高低不同转移特性人骨肉瘤克隆细胞株的建立
高低不同转移特性人骨肉瘤克隆细胞株的建立
师长宏 施新猷 李六金 朱德生
摘 要:目的 建立高低不同转移特性的人骨肉瘤克隆细胞株. 方法 通过克隆技术和细胞电泳,从我们建立的骨肉瘤细胞系LTH-OS(简称S)中获得两株细胞S1和S2，测定两种细胞的增殖率，利用软琼脂克隆形成率和裸鼠体内成瘤实验，比较细胞的转移特性. 结果 S1的细胞电泳率高达1.0，S2最低为0.70，S1的群体倍增时间为30.8 h，S2为45.0 h. 克隆形成率分别为5.2%和2.1%，裸鼠右后肢皮下接种S1和S2发现S1成瘤快，且瘤体大，原位接种时S1出现广泛的肺转移. 结论 S1和S2是从S母细胞中分离出的具有不同转移特性的细胞株.
, 百拇医药
关键词：成骨肉瘤细胞；转移；克隆
0 引言
骨肉瘤是青少年常见的原发性恶性肿瘤，因其易发生转移及局部的浸润生长而难以彻底根治. 尽管采取了广泛切除及综合治疗措施，仍有40%～50%的患者发生肺转移，并成为死亡的主要原因[1]. 目前对于成骨肉瘤转移机制及特点的研究不多，原因是尚未建立合适的高转移细胞株和动物模型. 本研究采用我们建立的成骨肉瘤细胞系，通过克隆技术和体内移植，建立了高转移和低转移的动物模型.
1 材料和方法
1.1 实验动物 BALB/c-nu/nu裸鼠，由中国生物药品鉴定所提供，鼠龄为3～5 wk，雌雄兼用，其实验和饲养均在SPF条件下的超净层流架中进行，灭菌处理的水和饲料供动物自由饮用.
1.2 主要试剂 培养基：RPMI-1640(Gicbo)，胎牛血清(FBS)(浙江金华生物制剂厂生产)，胰酶(Sigma公司)，HEPES(Gibco).
, http://www.100md.com
1.3 成骨肉瘤细胞 本实验室建立的骨肉瘤细胞系 LTH-OS[2].
1.4 克隆筛选 采用有限稀释法，将培养20代的LTH-OS细胞在96孔板中稀释成每孔含0.5～1个细胞，克隆化后4～5 d选出仅含有单细胞生长的孔，待细胞增殖近孔面积1/3时，将细胞移至24孔板中扩大培养.
1.5 细胞电泳率测定 按文献[3],经过96孔板筛选后，得到10株克隆细胞，进行细胞电泳率测定，每株细胞取样3次，每次测定10个细胞，从中得到最高和最低2株，分别命名为S1和S2.
1.6 细胞增殖率测定 按文献[4],用24孔板，培养计数法测定细胞增殖情况，接种细胞数为104/孔，连续计数8 d，计算细胞群体倍增时间.
1.7 克隆形成测定 采用软琼脂克隆法，取37℃保温的不同密度的细胞悬液9.4 mL移入小烧杯中，加入50℃ 5 g.L-1琼脂0.6 mL，迅速混匀(即配成5 g.L-1)，立即浇入铺有底层琼脂(浓度为3 g.L-1)的24孔培养板中，每孔加0.8 mL，置室温使琼脂凝固. 每孔细胞数为102，接种14 d后，计算克隆数. 每个集落细胞数≥50时为1个克隆.
, 百拇医药
1.8 裸鼠皮下成瘤实验 收集对数生长期的S1，S2细胞，用0.2 g.L-1 EDTA-1.25 g.L-1胰酶消化，计数，裸鼠右后肢皮下接种,每组3只，每只0.2 mL含106个细胞，观察裸鼠的生活状况及局部肿瘤生长情况. 4 wk后，取裸鼠皮下移植瘤修成1 mm3小块.
1.9 裸鼠原位移植模型的建立 将裸鼠全麻(20 g.L-1的戊巴比妥钠溶液ip 40 mg.kg-1)，在超净工作台中，取其右后肢膝下正中纵切口，剥离骨膜及胫前肌显露胫骨上端，在胫骨上端外侧骨皮质纵形开槽，约3 mm(长)×1 mm(宽)深达髓腔. 在骨槽中植入2粒1 mm3修剪好的移植瘤组织块，S1和S2各3只裸鼠，缝合肌肉、筋膜和皮肤. 左侧同法操作而不植入瘤块. 8 wk后处死裸鼠，取肺脏福尔马林固定，常规制备光镜标本，HE染色.
, 百拇医药
2 结果
2.1 细胞克隆化结果 从母系细胞中分出10株由单个细胞繁殖的克隆化细胞株，生成旺盛，并连续传代，其中电泳率最高的是S1=1.0 μm. cm.V.S,电泳率最低的是S2=0.70 μm. cm.V.S.
2.2 克隆形成率和细胞增殖特征 S1细胞形成的克隆不仅数量多，而且在形态上显示为团块状；而S2细胞形成的克隆均为单层片状，克隆形成率低(Tab 1). S1和S2细胞培养48 h内增殖速度较慢，继而细胞数量迅速上升，第7日达高峰，在对数生长期，S2细胞群体倍增时间分别为30.8 h和45.0 h.
表 1 各种细胞的克隆形成率
Tab 1 Clonogensis of the cells
, 百拇医药
Cell type
Range of the clones in
individual cells
Cloning efficiency
(%)
S
28～46
3.6
S1
100～150
5.2
S2
, 百拇医药
19～26
2.1
2.3 裸鼠皮下成瘤实验 裸鼠右后肢皮下接种后，S1第5日就成瘤，15 d时测瘤径为0.69×0.55 cm，S2细胞10 d才成瘤，15 d时瘤径为0.19×0.77 cm，4 wk时处死裸鼠，解剖发现两株细胞均不发生转移.
2.4 裸鼠原位移植模型 S2原位移植，肿瘤为分叶结节状，质地较软，有一定的活动度，呈进行性生长. 肿瘤周围血供丰富，瘤组织与皮肤无粘连. 裸鼠于第8周未见明显消瘦，肺脏中无肉眼可见的瘤转移灶，S1原位移植模型的肿瘤亦为结节状分叶，进行性生长，皮肤表面有扩张的血管. 裸鼠于第5周开始有消瘦表现，第8周明显消瘦，有一直径约2 mm肺内转移灶呈实性结构，位于肺实质内，瘤细胞分布密集而杂乱，间质成分比原发瘤组织少，细胞大小不等，有异型，核仁1～4个，核分裂相多见，可见多核及单核瘤巨细胞，细胞形态与培养的骨肉瘤细胞系基本相似(Fig 1).
, 百拇医药
图 1 肺转移灶癌组织形态
Fig 1 Morphology of lung carcinoma metastatic focus
3 讨论
在同一肿瘤内，含有生物学特性和转移行为不完全相同的各种细胞亚群，而其中具有转移能力的细胞只占极少部分，这就是肿瘤的异质性[5]. 能否转移，在很大程度上取决于其能否转变成优势细胞，因此分离出这些细胞，建立不同转移潜能的动物模型，比较它们的生物学特性差别，对于探讨肿瘤转移机制，指导临床治疗具有重要的现实意义.
癌细胞在宿主体内表达侵袭能力，不但需要合适的微环境，而且还依赖瘤细胞之间，瘤细胞与间质之间、瘤细胞与宿主之间的相互作用. 因此，组织学完整的瘤组织原位移植是较理想的移植技术. Furukawa[6]等研究发现应用细胞悬液进行原位移植在转移能力方面不如完整组织块移植，主要是因为移植所用细胞系均经酶解处理，肿瘤的原有细胞结构被破坏，可能导致肿瘤生物学行为和自然属性改变，结果影响人类肿瘤细胞的移植生长与转移，我们利用自己建立的人骨肉瘤细胞系S1和S2裸鼠移植组织作为细胞来源，可能是一种较好的方法.
, 百拇医药
我们通过体外克隆和裸鼠体内移植的方法，从母系细胞中分出两株高低不同转移特性的克隆细胞. S1和S2相比，细胞增殖率短，在软琼脂内克隆形成率高，S1和S2皮下接种易形成包膜，难以向结缔组织浸润和其他器官转移，与人体实际有一定差距，但S1比S2皮下成瘤快，且瘤体大，原位接种时，S2仅局部膨胀性生长，无浸润，未形成肺部等远处器官转移，S1呈明显的浸润性生长，其外周无纤维包膜，易发生广泛的肺转移，表现出恶性肿瘤的特性.
现已知道细胞电泳是研究细胞表面电荷的重要手段，细胞癌变后，细胞表面发生了一系列变化，使细胞表面电荷密度增加，相互间排斥力增大，一般认为侵袭力强和转移率高的细胞，其细胞电泳率也增高[7]，有人从自建的小鼠前胃腺癌细胞系(MFC)中分离出许多克隆株，发现细胞电泳率越高，其转移程度也越高，本实验从同一肿瘤中分出多个克隆，其中S1比S2高出近40%，说明两种细胞之间转移率可能存在着很大差异，通过裸鼠体内原位移植，提示采用细胞电泳的方法作为不同转移特性肿瘤细胞筛选途径，是可行的.
, 百拇医药
本研究得到的两株细胞，具有高低不同的转移特性，以此为基础，我们将可能对两种细胞的粘附力及其对细胞外基质的降解力，以及基因结构和表达方面进行对比研究，特别是对于肿瘤转移机制的研究有重要意义，通过差异PCR，有可能发现新的转移基因.
基金项目:军队“九五”医药卫生课题 (98M107)
作者简介:师长宏(1973-),男(汉族)，陕西省眉县人. 硕士，助理实验师. Tel.(029)3373229 Email.changhong@fmmu.edu.cn
师长宏(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
施新猷(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
李六金(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
, http://www.100md.com
朱德生(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
参考文献:
[1] Onde M,Maeruda S,Higaki S et al. ErbB-2 expression is correlated with poor prognosis for patience with osteosarcoma[J]. Cancer,1996;77(1):71-75.
[2] 师长宏，施 阳，施新猷et al. 两株成人骨肉瘤克隆细胞株的建立及其生物学特性[J]. 上海实验动物科学, 1999; 19(3):146-148.
[3] 黄愚平，杨抚华. 纤连蛋白对人舌癌T细胞分化的影响[J]. 华西医科大学学报，1994；25(4)：426-430.
, 百拇医药
[4] 司徒镇强，吴军正. 细胞培养[M]. 西安：世界图书出版公司[M]，1996：173-196.
[5] Young SD,Hill RP. Dynamic heterogeneity isolation of murine tumor cell populations enriched for metastatic variants and guantification of the unstable expression of the phenotype[J]. Clin Exp Metastasis, 1989;7(4):153-157.
[6] Furukawa T, Fu X, Kubota T et al. Nude mouse metastatic model of human stomach cancer constructed using orthotopic implantation of histologically intacter tissue[J]. Cancer Res, 1993;53(6):1204-1208
[7] 郁多男，高 进. 应用体外器官培养研究人鼻咽癌不同克隆细胞株的侵袭特性[J]. 中国医学科学院学报, 1994; 16(4):317-322., 百拇医药
师长宏 施新猷 李六金 朱德生
摘 要:目的 建立高低不同转移特性的人骨肉瘤克隆细胞株. 方法 通过克隆技术和细胞电泳,从我们建立的骨肉瘤细胞系LTH-OS(简称S)中获得两株细胞S1和S2，测定两种细胞的增殖率，利用软琼脂克隆形成率和裸鼠体内成瘤实验，比较细胞的转移特性. 结果 S1的细胞电泳率高达1.0，S2最低为0.70，S1的群体倍增时间为30.8 h，S2为45.0 h. 克隆形成率分别为5.2%和2.1%，裸鼠右后肢皮下接种S1和S2发现S1成瘤快，且瘤体大，原位接种时S1出现广泛的肺转移. 结论 S1和S2是从S母细胞中分离出的具有不同转移特性的细胞株.
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关键词：成骨肉瘤细胞；转移；克隆
0 引言
骨肉瘤是青少年常见的原发性恶性肿瘤，因其易发生转移及局部的浸润生长而难以彻底根治. 尽管采取了广泛切除及综合治疗措施，仍有40%～50%的患者发生肺转移，并成为死亡的主要原因[1]. 目前对于成骨肉瘤转移机制及特点的研究不多，原因是尚未建立合适的高转移细胞株和动物模型. 本研究采用我们建立的成骨肉瘤细胞系，通过克隆技术和体内移植，建立了高转移和低转移的动物模型.
1 材料和方法
1.1 实验动物 BALB/c-nu/nu裸鼠，由中国生物药品鉴定所提供，鼠龄为3～5 wk，雌雄兼用，其实验和饲养均在SPF条件下的超净层流架中进行，灭菌处理的水和饲料供动物自由饮用.
1.2 主要试剂 培养基：RPMI-1640(Gicbo)，胎牛血清(FBS)(浙江金华生物制剂厂生产)，胰酶(Sigma公司)，HEPES(Gibco).
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1.3 成骨肉瘤细胞 本实验室建立的骨肉瘤细胞系 LTH-OS[2].
1.4 克隆筛选 采用有限稀释法，将培养20代的LTH-OS细胞在96孔板中稀释成每孔含0.5～1个细胞，克隆化后4～5 d选出仅含有单细胞生长的孔，待细胞增殖近孔面积1/3时，将细胞移至24孔板中扩大培养.
1.5 细胞电泳率测定 按文献[3],经过96孔板筛选后，得到10株克隆细胞，进行细胞电泳率测定，每株细胞取样3次，每次测定10个细胞，从中得到最高和最低2株，分别命名为S1和S2.
1.6 细胞增殖率测定 按文献[4],用24孔板，培养计数法测定细胞增殖情况，接种细胞数为104/孔，连续计数8 d，计算细胞群体倍增时间.
1.7 克隆形成测定 采用软琼脂克隆法，取37℃保温的不同密度的细胞悬液9.4 mL移入小烧杯中，加入50℃ 5 g.L-1琼脂0.6 mL，迅速混匀(即配成5 g.L-1)，立即浇入铺有底层琼脂(浓度为3 g.L-1)的24孔培养板中，每孔加0.8 mL，置室温使琼脂凝固. 每孔细胞数为102，接种14 d后，计算克隆数. 每个集落细胞数≥50时为1个克隆.
, 百拇医药
1.8 裸鼠皮下成瘤实验 收集对数生长期的S1，S2细胞，用0.2 g.L-1 EDTA-1.25 g.L-1胰酶消化，计数，裸鼠右后肢皮下接种,每组3只，每只0.2 mL含106个细胞，观察裸鼠的生活状况及局部肿瘤生长情况. 4 wk后，取裸鼠皮下移植瘤修成1 mm3小块.
1.9 裸鼠原位移植模型的建立 将裸鼠全麻(20 g.L-1的戊巴比妥钠溶液ip 40 mg.kg-1)，在超净工作台中，取其右后肢膝下正中纵切口，剥离骨膜及胫前肌显露胫骨上端，在胫骨上端外侧骨皮质纵形开槽，约3 mm(长)×1 mm(宽)深达髓腔. 在骨槽中植入2粒1 mm3修剪好的移植瘤组织块，S1和S2各3只裸鼠，缝合肌肉、筋膜和皮肤. 左侧同法操作而不植入瘤块. 8 wk后处死裸鼠，取肺脏福尔马林固定，常规制备光镜标本，HE染色.
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2 结果
2.1 细胞克隆化结果 从母系细胞中分出10株由单个细胞繁殖的克隆化细胞株，生成旺盛，并连续传代，其中电泳率最高的是S1=1.0 μm. cm.V.S,电泳率最低的是S2=0.70 μm. cm.V.S.
2.2 克隆形成率和细胞增殖特征 S1细胞形成的克隆不仅数量多，而且在形态上显示为团块状；而S2细胞形成的克隆均为单层片状，克隆形成率低(Tab 1). S1和S2细胞培养48 h内增殖速度较慢，继而细胞数量迅速上升，第7日达高峰，在对数生长期，S2细胞群体倍增时间分别为30.8 h和45.0 h.
表 1 各种细胞的克隆形成率
Tab 1 Clonogensis of the cells
, 百拇医药
Cell type
Range of the clones in
individual cells
Cloning efficiency
(%)
S
28～46
3.6
S1
100～150
5.2
S2
, 百拇医药
19～26
2.1
2.3 裸鼠皮下成瘤实验 裸鼠右后肢皮下接种后，S1第5日就成瘤，15 d时测瘤径为0.69×0.55 cm，S2细胞10 d才成瘤，15 d时瘤径为0.19×0.77 cm，4 wk时处死裸鼠，解剖发现两株细胞均不发生转移.
2.4 裸鼠原位移植模型 S2原位移植，肿瘤为分叶结节状，质地较软，有一定的活动度，呈进行性生长. 肿瘤周围血供丰富，瘤组织与皮肤无粘连. 裸鼠于第8周未见明显消瘦，肺脏中无肉眼可见的瘤转移灶，S1原位移植模型的肿瘤亦为结节状分叶，进行性生长，皮肤表面有扩张的血管. 裸鼠于第5周开始有消瘦表现，第8周明显消瘦，有一直径约2 mm肺内转移灶呈实性结构，位于肺实质内，瘤细胞分布密集而杂乱，间质成分比原发瘤组织少，细胞大小不等，有异型，核仁1～4个，核分裂相多见，可见多核及单核瘤巨细胞，细胞形态与培养的骨肉瘤细胞系基本相似(Fig 1).
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图 1 肺转移灶癌组织形态
Fig 1 Morphology of lung carcinoma metastatic focus
3 讨论
在同一肿瘤内，含有生物学特性和转移行为不完全相同的各种细胞亚群，而其中具有转移能力的细胞只占极少部分，这就是肿瘤的异质性[5]. 能否转移，在很大程度上取决于其能否转变成优势细胞，因此分离出这些细胞，建立不同转移潜能的动物模型，比较它们的生物学特性差别，对于探讨肿瘤转移机制，指导临床治疗具有重要的现实意义.
癌细胞在宿主体内表达侵袭能力，不但需要合适的微环境，而且还依赖瘤细胞之间，瘤细胞与间质之间、瘤细胞与宿主之间的相互作用. 因此，组织学完整的瘤组织原位移植是较理想的移植技术. Furukawa[6]等研究发现应用细胞悬液进行原位移植在转移能力方面不如完整组织块移植，主要是因为移植所用细胞系均经酶解处理，肿瘤的原有细胞结构被破坏，可能导致肿瘤生物学行为和自然属性改变，结果影响人类肿瘤细胞的移植生长与转移，我们利用自己建立的人骨肉瘤细胞系S1和S2裸鼠移植组织作为细胞来源，可能是一种较好的方法.
, 百拇医药
我们通过体外克隆和裸鼠体内移植的方法，从母系细胞中分出两株高低不同转移特性的克隆细胞. S1和S2相比，细胞增殖率短，在软琼脂内克隆形成率高，S1和S2皮下接种易形成包膜，难以向结缔组织浸润和其他器官转移，与人体实际有一定差距，但S1比S2皮下成瘤快，且瘤体大，原位接种时，S2仅局部膨胀性生长，无浸润，未形成肺部等远处器官转移，S1呈明显的浸润性生长，其外周无纤维包膜，易发生广泛的肺转移，表现出恶性肿瘤的特性.
现已知道细胞电泳是研究细胞表面电荷的重要手段，细胞癌变后，细胞表面发生了一系列变化，使细胞表面电荷密度增加，相互间排斥力增大，一般认为侵袭力强和转移率高的细胞，其细胞电泳率也增高[7]，有人从自建的小鼠前胃腺癌细胞系(MFC)中分离出许多克隆株，发现细胞电泳率越高，其转移程度也越高，本实验从同一肿瘤中分出多个克隆，其中S1比S2高出近40%，说明两种细胞之间转移率可能存在着很大差异，通过裸鼠体内原位移植，提示采用细胞电泳的方法作为不同转移特性肿瘤细胞筛选途径，是可行的.
, 百拇医药
本研究得到的两株细胞，具有高低不同的转移特性，以此为基础，我们将可能对两种细胞的粘附力及其对细胞外基质的降解力，以及基因结构和表达方面进行对比研究，特别是对于肿瘤转移机制的研究有重要意义，通过差异PCR，有可能发现新的转移基因.
基金项目:军队“九五”医药卫生课题 (98M107)
作者简介:师长宏(1973-),男(汉族)，陕西省眉县人. 硕士，助理实验师. Tel.(029)3373229 Email.changhong@fmmu.edu.cn
师长宏(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
施新猷(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
李六金(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
, http://www.100md.com
朱德生(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
参考文献:
[1] Onde M,Maeruda S,Higaki S et al. ErbB-2 expression is correlated with poor prognosis for patience with osteosarcoma[J]. Cancer,1996;77(1):71-75.
[2] 师长宏，施 阳，施新猷et al. 两株成人骨肉瘤克隆细胞株的建立及其生物学特性[J]. 上海实验动物科学, 1999; 19(3):146-148.
[3] 黄愚平，杨抚华. 纤连蛋白对人舌癌T细胞分化的影响[J]. 华西医科大学学报，1994；25(4)：426-430.
, 百拇医药
[4] 司徒镇强，吴军正. 细胞培养[M]. 西安：世界图书出版公司[M]，1996：173-196.
[5] Young SD,Hill RP. Dynamic heterogeneity isolation of murine tumor cell populations enriched for metastatic variants and guantification of the unstable expression of the phenotype[J]. Clin Exp Metastasis, 1989;7(4):153-157.
[6] Furukawa T, Fu X, Kubota T et al. Nude mouse metastatic model of human stomach cancer constructed using orthotopic implantation of histologically intacter tissue[J]. Cancer Res, 1993;53(6):1204-1208
[7] 郁多男，高 进. 应用体外器官培养研究人鼻咽癌不同克隆细胞株的侵袭特性[J]. 中国医学科学院学报, 1994; 16(4):317-322., 百拇医药