环磷酰胺对大鼠脑缺血再灌流损伤的免疫保护
张光运 冯幼启 王洪典 万琪 吴中亮
摘 要:目的 观察免疫抑制剂对脑缺血再灌流损伤的影响及可能作用机制. 方法 采用4-VO法制作大鼠脑缺血再灌流损伤模型，观察环磷酰胺预治疗大鼠外周血白细胞数，海马CA1 区的计量病理,海马区丙二醛含量和Na+, K+-ATP酶活性的变化. 结果 与对照组比较，预治疗组大鼠外周血白细胞数明显降低. CA1 区正常神经元计数增加,海马区Na+, K+-ATP酶活性升高而MDA含量明显减低. 结论 环磷酰胺可减轻大鼠脑缺血再灌流损伤，其可能机制为减少了白细胞向缺血区的趋化渗出、减轻了神经细胞膜的脂质过氧化及提高缺血组织Na+, K+-ATP酶的活性.
关键词：脑；缺血再灌流损伤；环磷酰胺
, 百拇医药 0 引言
海马CA1 区迟发性神经元坏死(delayed neuronal death,DND)是全脑缺血再灌流损伤的重要病理改变，与之相关的钙超载、自由基致脂质过氧化和兴奋性氨基酸神经毒的研究已有重大进展，但还存在许多问题[1]. 免疫系统参与全脑缺血再灌流损伤的病理过程渐引起人们的关注[2], 但其与海马CA1 区DND间的关系尚未阐明. 我们从免疫抑制剂对DND的病理过程的影响入手，初步观察了环磷酰胺对DND的影响，并对其机制进行初步探讨.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠51只，体质量(250±20)g(由上海实验动物研究所提供). 自然喂养，分为假手术组、对照组和环磷酰胺预治疗组. 计量病理观察每组6只大鼠；MDA测定每组5只；Na+, K+-ATP酶测定每组6只. 环磷酰胺预治疗组按体表面积换算公式，按70 kg体质量的人每日环磷酰胺用量(2 mg*kg-1)与200 g大鼠换算[3], 每次用量为12.6 mg，于缺血前6 d给药，1次/d；对照组给予等体积的生理盐水，均取腹腔注射；假手术组不作干预治疗.
, 百拇医药
1.1.2 试剂及仪器 环磷酰胺(上海华联制药公司)，Na+, K+-ATP酶试剂盒及MDA测试盒(南京建成生物工程研究所). 显微测微尺(上海医学光学仪器厂).
1.2 方法
1.2.1 全脑缺血再灌流模型的建立 采用改良的Pulsinelli法进行[4], 脑缺血再灌大鼠经电凝以永久闭塞双侧椎动脉，24 h后短暂关闭双侧颈总动脉20 min，然后使其再通. 假手术大鼠仅暴露双侧颈椎翼小孔和颈总动脉，不作关闭手术.
1.2.2 大鼠外周血白细胞计数测定 采用割尾法取20 μL，加入0.38 mL的白细胞稀释液内，立即取10 μL加至血细胞计数板上，在低倍显微镜下计数白细胞. 给药前、后各计数2次，取平均值.
1.2.3 海马CA1 区计量病理观察 脑缺血后第7日处死大鼠，40 g*L-1多聚甲醛灌注固定后取脑，行普通光镜标本处理，HE染色. 观察海马CA1区病理改变，用显微测微尺测量1.0 mm区内正常神经元数.
, 百拇医药
1.2.4 Na+,K+-ATP酶的活性测定 脑缺血后1h立即断头取脑，4℃以下暴露分离海马区脑组织，测质量后按1∶50(g*mL-1)，用冷生理盐水匀浆，离心后取上清. 按ATP酶试剂盒要求测定Na+, K+-ATP酶活性. 其活性单位为每小时每毫克组织蛋白催化ATP所产生的无机磷含量.
1.2.5 脂质过氧化产物MDA的测定 脑缺血后24 h立即断头处死大鼠，取海马组织，按1∶20(g*mL-1)用冷生理盐水匀浆，25 000 g离心20 min，离心后取上清待测. 按MDA测试盒说明进行测定. 根据标准管检测结果计算样品中TBA反应物含量(μmol*L-1).
2 结果
2.1 各组海马区普通病理观察结果 假手术组海马CA1 区神经元无坏死或脱失，呈“鹰眼”样排列；对照组可见CA1 区神经元大部分呈现坏死或脱失，胞质嗜酸性，胞核固缩或溶解，有小胶质细胞增生；预治疗组可见散在小部分坏死.
, 百拇医药
2.2 各组各项检测指标结果 如Tab 1所示.
表 1 大鼠各项检测指标结果
Tab 1 Results of examinatorial index in rats(n=16,X±s)
Groups
Number of white cell
pre operation
postoperation
Number of normal neuron
Na+,K+-ATP enzyme
, 百拇医药
MDA
False operation
17.12±2.3
17.1±2.77
175.3±7.9
0.588±0.014
1.43±0.62
Control
16.88±2.81
16.48±2.94
12.2±3.0
0.158±0.03
, 百拇医药
5.06±1.33
Cyclophosphamide pre-treatment
16.06±2.7
2.96±1.79b
68.3±3.6b
0.267±0.017b
2.37±0.5b
bP<0.01 vs control.3 讨论
实验研究表明，白细胞及其他免疫成分参与了全脑缺血再灌流损伤的病理过程. 全脑缺血后24 h脑实质中白细胞明显增多[5]. 粘附分子及细胞因子如ICAM-1，lL-1. TNF等分别介导了白细胞向缺血区趋化、渗出[6-8]. 活化渗出的中性粒细胞通过:①溶酶体酶的释放，引起存活的组织蛋白分解，导致进一步的组织坏死和炎症反应；②将氧分子转化为高反应性自由基，促进细胞损伤或死亡；③合成并释放如白三稀等脂酸氧合产物和磷酸基胆碱，血小板活化因子等，促进血管收缩及毛细血管的通透性增加[9,10]. 减少血循环中的白细胞可以使脑缺血后脑电生理功能较好地保存[2]. 本实验结果显示，脑缺血前预治疗用环磷酰胺对缺血性海马CA1 区神经元DND具有部分保护作用.
, 百拇医药
环磷酰胺系一种公认的烷化剂类免疫抑制剂，其对脑缺血性海马CA1 区DND的部分保护作用的机制可能有以下几方面.
3.1 减少缺血区渗出的白细胞 通过抑制细胞增殖，非特异性杀伤抗原敏感性小淋巴细胞作用，减少了血循环中向缺血区渗出的白细胞数.
3.2 增加Na+, K+-ATP酶的活性 脑缺血后能量代谢障碍可导致神经细胞膜上的Na+, K+-ATP酶活性抑制，使细胞的离子内环境紊乱，造成细胞肿胀死亡. 用环磷酰胺预治疗可明显减轻大鼠心、肾、脑组织中的ATP及高能磷酸化合物总量的缺血性排空，提高组织中高能物质的总量[11]. 预治疗组的Na+, K+-ATP酶活性较对照组明显增高，与环磷酰胺提高组织中高能物质的总量相一致.
, 百拇医药
3.3 减轻自由基引起的脂质过氧化反应 脑缺血期及再灌流期，脑内自由基的形成、堆集是引起脑组织病理损害的重要原因. 实验表明，环磷酰胺预治疗可减少肾缺血组织内的自由基生成[12]. 本实验结果显示，对照组脑缺血再灌流期海马脑组织中MDA明显增加，提示脂质过氧化反应发生. 而预治疗组海马组织中MDA则较对照组明显减少. 环磷酰胺对自由基的清除作用，与减少了白细胞源自由基生成及由能量代谢障碍产生的自由基有关.
环磷酰胺是否影响了细胞因子和粘附分子等免疫成分，尚需进一步的实验研究.
作者简介：张光运(1967-),男(汉族)，河南省辉县人. 硕士，住院医师. Tel.(029)3375369
张光运(第四军医大学西京医院神经内科,陕西 西安 710033)
冯幼启(第四军医大学西京医院神经内科,陕西 西安 710033)
, http://www.100md.com
王洪典(第四军医大学西京医院神经内科,陕西 西安 710033)
万琪(第四军医大学西京医院神经内科,陕西 西安 710033)
吴中亮(第四军医大学西京医院神经内科,陕西 西安 710033)
参考文献:
[1] Abe K, Aoki M,Kawagoe J et al. Ischemic delayed neuronal death: A mitochondrial hypothesis[J]. Stroke,1995；26(8):1478-1489.
[2] Vasthare US, Heinel LA, Rosen wasser RH et al. Leukocyte involvement in cerebral ischemia and reperfusion injury[J]. Surg Neurol,1990;33(2):261 -265.
, 百拇医药
[3] 施新猷. 医用实验动物学[M]. 第1版:陕西科学技术出版社，1989:425.
[4] Schmidt-Kastner R,Paschen W, Ophoff BG et al. A modified four-vessel occlusion model for inducing imcomplete forebrain ischemia in rats[J]. Stroke,1989;20(7):938-946.
[5] 包仕尧,傅 琦,张志琳et al. 白细胞在实验性脑缺血中作用及中药川芎嗪和丹参酚 对其影响的研究[J]. 中国神经精神疾病杂志,1997;23(1):7-10.
[6] Wang XK, Siren AL,Liu Y et al. Upregulation of intercellular adhesion molecules-1(ICAm-1) on brain microvascular endothelial cells in rat ischemic cortex[J]. Mol Brain Res,1994;26(8):61-68.
, 百拇医药
[7] Liu T. Clark R, Yong RR. Tumor necrosis factor in ischemic neurons[J]. Stroke, 1994;25(7):1481-1487.
[8] Liu T, Donnell PC, Youny PR et al. Interleukin-1β mRNA expression in ischemic rat cortex[J]. Stroke,1993;24(11):1746-1751.
[9] Kochanek PM, Hanllenkeck JM. Polymorphonuclear Leukocytes and monocytes/macrophages in the pathogenesis of cerebral ischemia and stroke[J]. Stroke,1992;23(7):1367-1379.
, 百拇医药
[10] Pozzilli C, Lenzi GL, Carolei A et al. Imaging of leukocytic infiltration in human cerebral infarcts[J]. Stroke,1985;16(2):251-255.
[11] Zhu Y，Fan YZ， Dai DZ. Protective effect on ischemic depletion of nucleotide phosphates in heart, brain and kidney by cyclosphosphamide[J]. Chung Kuo Yao Li Hsueh Pao,1993;14(3):285-288.
[12] Tomikawa.S,Akiyama N, Nagao T et al. Warm renal ischemia and reperfusion injury in rat treated with cyclophosphamide and/ orgranulocytecolony-stimulating factor[J]. Transplant Proc, 1993;25(6):3230-3233., 百拇医药
摘 要:目的 观察免疫抑制剂对脑缺血再灌流损伤的影响及可能作用机制. 方法 采用4-VO法制作大鼠脑缺血再灌流损伤模型，观察环磷酰胺预治疗大鼠外周血白细胞数，海马CA1 区的计量病理,海马区丙二醛含量和Na+, K+-ATP酶活性的变化. 结果 与对照组比较，预治疗组大鼠外周血白细胞数明显降低. CA1 区正常神经元计数增加,海马区Na+, K+-ATP酶活性升高而MDA含量明显减低. 结论 环磷酰胺可减轻大鼠脑缺血再灌流损伤，其可能机制为减少了白细胞向缺血区的趋化渗出、减轻了神经细胞膜的脂质过氧化及提高缺血组织Na+, K+-ATP酶的活性.
关键词：脑；缺血再灌流损伤；环磷酰胺
, 百拇医药 0 引言
海马CA1 区迟发性神经元坏死(delayed neuronal death,DND)是全脑缺血再灌流损伤的重要病理改变，与之相关的钙超载、自由基致脂质过氧化和兴奋性氨基酸神经毒的研究已有重大进展，但还存在许多问题[1]. 免疫系统参与全脑缺血再灌流损伤的病理过程渐引起人们的关注[2], 但其与海马CA1 区DND间的关系尚未阐明. 我们从免疫抑制剂对DND的病理过程的影响入手，初步观察了环磷酰胺对DND的影响，并对其机制进行初步探讨.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠51只，体质量(250±20)g(由上海实验动物研究所提供). 自然喂养，分为假手术组、对照组和环磷酰胺预治疗组. 计量病理观察每组6只大鼠；MDA测定每组5只；Na+, K+-ATP酶测定每组6只. 环磷酰胺预治疗组按体表面积换算公式，按70 kg体质量的人每日环磷酰胺用量(2 mg*kg-1)与200 g大鼠换算[3], 每次用量为12.6 mg，于缺血前6 d给药，1次/d；对照组给予等体积的生理盐水，均取腹腔注射；假手术组不作干预治疗.
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1.1.2 试剂及仪器 环磷酰胺(上海华联制药公司)，Na+, K+-ATP酶试剂盒及MDA测试盒(南京建成生物工程研究所). 显微测微尺(上海医学光学仪器厂).
1.2 方法
1.2.1 全脑缺血再灌流模型的建立 采用改良的Pulsinelli法进行[4], 脑缺血再灌大鼠经电凝以永久闭塞双侧椎动脉，24 h后短暂关闭双侧颈总动脉20 min，然后使其再通. 假手术大鼠仅暴露双侧颈椎翼小孔和颈总动脉，不作关闭手术.
1.2.2 大鼠外周血白细胞计数测定 采用割尾法取20 μL，加入0.38 mL的白细胞稀释液内，立即取10 μL加至血细胞计数板上，在低倍显微镜下计数白细胞. 给药前、后各计数2次，取平均值.
1.2.3 海马CA1 区计量病理观察 脑缺血后第7日处死大鼠，40 g*L-1多聚甲醛灌注固定后取脑，行普通光镜标本处理，HE染色. 观察海马CA1区病理改变，用显微测微尺测量1.0 mm区内正常神经元数.
, 百拇医药
1.2.4 Na+,K+-ATP酶的活性测定 脑缺血后1h立即断头取脑，4℃以下暴露分离海马区脑组织，测质量后按1∶50(g*mL-1)，用冷生理盐水匀浆，离心后取上清. 按ATP酶试剂盒要求测定Na+, K+-ATP酶活性. 其活性单位为每小时每毫克组织蛋白催化ATP所产生的无机磷含量.
1.2.5 脂质过氧化产物MDA的测定 脑缺血后24 h立即断头处死大鼠，取海马组织，按1∶20(g*mL-1)用冷生理盐水匀浆，25 000 g离心20 min，离心后取上清待测. 按MDA测试盒说明进行测定. 根据标准管检测结果计算样品中TBA反应物含量(μmol*L-1).
2 结果
2.1 各组海马区普通病理观察结果 假手术组海马CA1 区神经元无坏死或脱失，呈“鹰眼”样排列；对照组可见CA1 区神经元大部分呈现坏死或脱失，胞质嗜酸性，胞核固缩或溶解，有小胶质细胞增生；预治疗组可见散在小部分坏死.
, 百拇医药
2.2 各组各项检测指标结果 如Tab 1所示.
表 1 大鼠各项检测指标结果
Tab 1 Results of examinatorial index in rats(n=16,X±s)
Groups
Number of white cell
pre operation
postoperation
Number of normal neuron
Na+,K+-ATP enzyme
, 百拇医药
MDA
False operation
17.12±2.3
17.1±2.77
175.3±7.9
0.588±0.014
1.43±0.62
Control
16.88±2.81
16.48±2.94
12.2±3.0
0.158±0.03
, 百拇医药
5.06±1.33
Cyclophosphamide pre-treatment
16.06±2.7
2.96±1.79b
68.3±3.6b
0.267±0.017b
2.37±0.5b
bP<0.01 vs control.3 讨论
实验研究表明，白细胞及其他免疫成分参与了全脑缺血再灌流损伤的病理过程. 全脑缺血后24 h脑实质中白细胞明显增多[5]. 粘附分子及细胞因子如ICAM-1，lL-1. TNF等分别介导了白细胞向缺血区趋化、渗出[6-8]. 活化渗出的中性粒细胞通过:①溶酶体酶的释放，引起存活的组织蛋白分解，导致进一步的组织坏死和炎症反应；②将氧分子转化为高反应性自由基，促进细胞损伤或死亡；③合成并释放如白三稀等脂酸氧合产物和磷酸基胆碱，血小板活化因子等，促进血管收缩及毛细血管的通透性增加[9,10]. 减少血循环中的白细胞可以使脑缺血后脑电生理功能较好地保存[2]. 本实验结果显示，脑缺血前预治疗用环磷酰胺对缺血性海马CA1 区神经元DND具有部分保护作用.
, 百拇医药
环磷酰胺系一种公认的烷化剂类免疫抑制剂，其对脑缺血性海马CA1 区DND的部分保护作用的机制可能有以下几方面.
3.1 减少缺血区渗出的白细胞 通过抑制细胞增殖，非特异性杀伤抗原敏感性小淋巴细胞作用，减少了血循环中向缺血区渗出的白细胞数.
3.2 增加Na+, K+-ATP酶的活性 脑缺血后能量代谢障碍可导致神经细胞膜上的Na+, K+-ATP酶活性抑制，使细胞的离子内环境紊乱，造成细胞肿胀死亡. 用环磷酰胺预治疗可明显减轻大鼠心、肾、脑组织中的ATP及高能磷酸化合物总量的缺血性排空，提高组织中高能物质的总量[11]. 预治疗组的Na+, K+-ATP酶活性较对照组明显增高，与环磷酰胺提高组织中高能物质的总量相一致.
, 百拇医药
3.3 减轻自由基引起的脂质过氧化反应 脑缺血期及再灌流期，脑内自由基的形成、堆集是引起脑组织病理损害的重要原因. 实验表明，环磷酰胺预治疗可减少肾缺血组织内的自由基生成[12]. 本实验结果显示，对照组脑缺血再灌流期海马脑组织中MDA明显增加，提示脂质过氧化反应发生. 而预治疗组海马组织中MDA则较对照组明显减少. 环磷酰胺对自由基的清除作用，与减少了白细胞源自由基生成及由能量代谢障碍产生的自由基有关.
环磷酰胺是否影响了细胞因子和粘附分子等免疫成分，尚需进一步的实验研究.
作者简介：张光运(1967-),男(汉族)，河南省辉县人. 硕士，住院医师. Tel.(029)3375369
张光运(第四军医大学西京医院神经内科,陕西 西安 710033)
冯幼启(第四军医大学西京医院神经内科,陕西 西安 710033)
, http://www.100md.com
王洪典(第四军医大学西京医院神经内科,陕西 西安 710033)
万琪(第四军医大学西京医院神经内科,陕西 西安 710033)
吴中亮(第四军医大学西京医院神经内科,陕西 西安 710033)
参考文献:
[1] Abe K, Aoki M,Kawagoe J et al. Ischemic delayed neuronal death: A mitochondrial hypothesis[J]. Stroke,1995；26(8):1478-1489.
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[6] Wang XK, Siren AL,Liu Y et al. Upregulation of intercellular adhesion molecules-1(ICAm-1) on brain microvascular endothelial cells in rat ischemic cortex[J]. Mol Brain Res,1994;26(8):61-68.
, 百拇医药
[7] Liu T. Clark R, Yong RR. Tumor necrosis factor in ischemic neurons[J]. Stroke, 1994;25(7):1481-1487.
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