始再灌注时给予腺苷治疗不能发挥保护作用,提示缺血后处理的保护作用可能主要不是通过腺苷途径发挥作用. 已知再灌注时氧自由基爆发产生是造成缺血再灌注损伤的重要原因. 有资料表明，再灌注早期氧应激刺激可改变肌浆网和肌纤维膜上的一些离子转运蛋白的活性，导致细胞内钙超载，肌浆网波动性释放Ca2+和细胞膜电位发生致心律失常性波动[8]. 而早期再灌注时产生的大量自由基可能引起膜磷脂或蛋白质氧化，导致钾钙离子通道的功能失调及细胞内酶的泄漏，使心脏的易损性增加. 高峰等在离体培养大鼠心肌细胞缺氧-复氧实验中观察到，SOD和一氧化氮合酶抑制剂(L-NA)可减轻缺氧心肌的复氧损伤，提高心肌细胞存活率[2]. 本实验采用缺血后，反复短暂的预再灌在某种意义上相当于有控制的缓慢复氧，可减少突然复氧时氧自由基的爆发产生，或通过刺激体内抗氧化剂和自由基清除剂的释放而发挥保护作用. 有动物实验证实，缓慢再灌注(缓慢松开微米缩窄器)比突然再灌注(突然解除动脉夹)的室颤发生率低[9]，这可能与本实验的缺血后处理在本质上相似. 临床上治疗急性心肌缺血与动物实验相比，不易发生再灌注心律失常，可能与临床的溶栓治疗均属缓慢再灌注. 反复短暂的预再灌与缓慢再灌注很可能具有相同或相似的作用途径. 但其确切保护作用的机制尚需进一步研究.
, http://www.100md.com
基金项目:军队留学回国人员科研启动基金(98H019)
作者简介:陶 凌(1974-),女(汉族), 安徽省合肥市人. 1997年级该校附属西京医院老年病科心血管专业硕士生(导师李 源,高 峰). Tel.(029)3375243(O)
陶凌(第四军医大学：西京医院老年病科，陕西 西安 710033陕西 西安 710033)
李源(第四军医大学：西京医院老年病科，陕西 西安 710033陕西 西安 710033)
高峰(第四军医大学：基础部生理学教研室,陕西 西安 710033)
王跃民(第四军医大学：基础部生理学教研室,陕西 西安 710033)
龚卫琴(第四军医大学：西京医院老年病科，陕西 西安 710033陕西 西安 710033)
, 百拇医药
参考文献:
[1] Murry CE, Jennings RB, Reimer KA et al. Preconditioning with ischemia: A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J]. Circulation, 1986;74(5):1124-1136.
[2] 高 峰，Yan WL, Geng YJ et al. “缺氧后处理”对大鼠缺氧-复氧心室肌细胞的保护作用[J]. 心功能杂志，1999；11(4)：241-243.
[3] 胡 萍，尤家禄，罗 正. 大鼠心肌灌注损伤模型[J]. 湖南医学院学报,1986;11(1):15-17.
[4] Wikstrom BG, Ronquist G, Waldenstrom A et al. Dynamics of myocardial metabolism in the preconditioned porcine heart studied using continuous microdialysis[J]. Eur Heart J,1995;16(4):563-569.
, 百拇医药
[5] 陈 健，张钧华，林 静et al. 缺血预处理限制心肌梗死范围的作用与腺苷受体的关系[J]. 中国介入心脏病学杂志，1995；3(4)：174-175.
[6] 陈 健，张钧华，林静et al. 缺血预处理改善心脏收缩功能的效应与腺苷受体关系的研究[J]. 中华心血管病杂志，1996；24(6)：449-451.
[7] Cohen MV, Liu GS, Downey JM. Preconditioning causes improved wall motion as well as smaller infarcts after transient coronary occlusion in rabbits[J]. Circulation,1991;84(6):341-349.
[8] 臧益民，朱妙章. 冠状循环生理与临床的关系[M]. 见臧益民，朱妙章. 临床心血管生理学及其进展，1993:136-147.
[9] Cave AC, Collis CS, Downey JM et al. Improved functional recovery by ischemic preconditioning is not mediated by adenosine in the globally ischemic isolated rat heart[J]. Cardiovasc Res,1993;27(3):663-670., 百拇医药
陶凌 李源 高峰 王跃民 龚卫琴
摘 要:目的 研究缺血预处理和缺血后处理对兔心收缩功能和心肌梗死范围的影响，探讨在体条件下，缺血后处理是否具有减轻缺血心肌再灌注损伤的作用. 方法 采用兔缺血再灌注模型，分别以缺血前短暂心肌缺血作预处理，或缺血后再灌前，多次短暂再灌停灌作缺血后处理. 以多导生理仪监测和记录血流动力学指标,TTC法确定心肌梗死范围. 结果 缺血预处理组及缺血后处理组心肌梗死范围分别为(14.7±6.0)%和(12.5±5.4)%，均低于对照组(26.7±6.7)%(P<0.01), 兔左室内压峰值(LVSP)恢复率和dp/dtmax恢复率均高于对照组,再灌注心律失常发生率明显低于对照组(P<0.05). 结论 缺血后处理与缺血预处理对缺血心脏具有相似的保护作用，可改善缺血-再灌心脏收缩功能，缩小心肌梗死范围.
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关键词:缺血预处理；缺血后处理；缺血-再灌注损伤；心脏保护
0 引言
20世纪80年代中期，Murry等[1]提出心肌在经受多次短暂缺血再灌后，能在随后的长时间缺血中延迟并减轻心肌损伤，即缺血预处理(ischemic preconditioning，IP)，该效应在多种动物模型中得到证实. 但由于这种预处理需在缺血前施与，而使其临床应用价值受限. 国内高峰等[2]在培养的成年大鼠心肌细胞缺氧-复氧模型上发现,已缺氧心肌细胞在复氧前经多次短暂复氧停氧处理，可明显提高心肌细胞存活率,进而提出缺氧后处理(Hypoxic postconditioning,HP)概念. 本研究旨在探讨在体情况下，缺血后处理是否可减轻已缺血心肌再灌注损伤，并与缺血预处理的心脏保护作用进行对比.
1 材料和方法
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1.1 实验动物及分组 选用健康大耳白兔(本校实验动物研究中心提供)24只，(在试验过程中死亡1只，补1只，共25只)，体质量2.0～2.5 kg，雌雄不拘，随机分为3组(每组8只)①对照组：缺血40 min，再灌注120 min；②缺血预处理组：缺血5min，再灌注10 min，而后重复对照组实验方法；③缺血后处理组：缺血40 min，再灌注2min，缺血2min，再灌注3min，缺血2min，再灌注5min，缺血2min，再灌注7min，缺血2min，然后再灌注95 min.
1.2 心肌缺血动物模型制备 采用常规兔缺血再灌注模型[3].
1.3 心肌收缩功能指标记录和测量 在记录仪上监测和描记心电图、左室内压(LVP)曲线(测定左室内压峰值，LVSP)，将LVP电信号输入微分器描记左室dp/dt曲线，从曲线上测取±dp/dtmax. 所有图形和数据存入RM-6280多道生理记录和数据分析处理系统中进行处理.
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1.4 心肌梗死范围的测量 于实验终点将LAD重新阻断，从左心室导管内推注20 g.L-1伊文斯蓝3～4 mL，2 min后迅速剪下心脏，分离缺血区(无蓝色)和非缺血区(蓝色)，将缺血心肌以滤纸吸干，置于天平上称重，再将缺血区水平切成5～6片，每片厚1～2 mm，置入10 g.L-1 TTC磷酸缓冲液(pH=7.4)中37℃水浴15 min，再将坏死区(灰白色)和非坏死区(深红色)分离，滤纸吸干将非坏死心肌称重，梗死范围以坏死心肌占缺血心肌重量的百分比表示.
1.5 统计学处理 实验数据均以X±s表示，使用SPSS统计学软件进行单因素方差分析，两组间差异比较采用Student-Newman-Keuls multiple-range test，P<0.05为差异显著.
2 结果
2.1 心脏收缩-舒张功能 测取各组动物缺血前左室内压峰值(LVSP)及缺血40 min时LVSP，缺血40 min时LVSP与缺血前LVSP的比率(即恢复率)之间无显著性差异. 再灌注120 min时，缺血预处理组和缺血后处理组LVSP的恢复率均高于对照组 (P<0.05)，这两组间无明显差异(Tab 1). 缺血40 min时，缺血预处理组±dp/dtmax的恢复率均高于其他组(P<0.05)，而对照组与后处理组间无显著差异. 再灌注120 min时，缺血预处理组, 缺血后处理组±dp/dtmax的恢复率均高于对照组 (P<0.05)，且两处理组间无显著差异(Tab 1).
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2.2 心肌梗死范围 缺血预处理和缺血后处理组心肌梗死范围分别较对照组减小45%和53%(P<0.01)，且两组间无显著性差异(P>0.05,Tab 2).
表 1 不同处理组心肌缺血、再灌注时的LVSP,±dp/dtmax及恢复率
Tab 1 Resumptive ratio of LVSP,±dp/dtmax among each groups(n=8, X±s )
Groups
LVSP
±dp/dtmax
HR(beats.min-1)
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BI
I 40 min/BI
R 120 min/ BI
BI
I 40 min/BI
R 120 min/BI
BI
I 40 min
R 120 min
(mmHg)
%
%
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( mmHg/s)
%
%
Control
126±15
79.7±12.1
60.7±4.8
4813±959
58.6±16.2
56.4±10.9
234±23
211±24
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150±28
-3851±947
57.3±24.7
59.4±14.7
IP
140±26
84.7±8.9
84.3±7.9a
4988±908
80.5±11.8a
76.6±13.7a
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242±20
227±20
196±17a
-3824±821
78.4±8.8a
77.9±12.7a
HP
126±15
85.1±6.5
83.7±8.9a
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4372±482
65.9±6.3
79.8±12.1a
231±16
222±18
184±13a
-3242±312
57.1±15.7
78.2±15.8a
1. aP<0.05 vs control groups; 2. the upper line are +dp/dtmax，the lower line are -dp/dtmax; 3. IPBI:before ischemia; I 40 min:40 min after ischemia;R 120 min:120 min after reperfusion. IP:ischemia preconditioning;HP:Hypozic postconditioning. 表 2 不同处理组心肌缺血-再灌注120 min后心肌梗死范围比较
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Tab 2 Comparison of infarct size among each groups(n=8,X±s )
Group
Weight of ischemic
size (mg)
Weight of necrosis
size (mg)
Infarct size
(%)
Control
1216.7±103.27
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323.33±75.80
26.67±6.66
IP
1166.67±194.07
174.16±77.87
14.71±6.03b
HP
1370.83± 191.32
165.00±60.24
12.47±5.38b
1.bP<0.01 vs control group. 2. IP,HP same as Tab 1. 2.3 缺血及再灌注过程中心律失常发生情况 对照组3只兔子分别发生严重室颤及室扑，均发生于再灌注早期，电除颤后其中1只死亡. 缺血后处理组有1例在缺血12 min时出现心脏停跳，经心脏按压后恢复. 此外，各组中还均有不同程度的非致死性心律失常(如室速，早搏或二联律等)，在再灌注的过程中自行恢复，其发生率亦以对照组更高(Fig 1).
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图 1 兔缺血再灌注过程中各组心律失常发生次数
Fig 1 Arrhythmia occurrence times during ischemia-reperfusion in each groups
3 讨论
近年来随着临床冠脉内溶栓、PTCA及冠脉搭桥等治疗方法的广泛应用，心肌再灌注损伤愈来愈引起心血管病专科医生的重视. 由于冠心患者已经发生心肌缺血，缺血前预处理的应用受到一定的限制. 针对已缺血心肌，设法减轻再灌注损伤，无疑具有重要的临床意义.
本实验发现，缺血后处理与缺血预处理相似，可以缩小心肌梗死范围，加快心肌收缩功能恢复，特别是明显降低再灌注早期心律失常发生率，对缺血心肌细胞具有明显的保护作用. 值得注意的是，有研究认为IP引起腺苷一过性释放增加是发挥其心肌保护作用的一个重要因素[4-7]. 我们的实验表明，开始再灌注时给予腺苷治疗不能发挥保护作用,提示缺血后处理的保护作用可能主要不是通过腺苷途径发挥作用. 已知再灌注时氧自由基爆发产生是造成缺血再灌注损伤的重要原因. 有资料表明，再灌注早期氧应激刺激可改变肌浆网和肌纤维膜上的一些离子转运蛋白的活性，导致细胞内钙超载，肌浆网波动性释放Ca2+和细胞膜电位发生致心律失常性波动[8]. 而早期再灌注时产生的大量自由基可能引起膜磷脂或蛋白质氧化，导致钾钙离子通道的功能失调及细胞内酶的泄漏，使心脏的易损性增加. 高峰等在离体培养大鼠心肌细胞缺氧-复氧实验中观察到，SOD和一氧化氮合酶抑制剂(L-NA)可减轻缺氧心肌的复氧损伤，提高心肌细胞存活率[2]. 本实验采用缺血后，反复短暂的预再灌在某种意义上相当于有控制的缓慢复氧，可减少突然复氧时氧自由基的爆发产生，或通过刺激体内抗氧化剂和自由基清除剂的释放而发挥保护作用. 有动物实验证实，缓慢再灌注(缓慢松开微米缩窄器)比突然再灌注(突然解除动脉夹)的室颤发生率低[9]，这可能与本实验的缺血后处理在本质上相似. 临床上治疗急性心肌缺血与动物实验相比，不易发生再灌注心律失常，可能与临床的溶栓治疗均属缓慢再灌注. 反复短暂的预再灌与缓慢再灌注很可能具有相同或相似的作用途径. 但其确切保护作用的机制尚需进一步研究.
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基金项目:军队留学回国人员科研启动基金(98H019)
作者简介:陶 凌(1974-),女(汉族), 安徽省合肥市人. 1997年级该校附属西京医院老年病科心血管专业硕士生(导师李 源,高 峰). Tel.(029)3375243(O)
陶凌(第四军医大学：西京医院老年病科，陕西 西安 710033陕西 西安 710033)
李源(第四军医大学：西京医院老年病科，陕西 西安 710033陕西 西安 710033)
高峰(第四军医大学：基础部生理学教研室,陕西 西安 710033)
王跃民(第四军医大学：基础部生理学教研室,陕西 西安 710033)
龚卫琴(第四军医大学：西京医院老年病科，陕西 西安 710033陕西 西安 710033)
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参考文献:
[1] Murry CE, Jennings RB, Reimer KA et al. Preconditioning with ischemia: A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J]. Circulation, 1986;74(5):1124-1136.
[2] 高 峰，Yan WL, Geng YJ et al. “缺氧后处理”对大鼠缺氧-复氧心室肌细胞的保护作用[J]. 心功能杂志，1999；11(4)：241-243.
[3] 胡 萍，尤家禄，罗 正. 大鼠心肌灌注损伤模型[J]. 湖南医学院学报,1986;11(1):15-17.
[4] Wikstrom BG, Ronquist G, Waldenstrom A et al. Dynamics of myocardial metabolism in the preconditioned porcine heart studied using continuous microdialysis[J]. Eur Heart J,1995;16(4):563-569.
, 百拇医药
[5] 陈 健，张钧华，林 静et al. 缺血预处理限制心肌梗死范围的作用与腺苷受体的关系[J]. 中国介入心脏病学杂志，1995；3(4)：174-175.
[6] 陈 健，张钧华，林静et al. 缺血预处理改善心脏收缩功能的效应与腺苷受体关系的研究[J]. 中华心血管病杂志，1996；24(6)：449-451.
[7] Cohen MV, Liu GS, Downey JM. Preconditioning causes improved wall motion as well as smaller infarcts after transient coronary occlusion in rabbits[J]. Circulation,1991;84(6):341-349.
[8] 臧益民，朱妙章. 冠状循环生理与临床的关系[M]. 见臧益民，朱妙章. 临床心血管生理学及其进展，1993:136-147.
[9] Cave AC, Collis CS, Downey JM et al. Improved functional recovery by ischemic preconditioning is not mediated by adenosine in the globally ischemic isolated rat heart[J]. Cardiovasc Res,1993;27(3):663-670., 百拇医药