急性坏死性胰腺炎胰腺腺泡细胞功能变化的实验研究
急性坏死性胰腺炎胰腺腺泡细胞功能变化的实验研究
余枭 张圣道 韩天权 汤耀卿 雷若庆 陈胜 王建承 姜志宏 夏宗勤 蒋建强
摘要 目的：探讨急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)胰腺腺泡细胞氨基酸摄取、酶蛋白合成及细胞的分泌功能情况。方法：采用5%牛磺胆酸钠胰管逆行注射制备ANP动物模型。SD雄性大鼠70只，随机分为模型组和对照组。采用L-3H-苯丙氨酸作为同位素示踪剂和放射自显影技术观察胰腺腺泡细胞氨基酸摄取、酶蛋白合成和细胞外分泌功能。结果：呈点状出血坏死病理学改变的模型组ANP胰腺腺泡细胞氨基酸摄取放射性含量为(186±17)dpm/mg，对照组为(145±12)dpm/mg(P>0.05)；对照组酶蛋白合成的放射性含量在30、60、90min时分别为(2281±1662)dpm/mg、(3017±978)dpm/mg和(2544±1108)dpm/mg，而模型组分别为(2273±627)dpm/mg、(2840±828)dpm/mg和(2628±604)dpm/mg(P>0.05)；放射自显影图像提示模型组腺泡细胞间质中可见大量酶原颗粒积聚，而对照组细胞间质中未观察到酶原颗粒。结论：ANP呈点状出血坏死时胰腺腺泡细胞氨基酸摄取及酶蛋白合成功能无下降，但腺泡细胞分泌途径发生了改变，出现了底膜及侧膜的异位分泌。
, 百拇医药
关键词：胰腺炎 同位素标记 放射自显影术
近来，不少学者认为急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis,ANP)时胰腺腺泡细胞的氨基酸摄取、酶蛋白合成及分泌功能已丧失或部分丧失，临床使用抑制胰腺腺泡细胞外分泌功能的治疗已意义不大[1]。本研究通过ANP实验动物模型进一步探讨ANP时胰腺腺泡细胞功能的变化。
材料与方法
一、实验材料
实验动物：SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠70只，体重160～180 g，常规喂养，实验前12h禁食，自由饮水；牛磺胆酸钠(sodium taurocholate)：美国Sigma公司产品；L-3H-苯丙氨酸：Amersham公司产品；核乳胶：北京中科院原子能研究所提供。
, 百拇医药
二、实验方法
1.建立大鼠ANP动物模型[2]：将大鼠分为对照组和ANP模型组。造模前半小时行右颈静脉插管，用戊巴比妥钠注射液腹内注射(0.1ml/100g体重),腹正中切口,进入腹腔，找到胆总管及胰管,胰管内插管后缓慢匀速注入5%牛磺胆酸钠(0.1ml/100g体重)。实验模型均经肉眼观察、光学显微镜及电子显微镜检查证实符合ANP实验动物模型。对照组操作同模型组，胰管内缓慢匀速注入等量生理盐水作为对照。
2.胰腺腺泡细胞摄取氨基酸放射性含量测定[3]：造模后，颈静脉10min内匀速缓慢注入L-3H-苯丙氨酸10μCi，30min后，颈椎脱位法处死大鼠，取胰腺组织，用匀浆缓冲液漂洗2次，滤纸吸干组织的水份，用光量电子天平称胰腺组织的重量(mg)，加入4ml匀浆缓冲液，冰浴中内切式匀浆器匀浆(5000r/min)，再转移至Tefflon匀浆器中匀浆，上下10次，取3ml匀浆液离心(150g,15min,4℃)，取上清液2ml，再次离心(4000g,15min,4℃)，再取其上清液0.5ml加入盛有6ml0.6%(0.6/100)二甲苯乙二醇甲醚(2-4”-t-butylphneyl-5-(4”-biphenyly)-1.3,4-Oxadiazole,Bu-PBD)闪烁杯中，测定其放射性含量(dpm，每分钟实际衰变次数)，计算每毫克胰腺组织中摄取的氨基酸放射性含量(dpm/mg)。
, 百拇医药
3.胰腺腺泡细胞合成酶蛋白放射性含量测定[3]：造模后，颈静脉10min内匀速缓慢注入L-3H-苯丙氨酸75μCi，分别于30、60、90、120、150min五个时点颈椎脱位法处死大鼠取胰腺组织(每个时点每组5只)，胰腺组织提取后匀浆液的制备过程同方法(2)。离心匀浆液(150g,15min,4℃)，取其上清液2ml，加入等量20%三氯醋酸，混匀后低温处理1h(4℃),再次离心(4000g,15min,4℃)。取沉淀部分并用光量电子天平称重，取50mg酶蛋白于闪烁杯中，用酸消化法消化组织后向闪烁杯中加入0.6%Bu-PBD闪烁液10ml，测定其放射性含量(dpm)，计算每毫克胰腺组织合成的酶蛋白放射性含量(dpm/mg)。
4.采用放射自显影技术观察胰腺腺泡细胞酶蛋白分泌[3]：造模后，颈静脉10min内匀速缓慢注入L-3H-苯丙氨酸75μCi，观察2h后，颈椎脱位法处死大鼠，取胰腺标本，10%(1/10)中性福尔马林液固定，做病理学切片、脱蜡、脱水、暗室中涂核乳胶，曝光4周后显影、定影、苏木素-伊红染色、封片，采用计算机图像分析技术在640倍光学显微镜下观察胰腺腺泡细胞内外酶原颗粒的分布。
, 百拇医药
5.统计学处理：采用t检验。
结果
1.胰腺腺泡细胞摄取的氨基酸放射性含量比较(表1)。
两组间比较差异无显著意义(P>0.05)，表明ANP时胰腺腺泡细胞摄取氨基酸的能力无改变。
2.胰腺腺泡细胞合成的酶蛋白放射性含量比较(表2，图1)。
表1 急性坏死性胰腺炎模型组与对照组的胰腺腺泡细胞
摄取氨基酸放射性含量比较(X±s)
组别
标本数
dpm/mg
, http://www.100md.com
t
P
对照组
5
186±8
2.21
>0.05
模型组
5
145±6
表2 急性坏死性胰腺炎模型组与对照组的胰腺腺泡细胞
合成的酶蛋白放射性含量不同时间比较(X±s,dpm/mg)
, 百拇医药
组别
鼠数
时间(min)
30
60
90
120
150
模型组
5
2273±627
2840±828
2628±604
, 百拇医药
3329±504
2338±495
对照组
5
2281±1662
3017±978
2544±1108
1956±620
1579±362
P值
>0.05
>0.05
, 百拇医药
>0.05
<0.05
<0.05
*表示该时点两组比较P>0.05；**表示该时点两组比较P<0.05
图1 胰腺腺泡细胞合成的酶蛋白放射性含量变化曲线比较
ANP模型组与对照组在30、60、90min时的曲线变化基本一致，各点间差异无显著意义(P>0.05)，表明ANP时其胰腺腺泡细胞合成酶蛋白的能力无下降，而120、150min时模型组反而显著高于对照组(P<0.05)。
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图2 对照组、酶原颗粒分布于细胞内,间质中未见酶原颗粒HE染色 ×640
图3 模型组,酶原颗粒分布于细胞内,同时，间质中亦见较多酶原颗粒积聚,箭头所示 HE染色 ×640
3.胰腺腺泡细胞分泌功能(图2，3)。
照片中可见：对照组酶原颗粒主要分布于细胞内，间质中未见到酶原颗粒；而ANP模型组中酶原颗粒分布于细胞内，同时，间质中亦可见大量酶原颗粒积聚。
讨论
急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)时胰腺腺泡细胞氨基酸摄取、酶蛋白合成及分泌功能是否有改变？一直是争论的热点问题。
, http://www.100md.com
在本研究中我们采用L-3H-苯丙氨酸作为示踪剂，采用放射自显影技术研究了ANP时胰腺腺泡细胞氨基酸摄取、酶蛋白合成与分泌功能的变化。结果发现：呈点状出血坏死的ANP胰腺腺泡细胞摄取血液中氨基酸的能力无变化，与Saluja等[3]通过雨蛙素所诱导的急性水肿性胰腺炎动物实验模型所得结果一致。他们动态观察了ANP在30、60、90、120、150min时胰腺腺泡细胞酶蛋白合成和分泌的变化。模型组与对照组在0～90min内两者曲线变化基本一致，表明模型组胰腺腺泡细胞酶蛋白合成与对照组相比无明显改变，并且合成的高峰期均在90min这一时点，这与以往的文献报道一致[3]，进一步证实了Koike等[4]ANP时胰腺腺泡细胞酶蛋白合成功能无改变的观点。而在120、150min时模型组显著高于对照组，结合放射自显影照片分析主要是因为ANP时胰腺腺泡细胞出现了底膜及侧膜的异位分泌，导致大量酶原颗粒积聚于细胞间质，潴留于胰腺组织内之故。
我们在研究中发现：ANP模型组酶原颗粒除了分布于细胞内以外，细胞间质中也观察到多个酶原颗粒的积聚。这可能是由于ANP时胰腺腺泡细胞膜的结构发生了改变，导致除正常途径的顶膜向胰管内分泌外，还出现了底膜及侧膜向间质的异位分泌，进一步证实了Castillo[5]及Sheele[6]等的推测。由于细胞内外环境的不同，积聚于细胞间质的酶原颗粒中的酶原很可能被激活，从而对细胞间质及腺泡细胞本身造成损害，使ANP进一步恶化。
, 百拇医药
我们体会呈点状出血坏死的ANP，其胰腺腺泡细胞摄取氨基酸、合成酶蛋白的能力无改变，而腺泡细胞分泌途径发生了改变，出现了除了顶膜向胰管内的正常途径分泌以外，还存在底膜及侧膜向间质的异位分泌，早期采用抑制腺泡细胞分泌的措施，如禁食、胃肠减压及药物如奥曲肽治疗ANP应该有一定效果。这些措施的综合应用在临床实践中确实也取得了令人满意的结果。
作者单位：余枭(上海第二医科大学附属瑞金医院外科 200025)
张圣道(上海第二医科大学附属瑞金医院外科 200025)
韩天权(上海第二医科大学附属瑞金医院外科 200025)
汤耀卿(上海第二医科大学附属瑞金医院外科 200025)
雷若庆(上海第二医科大学附属瑞金医院外科 200025)
, 百拇医药
陈胜(上海第二医科大学附属瑞金医院外科 200025)
王建承(上海第二医科大学附属瑞金医院外科 200025)
姜志宏(上海第二医科大学附属瑞金医院外科 200025)
夏宗勤(上海第二医科大学核医学实验室)
蒋建强(上海医药工业研究院)
参考文献
[1]David WR， Warshaw AL. Acute pancreatitis.In: Morris PJ and RA Malt.Oxford textbook of surgery (Vol 1). New York: Raven,1993.275-300.
, 百拇医药
[2]Lankisch PG,Ihse I. Bile-induced acute experimental pancreatitis,Scand J Gastroenterol，1987，22:257-260.
[3]Saluja A, Saito I,Saluja M,et al.In vivo rat pancreatic acinar cell function during supramaximal stimulation with caerulein.Am J Physiol, 1985,249: G709-710.
[4]Koike H, Steer ML， Meldolesi J. Pancreatic effects of ethionine：blockade of exocytosis and appearance of crinophagy and autophagy precede cellular necrosis.Am J Physiol，1982,242：G297-307.
, 百拇医药
[5]Castillo CF, Schmidt J, Warshaw AL， et al.Interstitial protease activation is the central event in progression to necrotizing pancreatitis. Surgery，1994,116：497-504.
[6]Scheele G, Alter G，Kern H. Exocytosis occurs at the lateral plasma membrane of the pancreatic acinar cell during supramaximal secretagogue stimulation.Gastroenterology,1987, 92:345-353., http://www.100md.com
余枭 张圣道 韩天权 汤耀卿 雷若庆 陈胜 王建承 姜志宏 夏宗勤 蒋建强
摘要 目的：探讨急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)胰腺腺泡细胞氨基酸摄取、酶蛋白合成及细胞的分泌功能情况。方法：采用5%牛磺胆酸钠胰管逆行注射制备ANP动物模型。SD雄性大鼠70只，随机分为模型组和对照组。采用L-3H-苯丙氨酸作为同位素示踪剂和放射自显影技术观察胰腺腺泡细胞氨基酸摄取、酶蛋白合成和细胞外分泌功能。结果：呈点状出血坏死病理学改变的模型组ANP胰腺腺泡细胞氨基酸摄取放射性含量为(186±17)dpm/mg，对照组为(145±12)dpm/mg(P>0.05)；对照组酶蛋白合成的放射性含量在30、60、90min时分别为(2281±1662)dpm/mg、(3017±978)dpm/mg和(2544±1108)dpm/mg，而模型组分别为(2273±627)dpm/mg、(2840±828)dpm/mg和(2628±604)dpm/mg(P>0.05)；放射自显影图像提示模型组腺泡细胞间质中可见大量酶原颗粒积聚，而对照组细胞间质中未观察到酶原颗粒。结论：ANP呈点状出血坏死时胰腺腺泡细胞氨基酸摄取及酶蛋白合成功能无下降，但腺泡细胞分泌途径发生了改变，出现了底膜及侧膜的异位分泌。
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关键词：胰腺炎 同位素标记 放射自显影术
近来，不少学者认为急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis,ANP)时胰腺腺泡细胞的氨基酸摄取、酶蛋白合成及分泌功能已丧失或部分丧失，临床使用抑制胰腺腺泡细胞外分泌功能的治疗已意义不大[1]。本研究通过ANP实验动物模型进一步探讨ANP时胰腺腺泡细胞功能的变化。
材料与方法
一、实验材料
实验动物：SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠70只，体重160～180 g，常规喂养，实验前12h禁食，自由饮水；牛磺胆酸钠(sodium taurocholate)：美国Sigma公司产品；L-3H-苯丙氨酸：Amersham公司产品；核乳胶：北京中科院原子能研究所提供。
, 百拇医药
二、实验方法
1.建立大鼠ANP动物模型[2]：将大鼠分为对照组和ANP模型组。造模前半小时行右颈静脉插管，用戊巴比妥钠注射液腹内注射(0.1ml/100g体重),腹正中切口,进入腹腔，找到胆总管及胰管,胰管内插管后缓慢匀速注入5%牛磺胆酸钠(0.1ml/100g体重)。实验模型均经肉眼观察、光学显微镜及电子显微镜检查证实符合ANP实验动物模型。对照组操作同模型组，胰管内缓慢匀速注入等量生理盐水作为对照。
2.胰腺腺泡细胞摄取氨基酸放射性含量测定[3]：造模后，颈静脉10min内匀速缓慢注入L-3H-苯丙氨酸10μCi，30min后，颈椎脱位法处死大鼠，取胰腺组织，用匀浆缓冲液漂洗2次，滤纸吸干组织的水份，用光量电子天平称胰腺组织的重量(mg)，加入4ml匀浆缓冲液，冰浴中内切式匀浆器匀浆(5000r/min)，再转移至Tefflon匀浆器中匀浆，上下10次，取3ml匀浆液离心(150g,15min,4℃)，取上清液2ml，再次离心(4000g,15min,4℃)，再取其上清液0.5ml加入盛有6ml0.6%(0.6/100)二甲苯乙二醇甲醚(2-4”-t-butylphneyl-5-(4”-biphenyly)-1.3,4-Oxadiazole,Bu-PBD)闪烁杯中，测定其放射性含量(dpm，每分钟实际衰变次数)，计算每毫克胰腺组织中摄取的氨基酸放射性含量(dpm/mg)。
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3.胰腺腺泡细胞合成酶蛋白放射性含量测定[3]：造模后，颈静脉10min内匀速缓慢注入L-3H-苯丙氨酸75μCi，分别于30、60、90、120、150min五个时点颈椎脱位法处死大鼠取胰腺组织(每个时点每组5只)，胰腺组织提取后匀浆液的制备过程同方法(2)。离心匀浆液(150g,15min,4℃)，取其上清液2ml，加入等量20%三氯醋酸，混匀后低温处理1h(4℃),再次离心(4000g,15min,4℃)。取沉淀部分并用光量电子天平称重，取50mg酶蛋白于闪烁杯中，用酸消化法消化组织后向闪烁杯中加入0.6%Bu-PBD闪烁液10ml，测定其放射性含量(dpm)，计算每毫克胰腺组织合成的酶蛋白放射性含量(dpm/mg)。
4.采用放射自显影技术观察胰腺腺泡细胞酶蛋白分泌[3]：造模后，颈静脉10min内匀速缓慢注入L-3H-苯丙氨酸75μCi，观察2h后，颈椎脱位法处死大鼠，取胰腺标本，10%(1/10)中性福尔马林液固定，做病理学切片、脱蜡、脱水、暗室中涂核乳胶，曝光4周后显影、定影、苏木素-伊红染色、封片，采用计算机图像分析技术在640倍光学显微镜下观察胰腺腺泡细胞内外酶原颗粒的分布。
, 百拇医药
5.统计学处理：采用t检验。
结果
1.胰腺腺泡细胞摄取的氨基酸放射性含量比较(表1)。
两组间比较差异无显著意义(P>0.05)，表明ANP时胰腺腺泡细胞摄取氨基酸的能力无改变。
2.胰腺腺泡细胞合成的酶蛋白放射性含量比较(表2，图1)。
表1 急性坏死性胰腺炎模型组与对照组的胰腺腺泡细胞
摄取氨基酸放射性含量比较(X±s)
组别
标本数
dpm/mg
, http://www.100md.com
t
P
对照组
5
186±8
2.21
>0.05
模型组
5
145±6
表2 急性坏死性胰腺炎模型组与对照组的胰腺腺泡细胞
合成的酶蛋白放射性含量不同时间比较(X±s,dpm/mg)
, 百拇医药
组别
鼠数
时间(min)
30
60
90
120
150
模型组
5
2273±627
2840±828
2628±604
, 百拇医药
3329±504
2338±495
对照组
5
2281±1662
3017±978
2544±1108
1956±620
1579±362
P值
>0.05
>0.05
, 百拇医药
>0.05
<0.05
<0.05
*表示该时点两组比较P>0.05；**表示该时点两组比较P<0.05
图1 胰腺腺泡细胞合成的酶蛋白放射性含量变化曲线比较
ANP模型组与对照组在30、60、90min时的曲线变化基本一致，各点间差异无显著意义(P>0.05)，表明ANP时其胰腺腺泡细胞合成酶蛋白的能力无下降，而120、150min时模型组反而显著高于对照组(P<0.05)。
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图2 对照组、酶原颗粒分布于细胞内,间质中未见酶原颗粒HE染色 ×640
图3 模型组,酶原颗粒分布于细胞内,同时，间质中亦见较多酶原颗粒积聚,箭头所示 HE染色 ×640
3.胰腺腺泡细胞分泌功能(图2，3)。
照片中可见：对照组酶原颗粒主要分布于细胞内，间质中未见到酶原颗粒；而ANP模型组中酶原颗粒分布于细胞内，同时，间质中亦可见大量酶原颗粒积聚。
讨论
急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)时胰腺腺泡细胞氨基酸摄取、酶蛋白合成及分泌功能是否有改变？一直是争论的热点问题。
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在本研究中我们采用L-3H-苯丙氨酸作为示踪剂，采用放射自显影技术研究了ANP时胰腺腺泡细胞氨基酸摄取、酶蛋白合成与分泌功能的变化。结果发现：呈点状出血坏死的ANP胰腺腺泡细胞摄取血液中氨基酸的能力无变化，与Saluja等[3]通过雨蛙素所诱导的急性水肿性胰腺炎动物实验模型所得结果一致。他们动态观察了ANP在30、60、90、120、150min时胰腺腺泡细胞酶蛋白合成和分泌的变化。模型组与对照组在0～90min内两者曲线变化基本一致，表明模型组胰腺腺泡细胞酶蛋白合成与对照组相比无明显改变，并且合成的高峰期均在90min这一时点，这与以往的文献报道一致[3]，进一步证实了Koike等[4]ANP时胰腺腺泡细胞酶蛋白合成功能无改变的观点。而在120、150min时模型组显著高于对照组，结合放射自显影照片分析主要是因为ANP时胰腺腺泡细胞出现了底膜及侧膜的异位分泌，导致大量酶原颗粒积聚于细胞间质，潴留于胰腺组织内之故。
我们在研究中发现：ANP模型组酶原颗粒除了分布于细胞内以外，细胞间质中也观察到多个酶原颗粒的积聚。这可能是由于ANP时胰腺腺泡细胞膜的结构发生了改变，导致除正常途径的顶膜向胰管内分泌外，还出现了底膜及侧膜向间质的异位分泌，进一步证实了Castillo[5]及Sheele[6]等的推测。由于细胞内外环境的不同，积聚于细胞间质的酶原颗粒中的酶原很可能被激活，从而对细胞间质及腺泡细胞本身造成损害，使ANP进一步恶化。
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我们体会呈点状出血坏死的ANP，其胰腺腺泡细胞摄取氨基酸、合成酶蛋白的能力无改变，而腺泡细胞分泌途径发生了改变，出现了除了顶膜向胰管内的正常途径分泌以外，还存在底膜及侧膜向间质的异位分泌，早期采用抑制腺泡细胞分泌的措施，如禁食、胃肠减压及药物如奥曲肽治疗ANP应该有一定效果。这些措施的综合应用在临床实践中确实也取得了令人满意的结果。
作者单位：余枭(上海第二医科大学附属瑞金医院外科 200025)
张圣道(上海第二医科大学附属瑞金医院外科 200025)
韩天权(上海第二医科大学附属瑞金医院外科 200025)
汤耀卿(上海第二医科大学附属瑞金医院外科 200025)
雷若庆(上海第二医科大学附属瑞金医院外科 200025)
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陈胜(上海第二医科大学附属瑞金医院外科 200025)
王建承(上海第二医科大学附属瑞金医院外科 200025)
姜志宏(上海第二医科大学附属瑞金医院外科 200025)
夏宗勤(上海第二医科大学核医学实验室)
蒋建强(上海医药工业研究院)
参考文献
[1]David WR， Warshaw AL. Acute pancreatitis.In: Morris PJ and RA Malt.Oxford textbook of surgery (Vol 1). New York: Raven,1993.275-300.
, 百拇医药
[2]Lankisch PG,Ihse I. Bile-induced acute experimental pancreatitis,Scand J Gastroenterol，1987，22:257-260.
[3]Saluja A, Saito I,Saluja M,et al.In vivo rat pancreatic acinar cell function during supramaximal stimulation with caerulein.Am J Physiol, 1985,249: G709-710.
[4]Koike H, Steer ML， Meldolesi J. Pancreatic effects of ethionine：blockade of exocytosis and appearance of crinophagy and autophagy precede cellular necrosis.Am J Physiol，1982,242：G297-307.
, 百拇医药
[5]Castillo CF, Schmidt J, Warshaw AL， et al.Interstitial protease activation is the central event in progression to necrotizing pancreatitis. Surgery，1994,116：497-504.
[6]Scheele G, Alter G，Kern H. Exocytosis occurs at the lateral plasma membrane of the pancreatic acinar cell during supramaximal secretagogue stimulation.Gastroenterology,1987, 92:345-353., http://www.100md.com