治疗黄褐斑的中药复方对酪氨酸酶活性的影响
治疗黄褐斑的中药复方对酪氨酸酶活性的影响
李洪武 朱文元
摘要 目的：研究中药对酪氨酸酶活性的影响，筛选有治疗作用的中药方剂，为应用中药治疗色素障碍性皮肤病提供实验依据。方法：通过计算机排序选定5个应用频次较高的治疗黄褐斑的复方中药，采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法体外测定酪氨酸酶活性。结果：治疗黄褐斑中药复方中六味地黄丸、补中益气汤组酪氨酸酶活性降低(水提物P<0.05，醇提物P>0.05)，逍遥丸、桃红四物汤增高(P<0.01)，金匮肾气丸降低(P>0.05)。六味地黄丸组方中药水提物熟地黄、牡丹皮组酪氨酸酶活性增高，茯苓、山药、山茱萸降低；醇提物中牡丹皮、泽泻增高，茯苓、山药、山茱萸降低。结论：六味地黄丸、补中益气汤使酪氨酸酶活性降低(水提物)；六味地黄丸组方中药熟地黄、牡丹皮使酪氨酸酶活性增高，茯苓、山药、山茱萸使酪氨酸酶活性降低，泽泻组醇提物增高，水提物降低。
, 百拇医药
关键词：黑变病 复方(中药) 一元酚单氧酶
黄褐斑是一种常见的色素障碍性皮肤病，目前无十分有效的治疗方法。酪氨酸酶(TYR)是皮肤黑素生物合成的主要限速酶，控制其活力即可控制黑素生成量[1,2]。为了研究中药对酪氨酸酶活性的作用，我们选择100册古籍专著和50种中医药杂志近30年文献，电脑统计选定古方中治疗黄褐斑应用频次较高的复方中药制剂5首[3]，采用多巴速率氧化法，分别测定其水提物、醇提物对酪氨酸酶活性的影响。
材料和方法
(一)仪器：722光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂生产)。
(二)试剂：蘑菇酪氨酸酶(tyrosinase.EC.1,14,18,1)，DL-多巴(DL-β-3,4-dopa)，上述2种试剂均购自美国Sigma公司)，其它试剂均为分析纯。
, 百拇医药
(三)药物：
1.药物来源：治疗黄褐斑复方中药六味地黄丸、逍遥丸、金匮肾气丸、桃红四物汤、补中益气汤由南京中医药大学中药门诊部提供，经南京中医药大学中药鉴定教研室王春根教授鉴定，符合中华人民共和国药典规定。
2.方药组成：六味地黄丸：熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻。逍遥丸：柴胡、当归、白芍、白术、茯苓、甘草、薄荷。桃红四物汤：当归、川芎、赤芍、生地黄、桃仁、红花。金匮肾气丸：熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻、附子、桂枝。补中益气汤：黄芪、炙甘草、人参、当归、陈皮、升麻、柴胡、白术。
3.中药制备方法：⑴醇提物：中药粉碎后用90%乙醇溶液浸泡，3h后回流过滤，再将残渣提取2次，合并提取液，置沸水浴中挥尽乙醇浓缩至膏稠状，然后溶于含2%二甲基亚砜(DMSO)0.05mol/LpH6.5磷酸缓冲液中，制成每毫升相当于0.1g原生药的溶液。⑵水提物：取中药置玻璃烧杯内，加相当于药材量5～7倍的蒸馏水浸泡1～2h，煮沸30min，过滤。药渣加3～5倍量水继续煎煮，煮沸20min，过滤。合并2次滤液，于水浴上浓缩成每毫升相当于原药材0.1g的药液。若处方中有需先煎、后下、包煎、另煎和烊化等药材，则按常规处理。
, 百拇医药
(四)实验方法：
1.酪氨酸酶活性测定方法：采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法检测酪氨酸酶活性。反应混合物2mL：0.1mol/LpH6.5PBS1.9mL+药物0.1mL(质量浓度0.1g/mL)。37℃孵育10min，加0.15%DL-多巴1mL，2、3、4、5、6min时，用分光光度计测定吸光度(A475)值，以每分钟A475增加0.001定为1个酶活力单位。醇提物用DMSO助溶。以PBS液为空白，水提物以不加药物的反应组为对照，醇提物以不加药物含2%DMSO的反应组为对照，分别测定酪氨酸酶活性。
2.统计方法：配对t检验。用Office97ExcelforWindows98软件作数据处理及分析。
结果
(一)治疗黄褐斑复方中药对酪氨酸酶活性的影响：治疗黄褐斑复方中药中六味地黄丸、补中益气汤组酪氨酸酶活性降低(水提物P<0.05，醇提物0.05)，逍遥丸、桃红四物汤增高(P<0.01)，金匮肾气丸水提物降低，醇提物增高，但无统计学意义(P>0.05)，结果见表1。
, 百拇医药
(二)六味地黄丸组方中药对酪氨酸酶活性的影响：六味地黄丸组方中药水提物中熟地黄、牡丹皮组酪氨酸酶活性增高，茯苓、山药、山茱萸降低；醇提物中牡丹皮、泽泻增高，茯苓、山药、山茱萸降低。结果见表2。
表1 黄褐斑复方中药对酪氨酸酶活性(x±s，A值)的影响
组 别
水 提 物
醇 提 物
对照组
0.1676±0.0688
0.1438±0.0497
六味地黄丸
0.1082±0.0139**
, 百拇医药
0.1356±0.0163
逍遥丸
0.5878±0.1659*
0.2376±0.0482*
桃红四物汤
0.7982±0.0879*
0.5684±0.1514*
金匮肾气丸
0.1348±0.0156
0.1530±0.0310
, 百拇医药
补中益气汤
0.1014±0.0194**
0.0990±0.0237
注：与对照组相比*P<0.01,**P< 0.05
表2六味地黄丸组方中药对酪氨酸酶活性的影响
组 别
水提物(x±s，A值)
醇提物(x±s，A值)
对照组
0.1676±0.0688
0.1438±0.0497
, 百拇医药
熟地黄
0.4372±0.0107*
0.1304±0.0109
牡丹皮
0.7782±0.0444*
0.8476±0.0814*
山茱萸
0.1060±0.0201**
0.0732±0.0059*
山 药
, 百拇医药
0.1052±0.0164**
0.0518±0.0071*
泽 泻
0.1234±0.0116
0.3766±0.0163*
茯 苓
0.0652±0.0091*
0.0272±0.0088*
注：与对照组相比*P<0.01,**P<0.05
讨论
, 百拇医药
我们选取在治疗黄褐斑中使用频次较高的5个复方中药，测定其对酪氨酸酶活性的影响。结果显示六味地黄丸、补中益气汤水提物对酪氨酸酶有明显抑制作用。逍遥丸、桃红四物汤有显著激活作用。金匮肾气丸酪氨酸酶活性水提物降低、醇提物增高(P>0.05)。
逍遥丸、桃红四物汤为中医治疗黄褐斑主要复方,但研究中发现酪氨酸酶活性不降反升,雷铁池等[4]亦报道其组方中赤芍、川芎、桃仁等使酪氨酸酶活性增高，因此不能单纯用生化学、酶学改变来解释其治疗机制。逍遥丸疏肝解郁、健脾和中，桃红四物汤养血活血、逐瘀调经，临床应用治疗气滞血瘀型有效，推测其治疗机制可能通过其它途径发挥作用[5]。六味地黄丸滋肾阴、补肝血、益脾阴，延缓衰老，为历代医家所推崇[5]。我们的研究结果显示，六味地黄丸可使酪氨酸酶活性显著降低，治疗黄褐斑疗效满意[6]，其组方中药熟地黄、牡丹皮使酪氨酸酶活性增高，茯苓、山药、山茱萸使酪氨酸酶活性降低。从中医组方原则来看，熟地黄滋培阴血于下；山茱萸涩肝肾之精，山药补黄庭之气；牡丹皮散不归经之血，茯苓守五脏之气，泽泻通膀胱之气化，泻上炎之虚火，渗下趋之湿浊，洵为资生之至宝固本之神丹也。但从对酪氨酸酶作用来看，有其不尽合理之处。许爱娥等[7]报道牡丹皮使酪氨酸酶活性增高，茯苓使酪氨酸酶活性降低，与我们的研究结果一致。张美华等[8]报道白藓皮、白术、白芷、猪苓、白蔹、苍术等使酪氨酸降低。其中白术健脾、白藓皮清热、苍术滋阴、白芷活血与熟地黄滋阴健脾、牡丹皮清热凉血有同等中药功效。组方中如选择均能降低酪氨酸酶活性且能发挥协同作用的中药如用白术、白藓皮或苍术、白芷等替代牡丹皮、熟地黄组成新的复方，用于黄褐斑治疗，可能会提高疗效，也是开发和应用中药治疗色素障碍性皮肤病的一个方向。
, http://www.100md.com
国家自然科学基金资助课题(39570658)
作者单位：李洪武(210029 南京医科大学第一附属医院皮肤科)
朱文元(210029 南京医科大学第一附属医院皮肤科)
参考文献
1，尚靖，敖秉臣，刘文丽，等.七种增白中药在体外对酪氨酸酶的影响.中国药学杂志，1995,30：653-655.
2，Kubo I,Yokokawa Y,Kinst-Hori I.Tyrosinase inhibitors from Bolivian medicinal plants.J Nat Prod,1995,58:739-743.
, 百拇医药 3，李洪武，赵健，朱文元.部分复方中药对酪氨酸酶活性影响的实验研究.江苏中医，1999，20：46-47.
4，雷铁池，朱文元，夏明玉，等.89味中药乙醇提取物对酪氨酸酶活性的上调作用.临床皮肤科杂志，1999,28:147-149.
5，张素洁.中医辩证治疗黄褐斑与血液流变学关系的研究与分析.中国中医基础医学杂志,1998，4：35-37.
6，吴锦法，卢泰坤.六味地黄丸加味治疗黄褐斑的体会.中国医药学报，1994，9：58.
7，许爱娥，王遂泉，周渭珩.常用中药对酪氨酸酶的激活作用.中华皮肤科杂志，1998，31：48.
8，张美华，朱文元.48种中药水煎剂对体外培养鼠黑素瘤细胞黑素形成影响的研究.江苏中医，1999,20：44-45., 百拇医药
李洪武 朱文元
摘要 目的：研究中药对酪氨酸酶活性的影响，筛选有治疗作用的中药方剂，为应用中药治疗色素障碍性皮肤病提供实验依据。方法：通过计算机排序选定5个应用频次较高的治疗黄褐斑的复方中药，采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法体外测定酪氨酸酶活性。结果：治疗黄褐斑中药复方中六味地黄丸、补中益气汤组酪氨酸酶活性降低(水提物P<0.05，醇提物P>0.05)，逍遥丸、桃红四物汤增高(P<0.01)，金匮肾气丸降低(P>0.05)。六味地黄丸组方中药水提物熟地黄、牡丹皮组酪氨酸酶活性增高，茯苓、山药、山茱萸降低；醇提物中牡丹皮、泽泻增高，茯苓、山药、山茱萸降低。结论：六味地黄丸、补中益气汤使酪氨酸酶活性降低(水提物)；六味地黄丸组方中药熟地黄、牡丹皮使酪氨酸酶活性增高，茯苓、山药、山茱萸使酪氨酸酶活性降低，泽泻组醇提物增高，水提物降低。
, 百拇医药
关键词：黑变病 复方(中药) 一元酚单氧酶
黄褐斑是一种常见的色素障碍性皮肤病，目前无十分有效的治疗方法。酪氨酸酶(TYR)是皮肤黑素生物合成的主要限速酶，控制其活力即可控制黑素生成量[1,2]。为了研究中药对酪氨酸酶活性的作用，我们选择100册古籍专著和50种中医药杂志近30年文献，电脑统计选定古方中治疗黄褐斑应用频次较高的复方中药制剂5首[3]，采用多巴速率氧化法，分别测定其水提物、醇提物对酪氨酸酶活性的影响。
材料和方法
(一)仪器：722光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂生产)。
(二)试剂：蘑菇酪氨酸酶(tyrosinase.EC.1,14,18,1)，DL-多巴(DL-β-3,4-dopa)，上述2种试剂均购自美国Sigma公司)，其它试剂均为分析纯。
, 百拇医药
(三)药物：
1.药物来源：治疗黄褐斑复方中药六味地黄丸、逍遥丸、金匮肾气丸、桃红四物汤、补中益气汤由南京中医药大学中药门诊部提供，经南京中医药大学中药鉴定教研室王春根教授鉴定，符合中华人民共和国药典规定。
2.方药组成：六味地黄丸：熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻。逍遥丸：柴胡、当归、白芍、白术、茯苓、甘草、薄荷。桃红四物汤：当归、川芎、赤芍、生地黄、桃仁、红花。金匮肾气丸：熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻、附子、桂枝。补中益气汤：黄芪、炙甘草、人参、当归、陈皮、升麻、柴胡、白术。
3.中药制备方法：⑴醇提物：中药粉碎后用90%乙醇溶液浸泡，3h后回流过滤，再将残渣提取2次，合并提取液，置沸水浴中挥尽乙醇浓缩至膏稠状，然后溶于含2%二甲基亚砜(DMSO)0.05mol/LpH6.5磷酸缓冲液中，制成每毫升相当于0.1g原生药的溶液。⑵水提物：取中药置玻璃烧杯内，加相当于药材量5～7倍的蒸馏水浸泡1～2h，煮沸30min，过滤。药渣加3～5倍量水继续煎煮，煮沸20min，过滤。合并2次滤液，于水浴上浓缩成每毫升相当于原药材0.1g的药液。若处方中有需先煎、后下、包煎、另煎和烊化等药材，则按常规处理。
, 百拇医药
(四)实验方法：
1.酪氨酸酶活性测定方法：采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法检测酪氨酸酶活性。反应混合物2mL：0.1mol/LpH6.5PBS1.9mL+药物0.1mL(质量浓度0.1g/mL)。37℃孵育10min，加0.15%DL-多巴1mL，2、3、4、5、6min时，用分光光度计测定吸光度(A475)值，以每分钟A475增加0.001定为1个酶活力单位。醇提物用DMSO助溶。以PBS液为空白，水提物以不加药物的反应组为对照，醇提物以不加药物含2%DMSO的反应组为对照，分别测定酪氨酸酶活性。
2.统计方法：配对t检验。用Office97ExcelforWindows98软件作数据处理及分析。
结果
(一)治疗黄褐斑复方中药对酪氨酸酶活性的影响：治疗黄褐斑复方中药中六味地黄丸、补中益气汤组酪氨酸酶活性降低(水提物P<0.05，醇提物0.05)，逍遥丸、桃红四物汤增高(P<0.01)，金匮肾气丸水提物降低，醇提物增高，但无统计学意义(P>0.05)，结果见表1。
, 百拇医药
(二)六味地黄丸组方中药对酪氨酸酶活性的影响：六味地黄丸组方中药水提物中熟地黄、牡丹皮组酪氨酸酶活性增高，茯苓、山药、山茱萸降低；醇提物中牡丹皮、泽泻增高，茯苓、山药、山茱萸降低。结果见表2。
表1 黄褐斑复方中药对酪氨酸酶活性(x±s，A值)的影响
组 别
水 提 物
醇 提 物
对照组
0.1676±0.0688
0.1438±0.0497
六味地黄丸
0.1082±0.0139**
, 百拇医药
0.1356±0.0163
逍遥丸
0.5878±0.1659*
0.2376±0.0482*
桃红四物汤
0.7982±0.0879*
0.5684±0.1514*
金匮肾气丸
0.1348±0.0156
0.1530±0.0310
, 百拇医药
补中益气汤
0.1014±0.0194**
0.0990±0.0237
注：与对照组相比*P<0.01,**P< 0.05
表2六味地黄丸组方中药对酪氨酸酶活性的影响
组 别
水提物(x±s，A值)
醇提物(x±s，A值)
对照组
0.1676±0.0688
0.1438±0.0497
, 百拇医药
熟地黄
0.4372±0.0107*
0.1304±0.0109
牡丹皮
0.7782±0.0444*
0.8476±0.0814*
山茱萸
0.1060±0.0201**
0.0732±0.0059*
山 药
, 百拇医药
0.1052±0.0164**
0.0518±0.0071*
泽 泻
0.1234±0.0116
0.3766±0.0163*
茯 苓
0.0652±0.0091*
0.0272±0.0088*
注：与对照组相比*P<0.01,**P<0.05
讨论
, 百拇医药
我们选取在治疗黄褐斑中使用频次较高的5个复方中药，测定其对酪氨酸酶活性的影响。结果显示六味地黄丸、补中益气汤水提物对酪氨酸酶有明显抑制作用。逍遥丸、桃红四物汤有显著激活作用。金匮肾气丸酪氨酸酶活性水提物降低、醇提物增高(P>0.05)。
逍遥丸、桃红四物汤为中医治疗黄褐斑主要复方,但研究中发现酪氨酸酶活性不降反升,雷铁池等[4]亦报道其组方中赤芍、川芎、桃仁等使酪氨酸酶活性增高，因此不能单纯用生化学、酶学改变来解释其治疗机制。逍遥丸疏肝解郁、健脾和中，桃红四物汤养血活血、逐瘀调经，临床应用治疗气滞血瘀型有效，推测其治疗机制可能通过其它途径发挥作用[5]。六味地黄丸滋肾阴、补肝血、益脾阴，延缓衰老，为历代医家所推崇[5]。我们的研究结果显示，六味地黄丸可使酪氨酸酶活性显著降低，治疗黄褐斑疗效满意[6]，其组方中药熟地黄、牡丹皮使酪氨酸酶活性增高，茯苓、山药、山茱萸使酪氨酸酶活性降低。从中医组方原则来看，熟地黄滋培阴血于下；山茱萸涩肝肾之精，山药补黄庭之气；牡丹皮散不归经之血，茯苓守五脏之气，泽泻通膀胱之气化，泻上炎之虚火，渗下趋之湿浊，洵为资生之至宝固本之神丹也。但从对酪氨酸酶作用来看，有其不尽合理之处。许爱娥等[7]报道牡丹皮使酪氨酸酶活性增高，茯苓使酪氨酸酶活性降低，与我们的研究结果一致。张美华等[8]报道白藓皮、白术、白芷、猪苓、白蔹、苍术等使酪氨酸降低。其中白术健脾、白藓皮清热、苍术滋阴、白芷活血与熟地黄滋阴健脾、牡丹皮清热凉血有同等中药功效。组方中如选择均能降低酪氨酸酶活性且能发挥协同作用的中药如用白术、白藓皮或苍术、白芷等替代牡丹皮、熟地黄组成新的复方，用于黄褐斑治疗，可能会提高疗效，也是开发和应用中药治疗色素障碍性皮肤病的一个方向。
, http://www.100md.com
国家自然科学基金资助课题(39570658)
作者单位：李洪武(210029 南京医科大学第一附属医院皮肤科)
朱文元(210029 南京医科大学第一附属医院皮肤科)
参考文献
1，尚靖，敖秉臣，刘文丽，等.七种增白中药在体外对酪氨酸酶的影响.中国药学杂志，1995,30：653-655.
2，Kubo I,Yokokawa Y,Kinst-Hori I.Tyrosinase inhibitors from Bolivian medicinal plants.J Nat Prod,1995,58:739-743.
, 百拇医药 3，李洪武，赵健，朱文元.部分复方中药对酪氨酸酶活性影响的实验研究.江苏中医，1999，20：46-47.
4，雷铁池，朱文元，夏明玉，等.89味中药乙醇提取物对酪氨酸酶活性的上调作用.临床皮肤科杂志，1999,28:147-149.
5，张素洁.中医辩证治疗黄褐斑与血液流变学关系的研究与分析.中国中医基础医学杂志,1998，4：35-37.
6，吴锦法，卢泰坤.六味地黄丸加味治疗黄褐斑的体会.中国医药学报，1994，9：58.
7，许爱娥，王遂泉，周渭珩.常用中药对酪氨酸酶的激活作用.中华皮肤科杂志，1998，31：48.
8，张美华，朱文元.48种中药水煎剂对体外培养鼠黑素瘤细胞黑素形成影响的研究.江苏中医，1999,20：44-45., 百拇医药